Thèse : Médecine : Paris : 1862. / N° d'ordre : 20.

Depuis plusieurs années, on sait que la dérégulation des hormones sexuelles dans un organisme est responsable de plusieurs désordres relatifs à la peau par exemple l'acné. Afin de trouver une thérapie efficace contre ces désordres, il serait intéressant d'étudier l'expression des gènes suite à différents traitements hormonaux. Pour ce faire, nous avons utilisé les biopuces à oligonucléotides qui permettent d'étudier l'expression génique dans un tissu. L'objectif principal est d'étudier la régulation du transcriptome des glandes préputiales de la souris par les androgènes. Nous avons effectué trois protocoles possédant une durée différente de traitement (Véhicule ou DHT). Ces expériences nous ont permis d'isoler plusieurs gènes impliqués dans les mécanismes suivants: l'inflammation, la modulation cellulaire, l'apoptose et la synthèse lipidique. L'analyse de leur expression a permis de venir à la conclusion qu'un traitement androgénique inhibe les gènes impliqués dans les trois premiers mécanismes mais active ceux impliqués dans la synthèse lipidique.

Au cours de ce travail, nous nous sommes attachés à étudier certaines réponses cellulaires secondaires à l’activation des récepteurs purinergiques P2X dans deux modèles différents, les macrophages péritonéaux et les cellules des glandes sous-maxillaires. Ces cellules contribuent à notre immunité innée, soit tournée vers l’intérieur (macrophages), soit vers l’extérieur (glandes sous-maxillaires). Nous avons dans un premier temps confirmé par Western blot et par des dosages de la concentration intracellulaire de calcium ([Ca2+]i) que les deux types de cellules étudiés expriment des récepteurs P2X4 et P2X7 fonctionnels. Nous nous sommes alors concentrés sur deux réponses impliquées dans la protection de l’hôte contre les agressions et l’élimination de pathogènes : la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ainsi que la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1beta (IL-1beta). Nos résultats montrent que la production de ROS en réponse à l’ATP extracellulaire est secondaire à l’activation d’une NADPH oxydase dans les deux types de cellules. Cette réponse est médiée par les récepteurs P2X7 ainsi que, dans les macrophages, par d’autres récepteurs purinergiques comme par exemple les récepteurs P2X4 et des récepteurs P2Y. Dans les glandes exocrines, contrairement aux macrophages, la protéine kinase C ainsi que ERK1/2 interviennent dans l’activation de la NADPH oxydase. Par la suite nous avons comparé la régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1beta par les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Nous avons observé que l’IL-1beta est présente dans la salive collectée chez des souris injectées par de la pilocarpine. Des analyses par ELISA, RT-PCR et Western blot montrent que la cytokine est exprimée de manière constitutive par les cellules acineuses et ductales des glandes sous-maxillaires, à un niveau plus élevé que dans les macrophages. Contrairement aux cellules phagocytaires, l’expression de la cytokine dans les cellules des glandes salivaires n’est pas augmentée suite à la stimulation par des lipopolysaccharides. De même, dans ces cellules l’ATP n’a pas provoqué la sécrétion d’IL-1beta malgré l’efflux de K+ secondaire à l’activation des récepteurs P2X7. Dans une dernière série d’expériences nous avons évalué les effets du peptide antimicrobien CRAMP sur les macrophages murins. Le CRAMP a inhibé toutes les réponses secondaires à l’activation des récepteurs P2X7 (ouverture du canal cationique, formation de pore, production de ROS, libération d’IL-1beta, d’acide oléique et de lactate déshydrogénase). L’inhibition par le CRAMP de l’augmentation de la [Ca2+]i en réponse à l’ATP n’était pas médiée par les récepteurs aux peptides formylés car les agonistes de ces récepteurs n’ont pas bloqué cette augmentation. Le CRAMP n’a pas eu d’effet sur l’augmentation de la [Ca2+]i secondaire à l’activation des récepteurs P2X4 par une combinaison d’ATP et d’ivermectine. Nos expériences ont révélé que les récepteurs P2X7 sont couplés à diverses voies de signalisation dans les macrophages et dans les glandes exocrines. Les voies activées diffèrent en fonction du type de cellules. Nous avons également conclu que les peptides antimicrobiens de la famille de cathélicidines ne sont pas des agonistes universels des récepteurs P2X7.

ANTECEDENTES DEL TEMA. El síndrome de Sjögren primario (SSp) es una enfermedad autoinmune sistémica que afecta a las glándulas exocrinas, principalmente las salivales y las lacrimales, originando síntomas de sequedad. La expresión clínica también incluye manifestaciones generales, afección extraglandular y desarrollo de linfoma. La influencia de los marcadores inmunológicos en la expresión clínica de la enfermedad aún no se conoce del todo y tampoco su papel como factores pronóstico de la enfermedad.JUSTIFICACIÓN UNITARIA DEL TEMA. Los artículos incluidos en esta Tesis Doctoral se centran en el estudio del SSp y describen las principales características de una cohorte de pacientes estudiada de forma estandarizada y prospectiva en el Servicio de Enfermedades Autoinmunes del Hospital Clínic de Barcelona.OBJETIVO. Analizar el papel de los marcadores inmunológicos en la expresión clínica y el pronóstico del SSp.RESULTADOS. En nuestros resultados describimos que los pacientes con SSp presentan porcentajes significativos de citopenias. La presencia de estas citopenias se asocian con los principales marcadores inmunológicos del SSp. El perfil inmunológico del paciente con SSp, junto con el estudio histológico también nos permite diferenciar la posible coexistencia o simulación de SS en un paciente con sarcoidosis. Cerca de un 20% de los pacientes con SSp presentan inmunoglobulinas monoclonales circulantes, siendo la IgGκ la más frecuente. La detección de estas inmunoglobulinas monoclonales circulantes se asocia a una mayor prevalencia de manifestaciones extraglandulares y marcadores inmunológicos respecto a aquellos pacientes que no presentan dichas inmunoglobulinas monoclonales. Otro de los marcadores inmunológicos frecuentes en el SSp es la hipocomplementemia, con una prevalencia de 24%. Su presencia se asocia estrechamente con mayor prevalencia de manifestaciones extraglandulares, autoanticuerpos, linfoma y menor supervivencia. Respecto al desarrollo de manifestaciones extraglandulares, los pacientes seguidos durante 5 años, el 18% desarrollaron manifestaciones extraglandulares y este porcentaje incrementaba al 67% en aquellos seguidos durante 20 años. El factor inmunológico que se asoció con la aparición de estas manifestaciones fue la positividad al FR en el momento del diagnóstico del SSp. Respecto al desarrollo de linfoma, la presencia de parotidomegalia, de gammagrafía parotídea grado III-IV e hipocomplementemia al momento del diagnóstico fueron factores predictores de desarrollo de linfoma. Por último, encontramos que la hipocomplementemia (en concreto el C3 y CH50) y la presencia de crioglobulinas en el momento del diagnóstico fueron factores inmunológicos asociados a una menor supervivencia.CONCLUSIONES. Nuestros estudios han demostrado el significativo papel de los marcadores inmunológicos (FR, inmunoglobulinas monoclonales, crioglobulinas e hipocomplementemia) en la expresión clínica del SSp y como factores pronóstico de la evolución de la enfermedad, por lo que sugerimos incluir estos parámetros inmunológicos en el seguimiento del paciente con SSp.

Au cours de ce travail, nous nous sommes attachés à étudier certaines réponses cellulaires secondaires à l’activation des récepteurs purinergiques P2X dans deux modèles différents, les macrophages péritonéaux et les cellules des glandes sous-maxillaires. Ces cellules contribuent à notre immunité innée, soit tournée vers l’intérieur (macrophages), soit vers l’extérieur (glandes sous-maxillaires).<p><p>Nous avons dans un premier temps confirmé par Western blot et par des dosages de la concentration intracellulaire de calcium ([Ca2+]i) que les deux types de cellules étudiés expriment des récepteurs P2X4 et P2X7 fonctionnels.<p><p>Nous nous sommes alors concentrés sur deux réponses impliquées dans la protection de l’hôte contre les agressions et l’élimination de pathogènes :la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ainsi que la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1beta (IL-1beta). Nos résultats montrent que la production de ROS en réponse à l’ATP extracellulaire est secondaire à l’activation d’une NADPH oxydase dans les deux types de cellules. Cette réponse est médiée par les récepteurs P2X7 ainsi que, dans les macrophages, par d’autres récepteurs purinergiques comme par exemple les récepteurs P2X4 et des récepteurs P2Y. Dans les glandes exocrines, contrairement aux macrophages, la protéine kinase C ainsi que ERK1/2 interviennent dans l’activation de la NADPH oxydase. <p><p>Par la suite nous avons comparé la régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1beta par les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Nous avons observé que l’IL-1beta est présente dans la salive collectée chez des souris injectées par de la pilocarpine. Des analyses par ELISA, RT-PCR et Western blot montrent que la cytokine est exprimée de manière constitutive par les cellules acineuses et ductales des glandes sous-maxillaires, à un niveau plus élevé que dans les macrophages. Contrairement aux cellules phagocytaires, l’expression de la cytokine dans les cellules des glandes salivaires n’est pas augmentée suite à la stimulation par des lipopolysaccharides. De même, dans ces cellules l’ATP n’a pas provoqué la sécrétion d’IL-1beta malgré l’efflux de K+ secondaire à l’activation des récepteurs P2X7. <p><p>Dans une dernière série d’expériences nous avons évalué les effets du peptide antimicrobien CRAMP sur les macrophages murins. Le CRAMP a inhibé toutes les réponses secondaires à l’activation des récepteurs P2X7 (ouverture du canal cationique, formation de pore, production de ROS, libération d’IL-1beta, d’acide oléique et de lactate déshydrogénase). L’inhibition par le CRAMP de l’augmentation de la [Ca2+]i en réponse à l’ATP n’était pas médiée par les récepteurs aux peptides formylés car les agonistes de ces récepteurs n’ont pas bloqué cette augmentation. Le CRAMP n’a pas eu d’effet sur l’augmentation de la [Ca2+]i secondaire à l’activation des récepteurs P2X4 par une combinaison d’ATP et d’ivermectine.<p><p>Nos expériences ont révélé que les récepteurs P2X7 sont couplés à diverses voies de signalisation dans les macrophages et dans les glandes exocrines. Les voies activées diffèrent en fonction du type de cellules. Nous avons également conclu que les peptides antimicrobiens de la famille de cathélicidines ne sont pas des agonistes universels des récepteurs P2X7.<p><p><p><p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished