Le mélanome malin est l’un des cancers les plus mortels dont l’incidence continue à augmenter chaque année avec peu de traitement efficace à long terme. Il est causé et initié principalement par l’exposition excessive aux rayons ultraviolets engendrant des photoproduits hautement génotoxiques. Il est bien connu que la cascade de signalisation PI3K/Akt joue un rôle crucial dans la régulation des processus qui sont généralement dérégulés durant le développement tumoral comme la prolifération, le contrôle du cycle cellulaire et l’apoptose. Néanmoins, l’implication de cette voie moléculaire dans la réponse aux dommages à l’ADN est peu caractérisée. Chez les mammifères, trois isoformes de la protéine kinase Akt ont été identifiées: Akt1, Akt2 et Akt3. Bien qu’elles soient très homologues en termes de séquence, plusieurs études ont montré que ces isoformes ont des fonctions biologiques distinctes, et nous suggérons qu’elles puissent contribuer différemment à la régulation de la réponse génotoxique. Les objectifs de ce projet étaient de: (i) évaluer l’activation d’Akt dans les cellules de mélanomes (ii) déterminer l’impact de l’inhibition de cette activité sur la régulation de la réponse cellulaire aux UV (iii) vérifier si la perte d’expression de l’un ou de l’autre des isoformes d’Akt peut réguler la réponse aux UV. Nous avons démontré qu’Akt est transitoirement hyperactivée par phosphorylation suite aux irradiations UV dans les lignées cellulaires de mélanomes. Afin de déterminer l'importance de cette activation dans la réponse cellulaire aux UV, notre approche était de diminuer (i) la phosphorylation d’Akt par l’usage d’inhibiteurs pharmacologiques ou (ii) l’expression de chaque isoforme d’Akt par l’approche des ARN interférents. Nous avons montré que l’inhibition de la phosphorylation d’Akt amène à l’augmentation du taux de l’apoptose induit par les UV d’une manière isoforme spécifique, alors qu’elle n’a aucun effet sur la régulation de la voie de réparation par excision de nucléotides (NER), qui est la seule voie humaine pour éliminer les dommages à l’ADN induits par les UV. En somme, notre étude constitue un nouvel aspect qui permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires du développement de mélanomes malins suites aux irradiations ultraviolettes. / Malignant melanoma is one of the deadliest cancers whose incidence continues to rise each year with a few effective long-term treatments. It is caused and initiated mainly by excessive exposure to ultraviolet radiation generating highly genotoxic DNA photoproducts. It is well known that the PI3K/Akt signaling cascade plays a crucial role in the regulation of processes commonly deregulated in tumor development such as proliferation, cell cycle control and apoptosis. Nevertheless, the nuclear involvement of this molecular pathway in the genotoxic response is poorly characterized. In mammals, three Akt kinase isoforms have been identified: Akt1, Akt2 and Akt3. Although these exhibit a high degree of homology, several studies have shown that they have distinct biological functions; therefore, we suggest that these isoforms may contribute differently to the regulation of genotoxic response. The objectives of this project were to: (i) evaluate Akt activation in UV-irradiated melanoma cells, (ii) determine the effect of the Akt phosphorylation inhibition on the regulation of the cellular response to UV, (iii) evaluate whether the loss of the expression of one or more of Akt isoforms can regulate the cellular response to UV. We demonstrated that Akt undergoes transient hyperactivation after UV treatment in melanoma cell lines. To determine the importance of this activation, our approach was to reduce (i) the phosphorylation of Akt by the use of pharmacological inhibitors or (ii) the expression of each individual Akt isoform using RNA interference. We have shown that inhibition of Akt phosphorylation leads to increased rates of UV-induced apoptosis in an isoform specific manner, while exerting no effect on regulation of nucleotide excision repair (NER), the only human pathway for eliminating UV-induced DNA damage. In summary, our study provides a better understanding of the molecular mechanisms of malignant melanoma development in response to UV.

La réparation par excision de nucléotides (NER) permet l'élimination des lésions provoquant une distorsion de la double hélice de l’ADN. Ces lésions sont induites par plusieurs agents environnementaux comme les rayons UV, ainsi que par certaines drogues chimio- thérapeutiques tel que le cisplatine. Des défauts dans la NER conduisent à de rares maladies autosomiques héréditaires : La xérodermie pigmentaire (XP), le syndrome de Cockayne (CS), le syndrome de sensibilité aux UVSS et la trichothiodystrophie (TTD). Ces maladies sont associées soit à une prédisposition élevée au cancer de la peau et / ou à de graves anomalies du développement neurologique. Le groupe de patients XP-A représente le deuxième groupe (XP) le plus fréquent, et possède la forme la plus sévère combinant cancer de la peau avec un haut risque de dégénérescence neurologique. À date, aucune explication n`a été proposée pour les symptômes neurologiques observés chez ces patients. Nous avions suggéré ainsi que la protéine XPA possède d`autres fonctions dans d`autres processus cellulaires, ceci en interagissant avec des partenaires protéiques différents de ceux déjà connus. Afin de confirmer cette hypothèse nous avions réalisé une étude protéomique à grande échelle en combinant la spectrométrie de masse à une immunoprécipitation en Tandem d`affinité (TAP), afin d`identifier de nouvelles protéines interagissant directement avec XPA. Nous avions montré que XPA peut interagir avec MRE11, la protéine clé de la réparation par recombinaison homologue. Des études additionnelles sont requises pour confirmer cette interaction et comprendre sa fonction / To maintain genome integrity and ensure the continuation of transcription, helix distorting DNA lesions induced by UV and other environmental mutagens are eliminated through a highly-versatile DNA repair pathway: nucleotide excision repair (NER). Mutations in 11 genes (XPC, XPE, XPB, XPD, XPG, XPA, XPG, TTD-A, CSA, CSB and UVSSA), among the 30 genes directly involved in NER, have been associated with the human genetic disorders: xeroderma pigmentosum (XP), cockayne syndrome (CS), trichothiodystrophy (TTD), and UV-sensitive syndrome (UVSS). Patients of these syndromes display a wide variety of clinical features that range from normal development with extreme predisposition to cancer, to neurodevelopmental defects associated with premature aging abnormalities. The connection between DNA damage and neurodegeneration remains unclear, i.e. cannot be explained by a DNA-repair deficiency alone, implying that various repair factors perform other functions beyond the repair process. XP-A is the second most common form of XP. XP-A cells have very low levels of NER activity and are sensitive to killing by UV light. It is one of the most severely affected XP groups, with the onset of cutaneous features, skin cancer, ocular features, and severe early onset neurological disease. Therefore we hypothesize that XPA interacts with cellular proteins that regulate its functions either in UV damage repair or in neurological development. To test this, our major aim was to carry out a large-scale proteomics investigation to identify novel interacting partners for XPA in the absence or presence of genotoxic stress, thus providing clues on the origins of neurodegeneration observed in many XP-A patients. We provide evidence that XPA can interact with MRE11, the key factor in repair of double strand breraks by homologous Recombination. Future experiments will be aimed at determining the impact of the XPA/MRE11 interaction functions in cells.

La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lésions qui déforment l’hélice d'ADN et qui bloquent à la fois la réplication et la transcription. Parmi ces lésions, il y a les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en évidence par l’existence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), causée par des mutations affectant des gènes impliqués dans cette voie de réparation. Les personnes atteintes sont caractérisées par une photosensibilité extrême et une forte prédisposition à développer des tumeurs cutanées (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment compétents en réparation, portent plutôt des mutations dans le gène codant pour l'ADN polymérase η (polη). Polη est une ADN polymérase translésionnelle capable de contourner avec une grande fidélité certaines lésions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymérases réplicatives. Ainsi, la polη prévient la formation de mutations et permet la reprise de la synthèse d'ADN. L'objectif principal de cette thèse est d'évaluer le rôle potentiel de voies de signalisation majeures dans la régulation de la NER, dont celles régulées par la kinase ATR (Ataxia Télangiectasia and Rad3-related kinase). Suite à l'irradiation UV, ATR est rapidement activée et phosphoryle des centaines de protéines qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et joue un rôle notoire dans le maintient de la stabilité génomique. Nous avons postulé qu’ATR puisse réguler la NER de manière dépendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothèse représente un grand défi car, pour des raisons techniques, les méthodes conventionnelles n’ont pas à ce jour été adaptées pour l'évaluation de la cinétique de réparation au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc développé une méthode novatrice basée sur la cytométrie en flux permettant de quantifier avec grande précision la cinétique de réparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle méthode, nous avons pu démontrer que l'inhibition d'ATR ou polη résulte en une très forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces études ont révélé, pour la première fois, une fonction critique pour ces protéines dans le retrait des lésions qui bloquent la réplication. En outre, nous avons démontré que la synthèse d'ADN est indispensable pour l’inhibition de la réparation en phase-S, reflétant un lien potentiel entre la NER et la réplication. Curieusement, nous avons également montré que parmi six lignées cellulaires tumorales choisies aléatoirement, trois présentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient être caractérisés par un tel défaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un déterminant majeur dans la réponse clinique aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses via l'induction de lésions à l’ADN. / Nucleotide excision repair (NER) is a critical pathway in humans for repairing highly genotoxic helix-distorting DNA lesions that strongly block both replication and transcription. Among these lesions are ultraviolet-induced 6-4 photoproducts (6-4PPs) and cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). The physiological importance of NER is highlighted by individuals afflicted with Xeroderma pigmentosum (XP), who carry mutations in NER pathway genes and as such exhibit extreme photosensitivity and remarkable predisposition to cutaneous tumorigenesis (1000-fold increase). On the other hand patients with the variant form of Xeroderma pigmentosum (XPV) are considered proficient in NER, and rather carry germline mutations in the gene encoding DNA polymerase η (polη). Polη is a specialized translesion DNA polymerase able to accurately bypass certain lesions including CPDs which otherwise completely inhibit the progression of normal replicative polymerases, thereby preventing mutations and allowing the resumption of DNA synthesis. The main goal of this thesis was to elucidate the potential role in NER of major DNA damage signalling cascades, including that regulated by the ataxia telangiectasia and rad 3-related kinase (ATR). Following UV irradiation, ATR is rapidly activated and phosphorylates hundreds of proteins that regulate cell cycle checkpoints and maintain genomic stability. We postulated that ATR might regulate NER in a cell cycle-specific manner. However testing this presented a great challenge, as (for technical reasons) traditional NER assays have to date not been adapted for evaluation of repair kinetics during individual phases of the cell cycle. We therefore developed a novel flow cytometry-based assay for sensitive quantification of 6-4PPs and CPDs repair efficiency during each of G0/G1, S, and G2/M. With this new assay, we were able to show that inhibition of either ATR or polη results in strong inhibition of NER capacity exclusively during S phase of the cell cycle. This revealed, for the first time, a critical function for these proteins in removal of replication-blocking DNA adducts. In addition, we demonstrated that active DNA synthesis is required for S phase-specific repair inhibition, reflecting a potential relationship between NER and replication. Intriguingly, we also showed that among six tumor cell lines, three exhibit total abrogation of NER uniquely during S phase, indicating that many human cancers may be characterized by such a defect. Our findings therefore could harbour important implications for cancer treatment. Indeed, NER status of tumors clearly appears to constitute a major determinant in the clinical response to chemotherapeutic drugs such as cisplatin, which inhibit the growth of rapidly proliferating cancer cells through induction of replication-blocking DNA lesions.

La réparation de l’ADN par excision des nucléotides (NER) est un mécanisme capable de retirer une large variété de lésions causant une distorsion de la double hélice, comme celles causées par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de réparation de l’ADN, la NER contribue à la prévention de la carcinogénèse en prévenant la mutation de l’ADN. Lors de ce processus, il y a d’abord reconnaissance de la lésion par la protéine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe déroule l’ADN par son activité hélicase et recrute l’endonucléase XPG/Rad2 ainsi que d’autres protéines nécessaires à l’excision de l’ADN. Lors de son arrivée au site de lésion, XPG/Rad2 déplace XPC/Rad4. TFIIH agit également lors de la transcription de l’ADN, entre autres par son activité hélicase. Outre cette similarité de la présence de TFIIH lors de la transcription et la réparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intéressés aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN. Nous avons donc entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons découvert que Rad2 et Rad4 possèdent un motif d’interaction en nous basant sur d’autres interactions de la sous-unité Tfb1 de TFIIH. Par calorimétrie à titrage isotherme, nous avons observé que les segments de ces deux protéines contenant ce motif interagissent avec une grande affinité au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est très semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIEα avec Tfb1PH, tel que démontré par résonance magnétique nucléaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire compétition les uns aux autres pour la liaison à Tfb1PH. Nous avons aussi démontré in vivo chez la levure qu’une délétion de Tfb1PH crée une sensibilité aux radiations UV. De plus, la délétion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments d’interaction à Tfb1PH, est nécessaire pour voir une sensibilité aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliquées dans la liaison de Rad2 et Rad4 à TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont été résolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des résidus hydrophobes interagissant avec des cavités peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont très semblables à la structure de TFIIEα-p62PH. Ces découvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la réparation de l’ADN. De plus, elles permettent d’émettre un modèle du mécanisme de déplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage à l’ADN. Ces connaissances aident à mieux comprendre les mécanismes de maintient de la stabilité génomique et peuvent ainsi mener à développer de nouvelles thérapies contre le cancer. / The nucleotide excision repair pathway (NER) is a mechanism capable of removing a wide variety of helix-distorting lesions, such as those caused by ultraviolet irradiation (UV). As all DNA repair pathways, NER contributes to the prevention of carcinogenesis by preventing DNA mutation. During this process, the lesion is first recognized by the protein XPC/Rad4 (human/yeast), which then recruits TFIIH. This complex unwinds the DNA with its helicase activity and then recruits the endonuclease XPG/Rad2 and other proteins necessary for DNA excision. Upon arrival at the lesion site, XPG/Rad2 displaces XPC/Rad4. TFIIH also acts in DNA transcription, using its helicase activity. In addition to the similarity of the presence of TFIIH in transcription and DNA repair, it is possible to ask ourselves how the two pathways are similar. We were interested in the interactions involving TFIIH and the DNA repair machinery. We have therefore undertaken a structural and functional characterization of these interactions. We have found that Rad2 and Rad4 have a motif of interaction based on other interactions of the Tfb1 subunit of TFIIH. Using isothermal titration calorimetry, we found that segments of these two proteins containing this motif interact with high affinity to the PH domain of Tfb1. The binding site of these segments is very similar to Tfb1PH binding site of transactivation domain of p53 and the carboxyl-terminal domain of TFIIEα with Tfb1PH, as demonstrated by nuclear magnetic resonance (NMR). In addition, these segments can compete with each other for binding to Tfb1PH. We also demonstrated in vivo that deletion of Tfb1PH in yeast creates a sensitivity to UV irradiation. In addition, the deletion of multiple segments of Rad2 and Rad4, including segments of interaction Tfb1PH, is required to observe a sensitivity to UV. Thus, multiple interactions are involved in the binding of TFIIH to Rad2 and Rad4. Finally, the structures of the Rad2-Tfb1PH and Rad4-Tfb1PH complexes were solved by NMR. These structures are identical to each other and involve hydrophobic residues interacting with shallow grooves on Tfb1PH. These structures are very similar to the structure of TFIIEα-p62PH. These findings provide an important mechanistic link between transcription and DNA repair. In addition, they provide a model of the mechanism of the displacement of XPC/Rad4 by XPG/Rad2 at the damaged site. This knowledge helps to better understand the mechanisms of genomic stability and can lead to novel cancer therapies.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

To maintain the genomic integrity, cell has evolved various DNA repair pathways. Base Excision Repair pathway (BER) is one such DNA repair pathway which is dedicated to protect DNA from small lesions such as oxidation, alkylation, deamination and loss of bases. Uracil is a promutagenic base which appears in the genome as a result of misincorporation of dUTP or due to oxidative deamination of cytosine. Uracil-DNA glycosylases (UDGs) are DNA repair enzymes that initiate multistep base excision repair (BER) pathway to excise uracil from DNA. Excision of uracil generates an abasic site (APDNA). AP-sites are cytotoxic and mutagenic to the cell. AP endonucleases act downstream to UDG in this pathway and generate substrates for DNA polymerase to fill in the correct bases. The cytotoxicity of AP-sites raises the question whether uracil excision activity is coupled to AP endonuclease activity. Also, there is transient formation of single stranded DNA (ssDNA) during DNA metabolic processes such as replication, repair and recombination. ssDNA is more prone to various nucleases and DNA damaging agents. All the living organisms encode single stranded DNA binding protein (SSB) that binds to ssDNA and protects it from various damages. In addition, SSB plays a vital role during DNA replication, repair and recombination. Studies on SSBs from prototype Escherichia coli and an important human pathogen, Mycobacterium tuberculosis have shown that despite significant variations in their quaternary structures, the DNA binding and oligomerization properties of the two are similar. My PhD thesis consists of four Chapters. Chapter 1 summarizes the relevant literature review on DNA damage and repair with an emphasis on uracil DNA glycosylase and its interacting protein, SSB. Chapters 2 and 3 describe my studies on the mechanism of uracil excision repair in E. coli. Chapter 4 describes my findings on the structure-function relationship of single stranded DNA binding proteins from E. coli and M. tuberculosis. Specific details of my research are summarized as follows: (1) Analysis of the impact of allelic exchange of ung with a mutant gene encoding Uracil DNA Glycosylase attenuated in AP-DNA binding in the maintenance of genomic integrity in Escherichia coli. There are five families of UDGs. Of these, Ung proteins (family 1 UDGs) represent highly efficient and evolutionary conserved enzymes. Structural and biochemical analysis of Ung proteins has identified two conserved motif, motif A (62GQDPY66) and motif B (187HPSPLS192) in E. coli that are important for the catalysis by Ung enzyme. Y66 of motif A is in van der Waals contact with the C5 position of the uracil and prevents entry of other bases. Earlier study from the laboratory showed that the Y66W and Y66H mutants of Ung were compromised by ~7 and ~170 fold, respectively in their uracil excision activities. However, unlike the wild-type and Y66H proteins, Y66W was not inhibited by its product (uracil or AP-DNA). In this study, by fluorescence anisotropy measurements I have shown that compared with the wild-type protein, the Y66W mutant is moderately compromised and attenuated in binding to AP-DNA. Allelic exchange of ung in E. coli with ung::kan, ungY66H:amp or ungY66W:amp alleles showed ~5, ~3.0 and ~2.0 fold, respectively increase in mutation frequencies. Analysis of mutations in the rifampicin resistance determining region (RRDR) of rpoB revealed that the Y66W allele resulted in an increase in A to G (or T to C) mutations. However, the increase in A to G mutations was mitigated upon expression of wild-type Ung from a plasmid borne gene. Biochemical and computational analyses showed that the Y66W mutant maintains strict specificity for uracil excision from DNA. Interestingly, a strain deficient in AP-endonucleases also showed an increase in A to G mutations. These findings have been discussed in the context of a proposal that the residency of DNA glycosylase(s) onto the AP-sites they generate shields them until recruitment of AP-endonucleases for further repair. It is proposed that an error prone replication against AP-sites (as a result of uracil excision activities on A:U pair) may result in A to G mutations. 2. Mechanism of appearance of A to G mutations in ungY66W:amp strain of Escherichia coli. In this part of my study, I have investigated the role of error prone DNA polymerases in the mutational specificity of ungY66W:amp strain. It was observed from various studies in E. coli that, DNA polymerase IV (Pol IV) and DNA polymerase V (Pol V) are involved in error-prone replication on damaged or AP-site containing DNA. E. coli strains containing deletion of either dinB (encoding DNA Pol IV) or umuDC (encoding DNA Pol V) were generated and used to study mutation frequency and mutation spectrum. Deletion of DNA Pol V resulted in a decrease in A to G mutations in ungY66W:amp E. coli strain, suggesting that increase in A to G mutations were a consequence of error prone incorporation by DNA Pol V. 3. Structure and Function studies on Single Stranded DNA Binding Proteins from Escherichia coli and Mycobacterium tuberculosis. SSB from M. tuberculosis (MtuSSB) has similar domain organization as the EcoSSB. Moreover, the biochemical properties such as oligomerization, DNA binding affinity and minimum binding site size requirements were shown to be similar to EcoSSB. However, structural studies suggested that quaternary structures of these two SSBs are variable. In this study I have used X-ray crystal structure information of these two SSBs to generate various chimeras after swapping at various regions of SSBs. Chimeras mβ1, mβ1’β2, mβ1-β5, mβ1-β6, and mβ4-β5 SSBs were generated by substituting β1 (residues 611), β1’β2 (residues 21-45), β1-β5 (residues 1 to 111), β1-β6 including a downstream sequence (residues 1 to 130), and β4-β5 (residues 74-111) regions of EcoSSB with the corresponding sequences of MtuSSB, respectively. Additionally, mβ1’β2ESWR SSB was generated by mutating the MtuSSB specific ‘PRIY’ sequence in the β2 strand of mβ1’β2 SSB to EcoSSB specific ‘ESWR’ sequence. Biochemical characterization revealed that except for mβ1 SSB, all chimeras and a control construct lacking the C-terminal domain (ΔC SSB) efficiently bound DNA in modes corresponding to limited and unlimited modes of binding. The mβ1 SSB was also hypersensitive to chymotrypsin treatment. The mβ1-β6, MtuSSB, mβ1’β2 and mβ1-β5 constructs complemented E. coli Δssb in a dose dependent manner. Complementation by the mβ1-β5 SSB was poor. In contrast, mβ1’β2ESWR SSB complemented E. coli as well as EcoSSB. Interestingly, the inefficiently functioning SSBs resulted in an elongated cell/filamentation phenotype of E. coli. Taken together, our observations suggest that specific interactions within the DNA binding domain of the homotetrameric SSBs are crucial for their biological function.

Les dommages oxydatifs de l’ADN sont impliqués dans les processus pathologiques que sont le cancer, les maladies neurodégénératives ou le vieillissement. Ces dommages résultent en partie de l’action des espèces réactives de l’oxygène (ERO), qui proviennent du métabolisme cellulaire ou d’agents exogènes (physiques ou chimiques), et qui conduisent à différents types de lésions parmi lesquelles l’oxydation des bases de l’ADN (8-oxoguanine, 8-oxoG) ou la formation de sites abasiques AP (apurique/apyrimidique). Ces lésions, qui si elles ne sont pas éliminées conduisent à des processus de mutagenèse ou de mort cellulaire, sont prises en charge spécifiquement par le système de réparation de l’ADN par excision de base ou BER. Le BER est initié par l’action d’une ADN glycosylase, telles que la 8-oxoG-ADN glycosylase (Ogg1) chargée d’éliminer la 8-oxoG, une lésion très abondante. Une étude par « double-hybride » initiatrice de ce projet a révélé l’existence d’une interaction in vivo chez S. cerevisiae entre la protéine yOgg1 et la sous-unité catalytique de l’ADN polymérase réplicative Polε (yPol2), également impliquée dans la voie BER chez la levure. Nos travaux démontrent que yOgg1 et yPol2 interagissent bien physiquement entre elles et de façon spécifique. Une étude par troncations et mutagenèse dirigée nous a permis d’identifier le domaine 3’→5’ exonucléase de yPol2 comme faisant partie de la forme tronquée minimale de yPol2 capable d’interagir avec yOgg1. La poche du site actif de yOgg1 et/ou son voisinage immédiat pourrait contenir pour partie le site d’interaction pour yPol2. Nous observons d’ailleurs une corrélation nette entre l’activité de yOgg1 et sa capacité à interagir avec yPol2 dans la levure. De même, l’activité 3’→5’ exonucléase de yPol2 pourrait être liée à son interaction avec yOgg1. D’un point de vue fonctionnel, yPol2 stimulerait l’activité AP lyase de yOgg1 et le couplage entre l’activité ADN glycosylase et AP lyase de l’enzyme, permettant ainsi une meilleure coordination de l’étape d’excision du nucléoside endommagé et l’étape de resynthèse de l’ADN dans la voie BER. / Oxidative DNA damages are involved in pathological processes such as cancer, neurodegenerative diseases and aging. Part of these damages results from the action of reactive oxygen species (ROS), which are produced by cellular metabolism or (physical or chemical) exogenous agents. They lead to different types of DNA lesions including DNA base oxidation (8-oxoguanine, 8-oxoG) and abasic site formation (AP, apuric/apyrimidic). If not removed, these lesions lead to mutagenesis or cell death. Most of base lesions are dealt specifically by the base excision repair (BER) pathway. BER is initiated by a DNA glycosylase, such as 8-oxoG-DNA glycosylase (Ogg1) which is responsible for the removal of 8-oxoG. In previous unpublished work, a yeast two-hybrid study revealed the existence in S. cerevisiae of an interaction between yOgg1 and the catalytic subunit of the replicative DNA polymerase Polε (yPol2), also involved in the BER pathway in eukaryotes. Our work shows that yOgg1 and yPol2 physically and specifically interact with each other. Truncation and site-directed mutagenesis studies allowed us to identify the 3 ' → 5' exonuclease activity domain of yPol2 as part of the minimal form of yPol2 still able to interact with yOgg1. The active site of yOgg1 and/or its immediate vicinity may contain part of its interaction domain with yPol2. Besides, we observe a clear correlation between yOgg1 catalytic activity and its ability to interact with yPol2 in vivo. Similarly, the 3'→5' exonuclease activity of yPol2 could be useful to its interaction with yOgg1. From a functional point of view, yPol2 stimulates in vitro the AP lyase activity of yOgg1 and the coupling of both DNA glycosylase and AP lyase enzyme activity. The interaction yOgg1/yPol2 could allow a better coordination of damaged nucleoside excision and DNA re-synthesis steps in BER.

DNA is constantly damaged by a variety of exogenous and endogenous sources. To maintain the integrity of the genome, different DNA repair mechanisms have evolved, which deal with different kinds of DNA damage. One of the DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER), is highly conserved throughout the three kingdoms of life and deals mainly with lesions arising in the DNA duplex after exposure to UV-light. The NER pathway in archaea is more closely related to that of eukarya, although the overall process is not yet well understood. This thesis describes the isolation and characterisation of one of the repair factors, XPD, from the crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius (SacXPD). SacXPD was first identified due to its homology with the eukaryal XPD protein. In eukarya XPD is the 5a' -> 3a' helicase involved in opening the DNA duplex around a damaged site. In eukarya, XPD is part of a 10-subunit complex, where it fulfils important structural roles and takes part in NER, transcription initiation from RNA polymerase II promoters and cell cycle regulation. The archaeal protein on the contrary is a monomer and a 5a' -> 3a' SF2 DNA helicase as its eukaryal counterpart. Its cellular functions, however, are unclear. Upon purification of SacXPD, it was discovered that the protein binds an ironsulphur cluster (FeS), which is essential for its helicase activity, but not for any other enzymatic functions, such as the ATP hydrolysing activity. The FeS cluster domain was not only identified in archaeal XPD, but also in eukaryal XPD and other related eukaryal helicases, such as FancJ. The presence of the FeS cluster was confirmed in the eukaryotic XPD homologue Rad3 from Saccharomyces cerevisiae. Mutagenesis studies were used to investigate a possible function of the FeS cluster, which may be used to engage ssDNA during the duplex unwinding process. This would actively distort the ss/ ds DNA junction. In addition, the resulting bending of the clamped single DNA strand could be used to avoid reannealing. The consequences of some human mutations introduced into the SacXPD gene were investigated and could contribute to our understanding of the development of human diseases.

<p>DNA bases can be modified by endogenous agents (e.g. oxidized by products of respiration and photosynthesis or methylated by gene silencing processes) as well as by environmental agents (e.g. oxidized by UV light). In the process of removing modified bases, a 3’-phosphate group is sometimes left in the resulting gap, and has to be removed since it blocks the incorporation of a new nucleotide by DNA polymerase. The aim of this thesis was the characterization of AtZDP, a plant enzyme with a DNA 3’-phosphatase activity.</p><p>By homologous modeling, the existence of four domains was predicted in AtZDP, three independent zinc-finger and one DNA 3’-phosphatase domains. AtZDP was found to be localized in the nucleus by bimolecular fluorescence complementation. Western blotting analysis showed that the enzyme was ubiquitously expressed in plant tissues.</p><p>AtZDP was found in a 600,000 molecular-weight protein complex by gel chromatography and glycerol gradient sedimentation centrifugation. The fractions containing AtZDP in the complex displayed 3’-DNA phosphatase activity as shown by desphosphorylation of a DNA oligonucleotide with a 3’-phosphate terminus. Also fractions of the gel chromatography corresponding to lower molecular weight showed 3’-DNA phosphatase activity, but antibodies against AtZDP did not recognize this fraction inferring that in plants, at least another protein with similar activity exists.</p><p>In mammals, polynucleotide kinase, an enzyme with the same activity phosphatase activity as AtZDP, is involved in single-strand and double-strand repair pathways. To elucidate if AtZDP could be part of similar pathways, different double strand and single-strand oligonucleotides with 3’-phosphate termini were separately incubated with AtZDP. All substrates were dephosphorylated by AtZDP, assuming that this enzyme could potentially be involved in double-strand DNA repair. </p><p>A double-strand oligonucleotide containing a one-bp gap with a 3’-phosphate terminus was repaired by a leaf protein extract. The activities of a 3’-DNA phosphatase, a flap 5’ to 3’ endonuclease-like, a DNA polymerase and a DNA ligase were observed. The presence of these enzymes revealed that these damages are in plants predominantly repaired by long-patch base excision repair.</p>

Les rayons UV du soleil causent une variété de dommages dans l'ADN, parmi lesquels les dimères cyclobutilyques de pyrimidines (CPD) sont considérés comme hautement toxiques et dommageables pour un organisme. Par conséquent, il est important de comprendre comment la machinerie de réparation par excision des nucléotides (la NER), assure la réparation in vivo des CPD présents dans l'ADN empaqueté sous forme de chromatine. Il est connu que la présence du nucléosome inhiberait la NER, mais les détails fonctionnels demeurent mal compris, de même que les mécanismes cellulaires nécessaires pour contourner cette inhibition offerte par la chromatine. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les gènes SIR (SIR1, SIR2, SIR3 et SIR4 ) permettent la formation d'une structure hétérochromatique sur le locus du type sexuel et les télomères. Cependant, l'impact de cette hétérochromatine sur la réparation des CPD est très peu étudié.Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat ont permis de caractériser l'impact des gènes SIR dans la survie des cellules après irradiation aux rayons UV, de même que dans la réparation de l'ADN des régions hétérochromatiques. Premièrement, à l'aide d'une méthode basée sur le suivi de la croissance en milieu de culture liquide, nous avons démontré que les mutants sir[delta] sont plus résistants aux rayons UV par rapport aux cellules de types sauvages. Ce phénotype serait relié à l'effet de pseudo-diploïdie présent dans ces mutants, et plus précisément à la recombinaison homologue en phase G2/M du cycle cellulaire.Les protéines Sir ne joueraient donc pas un rôle directement dans la réparation des CPD. Par la suite, nous avons procédé à l'analyse de la cinétique de réparation de l'ADN du locus du type sexuel et des télomères dans des cellules de type sauvage et des mutants si2r[delta], sir3[delta], et rad26[delta] . À partir des résultats obtenus, nous avons pu tirer différentes conclusions préliminaires laissant croire que la présence de l'hétérochromatine faite par les protéines Sir n'inhiberait pas davantage la réparation par rapport à la présence des nucléosomes, du moins dans les régions sous-télomériques. De plus, nos résultats démontreraient que la réparation couplée à la transcription pourrait jouer un rôle important dans la réparation de ces régions. Ces hypothèses devront évidemment être testées.