De récentes données suggèrent un rôle clé des longs ARNs non codants (lncRNAs) dans le développement et l’apparition de certaines maladies. Les lncRNAs se sont avérés difficiles à étudier en raison de leur faible niveau d’expression souvent tissu-spécifique, du manque de conservation de leur séquence, et du manque d’outils d’analyse spécifiques. Nous avons émis l’hypothèse que les méthodes d’étude des ARNs messagers peuvent être adaptées aux lncRNAs. Pour valider cette hypothèse, nos objectifs sont : 1-l’utilisation des nouvelles approches dérivées du système CRISPR/Cas9 pour activer et inhiber l’expression génique et 2-l’utilisation des méthodes conventionnelles de surexpression pour étudier les lncRNAs. Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes concentrés sur un nouveau lncRNA, appelé Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA). Ce lncRNA est nécessaire au maintien des cellules souches embryonnaires, mais aussi à leur différenciation vers le lignage neural. Résultats : la nouvelle approche CRISPR-a/i permet d’activer/inhiber le promoteur de Tuna et de réguler l’expression endogène de celui-ci. Ce système s’étant révélé efficace pour Tuna, cela suggère qu’il peut être appliqué à l’étude d’autres lncRNAs. D’autre part, la particularité de cet ARN est qu’il contient une région conservée entre les espèces d’environ 200 nucléotides, correspondant à un ORF pour un peptide de 48 acides aminés. En utilisant des méthodes conventionnelles de marquage par FLAG, on démontre que Tuna code pour ce peptide. Par ailleurs, en supprimant un site de liaison à la protéine HUR dans la région 3’UTR, on altère l’expression du peptide. Cela suggère que ce site est important pour la régulation de la traduction du peptide encodé par Tuna. En conclusion, nos résultats montrent que certaines méthodes d’étude des ARNs messagers sont transposables aux lncRNAs. Cependant, du fait des caractéristiques propres à ces derniers, d’autres approches sont à envisager pour mieux saisir leurs mécanismes. En perspective, ces méthodes vont permettre de mieux comprendre la fonction de Tuna dans les différents états cellulaires où il est exprimé.

L’immunité végétale est garantie par plusieurs niveaux d’action dont l’interconnexion et les voies signalétiques sont peu élucidées. Deux des trois couches de défenses immunitaires sont constituées par les protéines NB-LRR (Nucleotide-Binding Leucine-Rich Repeat), encodées par les gènes de Résistance (gènes R), et l’interférence à ARN (iARN). L’étude de la voie de signalisation induite par l’activation des NB-LRR en réponse à la reconnaissance (directe ou indirecte) de protéines pathogéniques est très compliquée, car cette réponse culmine, dans la majeure partie des cas, en un phénotype macroscopique de mort cellulaire dénommée Réponse hypersensible (HR), empêchant toute analyse biochimique. Récemment, il a été montré chez Nicotiana benthamiana que la réponse antivirale déclenchée par la protéine NB-LRR N, qui n’induit pas de HR lorsqu’activée, implique la répression de la traduction de l’ARN viral. Dans ce système, la résistance conférée par N est dépendante de la protéine AGO4 dont le rôle dans l’iARN est assez bien défini. En effet, bien que l’ARN viral se multiplie à l’intérieur de la cellule hôte, il n’est pas associé à la machinerie de traduction et ne produit donc plus de virions. Cependant, nous ne connaissons pas à ce jour les évènements de régulation de l’expression génique responsables de ce mécanisme de défense. Les études du transcriptome immunitaire chez Arabidopsis thaliana n’ont révélé que peu de candidats majeurs impliqués dans la réponse NB-LRR, alors que certaines études mettent en lumière l’implication de la régulation de l’expression génique, au niveau traductionnel, dans la réponse immunitaire. En s’appuyant sur les travaux de Bhattacharjee et al. (2009), nous avons entrepris de caractériser, au niveau cellulaire, la répression de la traduction de l’ARN viral pendant la réponse induite par N. Nous observons, dans un système inductible permettant de déclencher la réponse immunitaire après l’établissement de l’infection virale, une large formation de granules à ARN appelés PBs (Processing Bodies), en conséquence de l’inhibition spécifique de la traduction de l’ARN viral. Le mécanisme effecteur de cette répression est différent des mécanismes de répression traductionnelle mis en place en réponse à la perception de stress tel que les UVs, ou de l’induction des mécanismes de répression traductionnelle par l’iARN. De plus, des plantes d’Arabidopsis mutantes pour une protéine fonctionnant dans les PBs sont plus résistantes à des bactéries phytopathogènes. D’une façon intéressante, on détecte un niveau d’expression augmenté de certains gènes de défense dans ce mutant, de manière similaire à des mutants d’Arabidopsis compromis dans l’une des voies de dégradation des ARNm. En parallèle, nous avons développé des outils transgéniques pour déterminer si la régulation de la traduction des ARNm de l’hôte, à l’échelle génomique, joue un rôle dans l’établissement de l’immunité. Nous avons généré une lignée d’Arabidsopsis exprimant sous le contrôle d’un promoteur inductible le facteur d’Avirulence (Avr) AvrRpm1, dont la présence est reconnue par la protéine NB-LRR RPM1; en combinaison avec une protéine ribosomale étiquetée nous permettant d’immunopurifier les ribosomes avec les ARNm en cours de traduction. Le séquençage à haut-débit des ARN totaux et des ARNm engagés dans la traduction a révélé que cinq fois plus de gènes sont régulés au niveau traductionnel par rapport au niveau transcriptionnel, après l’induction de la réponse NB-LRR. Une analyse comparée avec les connaissances précédentes a révélé que la réponse NB-LRR induit l’expression de 20% des gènes NB-LRR totaux, qui sont aussi constitutivement exprimés dans des mutants compromis dans certains processus de dégradations des ARNm. Cependant, la réponse NB-LRR induit l’expression de centaines de gènes précédemment impliqués dans les défenses, ce qui n’est pas le cas dans les mutants de dégradation d’ARNm, soulignant ainsi la spécificité de la réponse NB-LRR. Une analyse bio-informatique a déterminé qu’environ cinq cent gènes sont régulés au niveau traductionnel de manière indépendante de leur abondance totale, fournissant une liste de nouveaux candidats potentiellement impliqués dans l’immunité NB-LRR et spécifiquement régulés au niveau traductionnel. Une analyse génétique de certains mutants de ces gènes candidats dans les défenses a été entreprise, et a révélé que des plantes d’Arabidopsis TOR-déficientes ou mutantes pour les gènes CIPK5, CCT2 et BIG possèdent une résistance altérée positivement pour les TOR-déficientes ou négativement pour les autres, par rapport à une plante sauvage. Dans leur ensemble, ces résultats prouvent une grande implication de la régulation de la traduction dans la mise en place de l’immunité végétale.

La technologie des microarrays est une technique d’analyse d’expression génique à grande échelle qui permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes cellules et différentes conditions physiologiques, pathologiques ou toxicologiques (Shena et al, 2000). Dans notre étude nous avons employé cette technique pour mieux comprendre deux pathologies thyroïdiennes: les carcinomes papillaires (PTC) et les adénomes autonomes hyperfonctionnels. L’étude des profils d’expression génique de 9 carcinomes papillaires thyroïdiens sporadiques et de 13 carcinomes papillaires post-Chernobyl a été effectuée en utilisant les lames commerciales de Perkin-Elmer (comportant 2400 cDNA) et en les comparant à leurs tissus normaux adjacents. Les PTC post-Tchernobyl constituent une population de cancers à cause bien définie puisqu’ils sont directement reliés à l’exposition du même agent mutagène, pendant une même période. L’étude des profils d’expression indique qu’il n’y a pas de signature génique spécifique permettant de distinguer les carcinomes papillaires sporadiques des post-Tchernobyl. La comparaison de ces profils d’expression à celui obtenu avec 13 adénomes autonomes a permis de mettre en évidence une signature de 6 gènes (créatine kinase B, annexine A1, clusterine, métallothionéine 1x, Fc fragment of IgG binding protein et tissue inhibitor of metalloproteinase 1) séparant les carcinomes papillaires malins des adénomes autonomes bénins. Nous avons également analysé l’expression génique sur des mélanges de tumeurs et de leurs contrôles respectifs sur des lames à 17000 cDNA fabriquées au MAF (VIB Microarray Facility, Leuven). Un mélange de 14 cancers papillaires sporadiques, un mélange de 20 cancers papillaires provenant de la région de Tchernobyl et un mélange de 5 adénomes autonomes ont été analysés par microarray et comparés aux études existantes comme celles effectuées sur les lames Perkin-Elmer ou par d’autres groupes (Huang et al, 2001 ; Wasenius et al, 2003 ; Jarzab et al, 2005 ; Eszlinger et al, 2004). De ces données microarray ont résulté des listes de gènes sur- et sous-exprimés dans les tumeurs comparées à leurs tissus normaux adjacents. Plusieurs gènes différentiellement exprimés ont déjà été confirmés dans différentes études réalisées aussi bien dans notre laboratoire que dans d’autres. Nous avons confirmé la modulation de plusieurs gènes intéressants par RT-PCR en temps réel (Taqman) ainsi que certaines modulations au niveau protéique (par Western Blot ou immunohistochimie). L’étude immunohistochimique nous a donné également des informations sur la distribution cellulaire et tissulaire de ces protéines. La modulation d’expression génique dans ces tumeurs reflète des caractéristiques physiopathologiques connues (comme l’hyperactivité fonctionnelle, la faible augmentation de l’AMPc ou encore la diminution de l’apoptose dans les adénomes autonomes et la dédifférenciation ou l’invasivité dans les carcinomes papillaires), mais elle nous a également permis d’identifier des caractéristiques physiopathologiques jusqu’ici encore inconnues de ces tumeurs (comme la surexpression de la N-cadhérine et la diminution de la cavéoline1, deux marqueurs présumés de malignité, dans les tumeurs bénignes et un changement de population cellulaire aussi bien dans les adénomes autonomes que dans les carcinomes papillaires). Ces études nous ont donc permis de définir des gènes potentiellement importants dans la pathologie des différentes tumeurs étudiées, mais également des nouveaux marqueurs diagnostiques potentiels. Ainsi, l’étude immunohistochimique sur des tissu-arrays nous a permis de confirmer la surexpression de l’annexine A1 dans les carcinomes papillaires et de la créatine kinase B dans les adénomes autonomes et pas dans les autres tumeurs thyroïdiennes étudiées. L’immunomarquage de ces protéines nous a également aidé à définir la malignité d’une série d’adénomes atypiques. L’annexine A1 est un marqueur potentiel particulièrement intéressant car cette protéine n’est fortement exprimée que dans les carcinomes papillaires. Une hypothèse, encore à confirmer, sur sa fonction dans cette pathologie est décrite dans ce travail. Finalement, nous avons émis une hypothèse expliquant la raison pour laquelle les réarrangements Ret/PTC mènent à la formation de carcinomes papillaires, tandis qu’une mutation activatrice de Ras, l’effecteur directe du récepteur à activité tyrosine kinase Ret, mène à la formation de tumeurs folliculaires.

Les canaux ioniques de détection d'acide (ASIC) font partie de la famille des canaux ioniques degenerin-épithéliaux Na⁺ (DEG-ENaC), dont les principaux ligands connus sont les protons. Les canaux ASIC sont préférentiellement perméables au sodium (Na⁺) et, dans une moindre mesure, à d'autres cations, tels que le potassium (K⁺), le lithium (Li⁺) et le proton (H⁺). Les sous-unités ASIC peuvent être combinées pour donner des canaux homotrimaires ou hétérotrimaires avec différents seuils d'activation activation par l'acidite, ce qui conduit à une sensibilité distincte au pH des canaux ASIC en fonction de leur composition, ce qui fait d'eux des détecteurs de pH polyvalents. Quatre gènes (Asic1-4) exprimés dans tout le système nerveux, codant pour au moins 6 sous-unités (ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 et ASIC4) par épissage alternatif, ont été découverts chez les rongeurs et les humains. Plus précisément, au niveau des ganglions rachidiens du système nerveux périphérique, nous avons signalé que les ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b et ASIC3 jouent un rôle important dans plusieurs fonctions dont la nociception. Même si des études antérieures ont exploré l'implication de ces canaux dans plusieurs fonctions somatosensorielles, une analyse détaillée de leur mode d'expression dans des populations distinctes de neurones sensoriels primaires n'a pas été réalisée à ce jour en raison de la disponibilité limitée d'anticorps spécifiques commerciaux. La première étude, présentée au chapitre 1, visait à révéler le profil d'expression complet des cinq sous-unités ASIC dans trois populations différentes de neurones sensoriels primaires. Une approche d'hybridation in situ (RNAscope) a été utilisée pour cibler les sous-unités ASIC, combinée à l'immunohistochimie pour révéler des populations spécifiques. Plus précisément, je me suis concentrée sur deux types principaux de nocicepteurs ciblant les nocicepteurs non peptidergiques non myélinisés expriment le récepteur à l'isolectine B4 (IB4), et les nocicepteurs peptidergiques non myélinisés exprimant le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP). De plus, j'ai ciblé les neurones multimodaux myélinisés en utilisant le neurofilament 200 (NF200). Compte tenu du rôle des ASIC dans la nociception et de leur implication dans la douleur neuropathique, j'ai également étudié comment la lésion des nerfs périphériques (induite par le menottage du nerf sciatique) affecte l'expression de chaque sous-unité dans différents segments des ganglions de la racine dorsale au sein des deux populations nociceptives. Mes résultats ont mis en évidence un profil d'expression complexe des ASIC dans des conditions naïves en fonction de la population étudiée, et une régulation différentielle des sous-unités ASIC spécifique à la région et au type de cellule après l'induction d'une lésion du nerf périphérique. La deuxième étude consiste en une investigation détaillée du profil d'expression des sous-unités ASIC1, ASIC2 et ASIC3 dans les ganglion rachidien humain. Plus spécifiquement, j'ai mené plusieurs expériences sur la co-expression des ASIC dans les neurones sensoriels primaires, en plus de l'exploration de leur profil d'expression dans les nocicepteurs peptidergiques et non peptidergiques. Cette étude, en conjonction avec mes travaux précédents, a mis en évidence des divergences et des similitudes entre les espèces qui devraient être prises en considération au cours du processus translationnel de cibles analgésiques précliniques jusqu'en traitements cliniques efficaces. / Acid-Sensing Ion Channels (ASICs) are members of the degenerin-epithelial Na⁺ channel (DEG-ENaC) family of ion channels with protons being their main known ligands. ASIC channels are preferentially permeable to sodium (Na⁺), and to a lesser extent, other cations, such as potassium (K⁺), lithium (Li⁺), and proton (H⁺). ASIC subunits can be combined giving homotrimeric or heterotrimeric channels with various acidity activation threshold, leading to distinct pH sensitivity of ASIC channels based on their composition, which makes them versatile pH sensors. Four genes (Asic1-4) expressed throughout the nervous system, encode at least 6 subunits (ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 and ASIC4) through alternative splicing, and have been discovered in rodents and humans, among other species. More specifically, in the dorsal root ganglia (DRG) of the peripheral nervous system (PNS) of rodents, ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, and ASIC3 have been reported, playing an important role in several functions including nociception. Even though previous studies have explored the channels' involvement in several somatosensory functions, a detailed analysis of their expression pattern in distinct populations of primary sensory neurons has not been conducted up to date due to the limited commercial availability of specific antibodies. The first study presented in Chapter 1, aimed to reveal the comprehensive expression pattern of the five ASIC subunits in three different populations of primary sensory neurons. An in situ hybridization approach (RNAscope) was used to target the ASIC subunits, combined with immunohistochemistry to reveal specific populations. Namely, I focused on two main types of nociceptors targeting non-myelinated non-peptidergic nociceptors with Isolectin B4 (IB4), and peptidergic non-myelinated nociceptors with calcitonin gene-related peptide (CGRP). Moreover, I targeted myelinated multimodal neurons using neurofilament 200 (NF200). Considering the role of ASICs in nociception and their involvement in neuropathic pain, I also investigated how peripheral nerve injury (induced by placing a tight cuff around the sciatic nerve) affects the expression of each subunits in different DRG segments within the two nociceptive populations. My results uncovered a complex expression pattern of ASICs in naïve conditions depending on the population under investigation, and a regional and cell type specific differential regulation of ASIC subunits after induction of peripheral nerve injury. The second study consists of a detailed investigation of the expression pattern of ASIC1, ASIC2 and ASIC3 subunits in human DRG. More specifically I conducted several experiments investigating the co-expression of ASICs in primary sensory neurons in addition to exploring their expression pattern in peptidergic and non-peptidergic nociceptors. This study, in conjunction with my previous work, uncovered species divergence and similarities that should be taken under consideration during the translational process of successful preclinical analgesic targets to effective clinical treatments.

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer dont l’incidence augmente le plus vite parmi les hommes. Selon la Société Canadienne du Cancer, en 2015, 24 000 nouveaux cas de cancer de la prostate seront diagnostiqués et 4 100 patients en décèderont. Bien que des techniques cliniques pour la détection, le diagnostique et le traitement du CaP soient disponibles et importantes dans le traitement actuel de la maladie, elles sont cependant limitées. L’exploitation de plusieurs promoteurs dont l’activité est altérée au cours du développement du cancer est un moyen pour surmonter ces limitations. L’ARN non codant PCA3 est un biomarqueur unique du CaP qui a été largement étudié et dont l’expression est 60 fois plus forte dans les cellules de CaP que dans les cellules bégnines de prostate. Le gène de l’APS (PSEBC) est un marqueur important en clinique, il reflète la réponse au traitement par privation androgénique. Ces études ont pour objectif de développer des systèmes d’amplification transcriptionnel avec les promoteurs PCA3 et PSEBC pour non seulement cibler mais aussi caractériser les cellules cancéreuses de prostate lors de la progression de la maladie. Nous avons générés plusieurs systèmes dans des adénovirus contenant différentes constructions avec le promoteur proximal PCA3 de 152 pb, le système d’amplification TSTA et le gène rapporteur de la luciférase. Nous avons testé leur spécificité pour les cellules du CaP par infection transitoire. Nous avons amélioré le système TSTA et généré le PCA3-3STA. Nous avons ensuite intégré le promoteur PCA3 avec le promoteur PSA pour générer un autre nouveau système d’amplification transcriptionnelle qui se nomme le système «Multiple Promoter Integrated Transcriptional Amplification (MP-ITSTA)». Ces systèmes ont ensuite été exploités avec un microscope à bioluminescence pour cibler des cellules de CaP provenant de biopsies liquides de patients. Dans le chapitre deux, nous avons montré que l’activité de PCA3-3STA était hautement spécifique pour les cellules de CaP. Son activité était de 98,7 à 108 fois plus fortes dans les cellules de CaP que dans les cellules primaires bégnines de prostate ou dans les cellules cancéreuses nonprostatiques. Dans des modèles murins de xénogreffes de lignées cellulaires de CaP, nous avons montré que PCA3-3STA pouvait imager de manière très sensible l’activité du promoteur PCA3. De plus, sur des modèles de cultures primaires de biopsies, nous avons montré que le système PCA3-3STA ciblait spécifiquement les cellules épithéliales de CaP sans affecter les cellules stromales. Dans le chapitre trois, nous avons ensuite développé une technique en combinat la microscopie à bioluminescence avec le système TSTA et le promoteur PSA pour cibler les cellules de CaP purifiées de sang de patients et évaluer, cellule par cellule, l’hétérogénéité de leur réponse aux anti-androgènes. Cette technique a aussi montré que la microscopie à bioluminescence est hautement quantitative et a la capacité de détecter les changements moléculaires à l’échelle de la cellule. Le quatrième chapitre présente le système MP-ITSTA. Le système intègre l’activation combinée de deux promoteurs qui contrôlent l’expression d’un seul gène rapporteur. La combinaison du promoteur PCA3 avec celui de l’APS permet d’évaluer, cellule par cellule, la réponse aux anti-androgènes de cellules de CaP prélevés à partir d’urine de patients. C’est pourquoi, les systèmes PCA3-3STA et MP-ITSTA sont des systèmes d’expression spécifiques au cancer de la prostate avec le potentiel de cibler et détecter avec précision les cellules épithéliales de CaP ainsi que leur réponse aux traitements thérapeutiques in vivo et ex vivo. Ces systèmes peuvent jouer un rôle important pour l’imagerie moléculaire, l’immunothérapie et la thérapie génique. / Development Of Transcriptional Amplification Systems To Target and Interrogate Cancer Cells Based On Gene Expression Altered During Cancer Development and Treatment Prostate cancer (PCa) is the fastest rising cancer among the males. According to the Canadian Cancer Society in 2015 it was estimated that 24 000 new cases will be diagnosed with prostate cancer and 4100 patients will die from the disease. Although already available clinical techniques for the detection, prognosis and treatment of PCa play an important role in decision making, they are limited in terms of the ability of detecting PCa cells, prognosis and increasing over all survival of patients. Exploitation of several gene promoters altered during cancer development act as important tool to overcome these limitations. PCA3 noncoding long RNA is a unique PCa biomarker that has been widely studied for its sixty-fold overexpression in PCa cells, compared to benign prostate cells. PSA (PSEBC) gene is of high clinical significance as it can give an account of response to androgen deprivation treatments. These studies aim to develop Transcriptional Amplification Systems that can target as well as characterise cancer cells during disease progression using PCA3 and PSA gene promoters. Various adenovirus constructs incorporating the proximal 152 bp PCA3 promoter, the TSTA system and the Firefly luciferase reporter gene were generated and the specificity of the promoter was tested in PCa cells by transient infection. We have improved the TSTA system and generated the (PCA3-3STA). We further integrated the PCA3 promoter along with the PSA promoter to generate a new transcriptional amplification system that we named the Multiple Promoter Integrated Transcriptional Amplification (MP-ITSTA) system. These systems were further applied to target PCa cells from body fluids of patients using bioluminescence microscopy. In chapter two we show that PCA3-3STA activity was highly specific for PCa cells, ranging between 98.7 and 108.0-fold higher, respectively, than that for benign prostate or non-PCa cells. In PCa cell line mouse xenografts, PCA3-3STA was shown to image PCA3 promoter activity with high sensitivity. Moreover, when primary PCa biopsies were infected with PCA3-3STA, it managed to image PCa epithelial cells but not stromal cells. In chapter three we further developed a bioluminescence microscopy technique using the TSTA system with PSA promoter to target PCa cells from blood of patients and assess heterogeneous single cell response to antiandrogens. This technique also shows that bioluminescence microscopy is highly quantitative and has the ability to detect molecular changes at the cellular level. The fourth chapter presents the MP-ITSTA system. This system integrates the combined activation of two promoters giving a single reporter gene expression. PCA3 when combined with the PSA promoter could assess single cell response to antiandrogens in cells isolated from urine of patients. Hence, PCA3-3STA and MP-ITSTA utilizing the bioluminescence microscopy represent a prostate- and PCa-specific expression systems with the potential to target, with high accuracy, PCa epithelial cells, assess their response to therapy in vivo and ex vivo. This can play an important role for imaging, immunotherapy, or gene therapy.

Depuis les dernières décennies, la parentalité est un projet qui se voit pour plusieurs repoussé à un âge plus avancé. Par conséquent, de plus en plus de couples font face à des problèmes d'infertilité lors que vient le temps de fonder une famille. Le recours aux techniques de procréation médicalement assistée, telle que la fécondation in vitro, est donc lui aussi en constante augmentation. Malgré les nombreux progrès réalisés depuis l'introduction de la fécondation in vitro dans les années 80, le taux de succès de cette technique demeure insatisfaisant, avec un taux de grossesse autour de 30%. La réponse des patientes au traitement de stimulation ovarienne précédant la fécondation in vitro est extrêmement variable et difficile à prédire. De plus, lorsqu'un cycle échoue, c'est généralement sans raison apparente. Les travaux de cette thèse reposent sur l'hypothèse qu'il existe une signature moléculaire liée aux différentes réponses/causes d'échec. L'expression des gènes pourrait être utilisée pour caractériser la réponse des patientes à la stimulation hormonale de façon à pouvoir adapter le traitement suivant et potentiellement améliorer les chances de succès. Nous nous sommes donc intéressés à l'expression des gènes dans les cellules de la granulosa provenant principalement de follicules en contexte de stimulation hormonale, durant la période 34 heures post hCG ou encore provenant d'un modèle in vitro de culture cellulaire. Dans un premier temps, des cellules folliculaires provenant de femme ayant recourt à la fécondation in vitro ont été récoltées lors de la ponction ovarienne. Une biopuce fut utilisée afin de comparer l'expression des gènes entre les patientes pour qui le cycle de fécondation in vitro fut un échec (pas de grossesse) et celles pour qui ce fut un succès(grossesse). Nous avons constaté qu'il existe une signature transcriptomique différente chez les patientes pour qui le cycle a échoué. De plus, l'analyse des gènes différentiellement exprimés et des principales voies biologiques y étant associée nous ont renseignés davantage sur les mécanismes physiologiques potentiellement liés à l'échec, notamment un débalancement inflammatoire, une différenciation anormale et une augmentation de l'apoptose. Par la suite, 135 échantillons de cellules folliculaires provenant exclusivement de patientes pour qui la fécondation in vitro fut un échec (pas de grossesse) ont été utilisés. Des gènes liés à différentes causes d'échec potentielles ont été analysés en qRT-PCR, avant de réaliser une analyse de regroupement hiérarchique (clustering). La population de patientes non enceintes fut divisée en trois groupes possédant chacun un modèle d'expression génique particulier lié à une cause d'échec potentielle. Nous avons ainsi pu voir qu'il était possible de distinguer différentes causes d'échec ou différentes réponses folliculaires chez les patientes dont le cycle a échoué. Nous avons finalement utilisé un modèle in vitro de cellules de la granulosa humaine (lignée cellulaire KGN) afin d'étudier la capacité des cellules de la granulosa de répondre, à elles seules, à différents stimuli inflammatoires. Cette étude nous a permis de voir, via l'expression de gènes d'inflammation, que les cellules de la granulosa peuvent créer une réponse inflammatoire et que celle-ci est différente selon le type de stimulus. Globalement, les résultats de ces études améliorent les connaissances et la compréhension de l'échec en contexte de fécondation in vitro. Ils mettent également en lumière le potentiel de l'expression des gènes comme outil de diagnostic de la réponse folliculaire. Finalement, ils confirment également l'importance de l'inflammation et de son contrôle, particulièrement en contexte de procréation assistée. / Since the last few decades, couples tend to postpone parenthood to later in life. As a result, an increasing number of couples are facing infertility problems when it comes to building a family and have children. Consistently, the use of assisted reproductive technologies such as in vitro fertilization is also increasing. Despite all the progress that has been made since the introduction of in vitro fertilization in the 1980s, the success rate of this technique remains low, with a pregnancy rate around 30%. The patient's response to the stimulation treatment that precedes in vitro fertilization is extremely variable and difficult to predict. Moreover, when a cycle fails, most of the time there is no apparent reason. The hypothesis of this thesis is that there is a transcriptomic signature in follicular cells that reflects the ovarian response. Gene expression could be used to characterize the patient's response to the hormonal stimulation in order to adapt the next treatment accordingly and thus potentially improve the chances of success. Our work focuses on the gene expression in granulosa cells coming mainly from stimulated follicles in the context of in vitro fertilization or from an in vitro cell culture model. First, follicular cell samples from women undergoing in vitro fertilization treatment were obtained. We used a microarray to compare gene expression between patients that did not become pregnant following the in vitro fertilization cycle and those that did. We found that there is a different transcriptomic signature in patients who failed to conceive following in vitro fertilization. In addition, the analysis of the differentially expressed genes and the related biological pathways gave us more information on the physiological mechanisms potentially related to IVF failure, such as inflammatory imbalance, abnormal differentiation and increased apoptosis. For the next study, 135 follicular cell samples coming exclusively from patients who failed to conceive following in vitro fertilization (no pregnancy) were used. Genes related to different potential failure causes were analyzed using qRT-PCR and a hierarchical clustering analysis was then performed. The population of non-pregnant patients was divided into three groups, each one having a specific gene expression pattern related to a potential failure cause. The results of this study showed that it is possible to distinguish different failure causes or different follicular responses in patients whose cycle had failed. We finally used an in vitro model of human granulosa cells (KGN cell line) to see if pure granulosa cells were able to respond to different inflammatory stimuli. This preliminary study showed, through the expression of inflammation-related genes, that granulosa cells alone are able to create an inflammatory response and that this response differs depending on the type of stimulus. Taken together, the results of these studies improve the current knowledge and our understanding of in vitro fertilization failure. They also highlight the potential of gene expression to serve as a follicular response diagnostic tool. Finally, they also confirm the importance of inflammation and its control, particularly in the context of assisted reproductive technologies.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Deux classes de poly(A)-binding protein (PABP) lient la queue poly(A) des ARNm chez la plupart des mammifères: PABPC1 au cytosol et PABPN1 au noyau. PABPC1 stimule la traduction des ARNm tandis que PABPN1 stimule la processivité de la poly(A) polymérase tout en contrôlant la taille des queues poly(A). Il est à noter que les orthologues de PABPC1 sont bien caractérisés chez la levure, toutefois un homologue de PABPN1 n'avait jamais été identifié. Précédemment, le Dr. Bachand avait réalisé une purification par affinité avec la protéine d’arginine méthyltransférase I (Rmt1) couplée à la spectrométrie de masse, ce qui a permis d'identifier l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission. Différentes expériences ont démontré que Pab2 est une protéine nucléaire non-essentielle qui lie spécifiquement des séquences poly(A) in vitro. Pab2 a été identifiée par son interaction avec Rmt1 et cette enzyme méthyle les arginines présentes dans le domaine riche en arginine de la protéine Pab2. Cette modification post-traductionnelle n'affecte pas la localisation nucléaire et l’affinité aux séquences poly(A) de Pab2. Par contre, les niveaux d’oligomérisation de Pab2 sont nettement augmentés lorsque Pab2 n’est plus méthylée. De plus, les ARNs provenant de cellules [Delta]pab2 sont hyperadénylés, ce qui corrobore avec la fonction de PABPN1 à contrôler la taille des queues poly(A) in vitro. Par la suite, j'ai caractérisé l’implication de Pab2 durant la maturation du pré-ARNm. Des essais d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) ont établi que Pab2 est recrutée co-transcriptionnellement aux gènes activement transcrits. De façon surprenante, mes études ont démontré que le recrutement de Pab2 précède celui d'un facteur impliqué dans le clivage et la polyadénylation. De plus, le recrutement de Pab2 dépend de l’ARNm naissant. Conséquemment, j'ai voulu identifier les protéines associées à Pab2. Ainsi, une purification d’affinité par tandem couplée à la spectrométrie de masse a révélé que Pab2 est associée à plusieurs protéines ribosomales ainsi que des facteurs de traduction générale. Ces données étaient étonnantes puisque la traduction des ARNm implique la protéine Pab1. Par conséquent, il était pertinent de vérifier le rôle possible de Pab2 sur la traduction. À priori, j ’ai confirmé que Pab2 fait la navette entre le noyau et le cytosol, ce qui concorde avec l’orthologue PABPN1. Par la suite, j'ai démontré qu’une fraction de la protéine Pab2 demeure associée aux ARNm activement traduits. Il devenait alors intéressant de connaître les cibles de Pab2. L’analyse génomique a établi que Pab2 régule l’expression de certains transcrits, tels que les gènes méïotiques, les snoRNAs et les rétrotransposons. Pour la suite de mes recherches, je me suis concentrée sur le gène codant pour la protéine ribosomale de la large sous-unité Rpl30-2, dont l’expression augmente de 4 fois en absence de Pab2. Il est intéressant de noter que le changement d ’expression de Rpl30-2 dans une souche [Delta]pab2 dépend de la présence de l’intron Rpl30-2. Mes travaux démontrent que l’expression de Rpl30-2 est régulée au niveau du pré-ARNm par Pab2 et Rrp6, une composante de l’exosome nucléaire. De plus, l’analyse du transcriptome par RNA-seq a établi que ce mécanisme permet de réguler l’expression d'une soixantaine de gènes qui sont inefficacement épissés. En ce qui concerne Rpl30-2, l’épissage de ce transcrit est ralenti par Rpl30-1, le paralogue de Rpl30-2. L’ensemble de mes travaux ont pu caractériser l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission tout en établissant une fonction spécifique pour cette poly(A)-binding protein.