CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera (moringa) à uma espÃcie pertencente à famÃlia Moringaceae que se caracteriza por ser muito resistente a insetos e fungos. Trabalhos prÃvios realizados por nosso grupo de pesquisa revelaram a presenÃa de proteÃnas ligantes à quitina em sementes de moringa, dentre elas a Mo-CBP3, sugerindo uma correlaÃÃo positiva entre essa proteÃna e a resistÃncia da planta. No inÃcio do desenvolvimento da planta, para que ocorra a germinaÃÃo, deve haver a embebiÃÃo da semente, um processo seguido pela exsudaÃÃo. Na exsudaÃÃo, compostos do metabolismo primÃrio e secundÃrio sÃo externalizados da semente, alguns deles exercendo aÃÃo de defesa da nova planta ao impedirem o ataque de herbÃvoros e/ou patÃgenos. O presente trabalho teve como objetivos caracterizar o exsudato de sementes de moringa quanto à composiÃÃo bioquÃmica e atividade biolÃgica e investigar a presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato, visando contribuir para o estabelecimento de seu papel fisiolÃgico. Inicialmente, foram estabelecidas as condiÃÃes de exsudaÃÃo, dando Ãnfase ao tempo e solvente. Uma maior exsudaÃÃo de proteÃnas foi observada em sementes embebidas com Ãgua destilada por 24 horas. Esse exsudato mostrou a presenÃa de atividades inerentes a metabÃlitos primÃrios (protease, β-1,3-glucanase, quitinase, inibidor de tripsina e inibidor de papaÃna) e secundÃrios (saponinas e esteroides). Mo-CBP3 foi tambÃm detectada no exsudato, usando anticorpos policlonais anti-Mo-CBP3. A presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato de sementes de moringa foi confirmada apÃs este ter sido submetido à cromatografia em matriz de quitina, procedida pela anÃlise atravÃs de dot bloting e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os dados obtidos mostraram que o material retido na matriz de quitina corresponde a 0,26% do total de proteÃnas exsudadas, à reconhecido pelo anticorpo anti-Mo-CBP3 e apresenta perfil eletroforÃtico similar ao da Mo-CBP3 purificada de sementes de moringa. Na avaliaÃÃo da atividade deste exsudato frente à fitopatÃgenos, aÃÃo contra fungos nÃo foi detectada, nas condiÃÃes de ensaio empregadas, exceto para Candida parapsilosis que mostrou uma discreta reduÃÃo na taxa de crescimento. Contrariamente, uma potente atividade contra nematoide foi verificada, tendo sido o exsudato de sementes capaz de causar atà 100% de mortalidade para indivÃduos de Meloidogyne incognita em estÃgio de J2. Quando investigada a presenÃa de Mo-CBP3 em raiz, um ÃrgÃo vegetal que apresenta o fenÃmeno de exsudaÃÃo e, tambÃm, à capaz de interagir diretamente com o nematoide, resultados positivos foram encontrados. De fato, Mo- CBP3 està presente em raÃzes de moringa, jà nos estÃgios iniciais do desenvolvimento, conforme resultados mostrados por ELISA e atravÃs da tÃcnica de RT-PCR. Os dados, em conjunto, sugerem que no fenÃmeno da exsudaÃÃo, proteÃnas devem desempenhar funÃÃes essenciais e que, no caso da moringa, Mo- CBP3 jà participa nos estÃgios iniciais do desenvolvimento dessa planta arbÃrea, papel este que pode estar relacionado com a proteÃÃo contra patÃgenos. / Moringa oleifera (moringa) is a species belonging to the family Moringaceae which is characterized as having high resistance to insects and fungi. Previous work carried out by our research group revealed the presence of chitin-binding proteins in moringa seeds, among them Mo-CBP3, suggesting a positive correlation between this protein and the plant resistance. At the onset of the new plant development, for germination to occur, seed imbibition is required, a process followed by exudation. In exudation process, primary and secondary metabolites are released in the medium outside the seeds, some of them protecting the new plant against herbivores and/or pathogens. This study aimed to characterize the chemical composition and biological activities of moringa seed exudate and to investigate the presence of Mo-CBP3 in the exudate, in order to contribute to the establishment of its physiological role. Initially, the best conditions for exudation were established, emphasizing the time and solvent. A higher exudation of seed proteins was observed in distilled water after 24 hours. This exudate showed the presence of activities related to primary (protease, β-1,3- glucanase, chitinase, trypsin inhibitor and papain inhibitor) and secondary (steroid and saponins) metabolites. Mo-CBP3 was also detected in the exudate, using polyclonal antibodies anti-Mo-CBP3. The presence of Mo-CBP3 in the moringa seed exudate was confirmed after chromatography on chitin matrix and analyses by dot blotting and polyacrylamide gel electrophoresis. The data obtained showed that the retained material on the chitin matrix corresponds to 0.26% of the total protein, it is recognized by anti-Mo-CBP3 and has electrophoretic profile similar to that of Mo- CBP3 which was purified from moringa seeds. In the activity tests to pathogens, the seed exudate showed no antifungal activity, under the conditions used, except for Candida parapsilosis which had a slight reduction in its growth rate. In contrast, a potent activity against nematode was found as the seed exudate was able to cause a mortality rate up to 100% of Meloidogyne incognita in J2 stage. When investigated the presence of Mo-CBP3 in moringa hoots, a plant organ that shows the exudation phenomen and is also able to interact directly with the nematode, positive results were found. In fact, Mo-CBP3 is present in moringa hoots, in the initial stages of the plant development, according to the results shown by ELISA and RT-PCR. The data, taken together, suggest that in the exudation phenomen, proteins must play essential roles. In the case of moringa, Mo-CBP3 already participates in the initial stages of development of this tree species, playing a role that must be related to protection against pathogens.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A exsudaÃÃo à um mecanismo de defesa apresentado por sementes que consiste na liberaÃÃo de molÃculas para o solo durante o processo de germinaÃÃo. Esses exsudatos, compostos essencialmente de proteÃnas e metabÃlitos secundÃrios, atuam interferindo no desenvolvimento de microrganismos, representando fontes para prospecÃÃo de molÃculas de defesa com potencial biotecnolÃgico, voltadas ao controle de patÃgenos de solo. Nesse contexto, a soja se destaca [Glycine max (L.) Merrill] como sistema ideal ao estudo das interaÃÃes planta-patÃgeno, visto seu grande valor econÃmico e o alto teor de proteÃnas de seus grÃos. Este trabalho teve como objetivos caracterizar a composiÃÃo dos exsudatos de sementes de dois cultivares de soja, com diferentes Ãndices de desempenho em resposta ao nematoide das galhas Meloidogyne incognita, e avaliar seus efeitos in vitro e in vivo sobre este fitopatÃgeno. Exsudatos foram obtidos a partir de sementes de soja (cultivares BRS-Pala: suscetÃvel; BRS-Macota: resistente), embebidas em acetato de sÃdio 0,1 M, pH 5,0, por 18 horas. A anÃlise proteÃmica comparativa livre de gel que permitiu a identificaÃÃo de diversas proteÃnas relacionadas à defesa vegetal, tais como a aglutinina da soja, os inibidores de tripsina do tipo Kunitz e Bowman-Birk e proteÃnas relacionadas à patogÃnese. A anÃlise qualitativa de metabÃlitos secundÃrios nos exsudatos revelou a presenÃa de fenÃis, triterpenÃides, saponinas, flavonas, flavonÃis e xantonas em ambas as cultivares. Posteriormente, estes exsudatos foram dialisados em membranas de diÃlise com exclusÃo de 3,5 kDa e submetidos à dosagem de proteÃnas bioativas. As atividades hemaglutinante (609,52 UH/mgP), inibitÃrias de tripsina (4,81 mg tripsina inibida/mgP) e papaÃna (30,48 UI/mgP), proteolÃtica (1,52 UAPr/mgP.min) e β-1,3-glucanÃsica (58,26 ηkatGLU/mgP) foram maiores para a cultivar BRS-Pala. Jà a atividade peroxidÃsica (0,218 UAP/mgP.min) predominou na cultivar BRS-Macota, A avaliaÃÃo da atividade nematicida sobre ovos e juvenis de segundo estÃdio (J2), usando exsudatos dialisados, revelou que ambos os exsudatos sÃo capazes de inibir a eclosÃo de M. incognita, bem como a mobilidade dos juvenis desta espÃcie. Esta propriedade nematostÃtica se reflete na infectividade do parasita, reduzida pelo tratamento com proteÃnas exsudadas na concentraÃÃo de 0,13 mg/mL. Os resultados reforÃam a ideia de que a exsudaÃÃo das sementes està relacionada à defesa constitutiva deste ÃrgÃo vegetal, sugerindo que proteÃnas presentes nos exsudatos podem promover proteÃÃo contra nematoides durante o processo germinativo. / Exudation is a defense mechanism presented by seeds, which release molecules to the soil during the germination process. These exudates, mainly composed by proteins and secondary metabolites, act interfering with the development of microorganisms. They represent a source of defense molecules with biotechnological potential to control soil-borne pathogens. In this context, soybean [Glycine max (L.) Merrill] stands as an ideal system in the study of plant-pathogen interaction due to its great economic value and the high content of seed proteins. The experimental activities presented in this thesis aimed to characterize the composition of seed exudates from two different soybean cultivars, which show different levels of performance in response to the root-knot nematode Meloidogyne incognita. Furthermore, the in vitro and in vivo effects of the seed exudates on this pathogen were evaluated. For this purpose, the exudates were obtained from soybean seeds (BRS-Pala:susceptible; BRS-Macota:resistant), soaked in 0.1 M sodium acetate, pH 5.0, during 18 hours. The gel-free proteomic analysis allowed identification of several defense-related proteins such as soybean agglutinin, Kunitz and Bowman-Birk trypsin inhibitors, and pathogenesis-related proteins. The qualitative analysis of secondary metabolites in the exudates also revealed the presence of phenols, triterpenoids, saponins, flavones, flavonols, and xanthones in both cultivars. The above exudates were dialyzed in 3.5 kDa cut-off membranes and assayed for bioactive proteins. The hemagglutinating (609.52 HU/mgP), trypsin (4.81 mg trypsin inhibited/mgP) and papain (30.48 IU/mgP) inhibitor, proteolytic (1.52 UAPr/mgP.min), and β-1, 3-glucanase (58.26 ηkatGLU/mgP) activities were higher for BRS-Pala. Otherwise, the peroxidase activity (0.218 UAP/mgP.min) predominated in BRS-Macota. The evaluation of anti-nematode activity against eggs and second stage juveniles (J2) revealed that both exudates were able to inhibit the hatching of M. incognita eggs as well as the J2 mobility. This nematostatic property is reflected in the infectivity of the parasite, reduced by the exuded protein at 0.13 mg/mL concentration. The results reinforce the idea that the exudation is related to the constitutive defense of the seeds, suggesting that the proteins present in the exudates can contribute to the protection against nematodes and possibly other plant enemies during the germination process.