CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera (moringa) à uma espÃcie pertencente à famÃlia Moringaceae que se caracteriza por ser muito resistente a insetos e fungos. Trabalhos prÃvios realizados por nosso grupo de pesquisa revelaram a presenÃa de proteÃnas ligantes à quitina em sementes de moringa, dentre elas a Mo-CBP3, sugerindo uma correlaÃÃo positiva entre essa proteÃna e a resistÃncia da planta. No inÃcio do desenvolvimento da planta, para que ocorra a germinaÃÃo, deve haver a embebiÃÃo da semente, um processo seguido pela exsudaÃÃo. Na exsudaÃÃo, compostos do metabolismo primÃrio e secundÃrio sÃo externalizados da semente, alguns deles exercendo aÃÃo de defesa da nova planta ao impedirem o ataque de herbÃvoros e/ou patÃgenos. O presente trabalho teve como objetivos caracterizar o exsudato de sementes de moringa quanto à composiÃÃo bioquÃmica e atividade biolÃgica e investigar a presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato, visando contribuir para o estabelecimento de seu papel fisiolÃgico. Inicialmente, foram estabelecidas as condiÃÃes de exsudaÃÃo, dando Ãnfase ao tempo e solvente. Uma maior exsudaÃÃo de proteÃnas foi observada em sementes embebidas com Ãgua destilada por 24 horas. Esse exsudato mostrou a presenÃa de atividades inerentes a metabÃlitos primÃrios (protease, β-1,3-glucanase, quitinase, inibidor de tripsina e inibidor de papaÃna) e secundÃrios (saponinas e esteroides). Mo-CBP3 foi tambÃm detectada no exsudato, usando anticorpos policlonais anti-Mo-CBP3. A presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato de sementes de moringa foi confirmada apÃs este ter sido submetido à cromatografia em matriz de quitina, procedida pela anÃlise atravÃs de dot bloting e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os dados obtidos mostraram que o material retido na matriz de quitina corresponde a 0,26% do total de proteÃnas exsudadas, à reconhecido pelo anticorpo anti-Mo-CBP3 e apresenta perfil eletroforÃtico similar ao da Mo-CBP3 purificada de sementes de moringa. Na avaliaÃÃo da atividade deste exsudato frente à fitopatÃgenos, aÃÃo contra fungos nÃo foi detectada, nas condiÃÃes de ensaio empregadas, exceto para Candida parapsilosis que mostrou uma discreta reduÃÃo na taxa de crescimento. Contrariamente, uma potente atividade contra nematoide foi verificada, tendo sido o exsudato de sementes capaz de causar atà 100% de mortalidade para indivÃduos de Meloidogyne incognita em estÃgio de J2. Quando investigada a presenÃa de Mo-CBP3 em raiz, um ÃrgÃo vegetal que apresenta o fenÃmeno de exsudaÃÃo e, tambÃm, à capaz de interagir diretamente com o nematoide, resultados positivos foram encontrados. De fato, Mo- CBP3 està presente em raÃzes de moringa, jà nos estÃgios iniciais do desenvolvimento, conforme resultados mostrados por ELISA e atravÃs da tÃcnica de RT-PCR. Os dados, em conjunto, sugerem que no fenÃmeno da exsudaÃÃo, proteÃnas devem desempenhar funÃÃes essenciais e que, no caso da moringa, Mo- CBP3 jà participa nos estÃgios iniciais do desenvolvimento dessa planta arbÃrea, papel este que pode estar relacionado com a proteÃÃo contra patÃgenos. / Moringa oleifera (moringa) is a species belonging to the family Moringaceae which is characterized as having high resistance to insects and fungi. Previous work carried out by our research group revealed the presence of chitin-binding proteins in moringa seeds, among them Mo-CBP3, suggesting a positive correlation between this protein and the plant resistance. At the onset of the new plant development, for germination to occur, seed imbibition is required, a process followed by exudation. In exudation process, primary and secondary metabolites are released in the medium outside the seeds, some of them protecting the new plant against herbivores and/or pathogens. This study aimed to characterize the chemical composition and biological activities of moringa seed exudate and to investigate the presence of Mo-CBP3 in the exudate, in order to contribute to the establishment of its physiological role. Initially, the best conditions for exudation were established, emphasizing the time and solvent. A higher exudation of seed proteins was observed in distilled water after 24 hours. This exudate showed the presence of activities related to primary (protease, β-1,3- glucanase, chitinase, trypsin inhibitor and papain inhibitor) and secondary (steroid and saponins) metabolites. Mo-CBP3 was also detected in the exudate, using polyclonal antibodies anti-Mo-CBP3. The presence of Mo-CBP3 in the moringa seed exudate was confirmed after chromatography on chitin matrix and analyses by dot blotting and polyacrylamide gel electrophoresis. The data obtained showed that the retained material on the chitin matrix corresponds to 0.26% of the total protein, it is recognized by anti-Mo-CBP3 and has electrophoretic profile similar to that of Mo- CBP3 which was purified from moringa seeds. In the activity tests to pathogens, the seed exudate showed no antifungal activity, under the conditions used, except for Candida parapsilosis which had a slight reduction in its growth rate. In contrast, a potent activity against nematode was found as the seed exudate was able to cause a mortality rate up to 100% of Meloidogyne incognita in J2 stage. When investigated the presence of Mo-CBP3 in moringa hoots, a plant organ that shows the exudation phenomen and is also able to interact directly with the nematode, positive results were found. In fact, Mo-CBP3 is present in moringa hoots, in the initial stages of the plant development, according to the results shown by ELISA and RT-PCR. The data, taken together, suggest that in the exudation phenomen, proteins must play essential roles. In the case of moringa, Mo-CBP3 already participates in the initial stages of development of this tree species, playing a role that must be related to protection against pathogens.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / MoÂ-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com massa molecular aparente de 18,0 kDa, consistindo de mÃltiplas isoformas heterodimÃricas. Mo-CBP3 à uma proteÃna altamente estÃvel, que possui amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos e mantÃm sua estrutura secundÃria e atividade antifÃngica em extremos de temperaturas e diferentes valores de pH. Dessa forma, a proteÃna Mo-CBP3 se apresenta como uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de plantas transgÃnicas resistentes ao ataque de fungos. Para tanto, Mo-CBP3 foi submetida a testes de biosseguranÃa alimentar, visando garantir sua utilizaÃÃo atravÃs da expressÃo em plantas, minimizando, assim, os riscos para animais nÃo alvo, incluindo o homem. A avaliaÃÃo de biosseguranÃa alimentar da proteÃna seguiu o teste de duas etapas, baseado em pesos de evidÃncia, proposto pelo Instituto Internacional de CiÃncias da Vida (ILSI). A pesquisa evidenciou o longo histÃrico de uso seguro, fundamentado em dados cientÃficos, da espÃcie M. oleifera, fonte da proteÃna Mo-CBP3. AnÃlises in silico mostraram que Mo-CBP3 nÃo possui qualquer identidade com proteÃnas alergÃnicas, tÃxicas e/ou antinutricionais. Adicionalmente, nÃo foram encontrados na proteÃna epÃtopos potencialmente capazes de promover reaÃÃo cruzada e desencadear uma resposta alergÃnica. Identidade com proteÃnas alergÃnicas (> 35%) foi encontrada apenas quando uma janela de 80 aminoÃcidos foi utilizada. SÃtios potenciais de N-glicosilaÃÃo nÃo foram encontrados na proteÃna madura. A proteÃna mostrou resistÃncia ao tratamento tÃrmico e à digestibilidade por fluido gÃstrico simulado, mas foi completamente susceptÃvel à digestÃo em fluido intestinal simulado. Em adiÃÃo, Mo-CBP3 nÃo causou efeitos adversos relevantes em camundongos submetidos a doses elevadas de 5 a 2000 mg/kg, via oral, evidenciando seu carÃter inÃcuo. A partir da avaliaÃÃo de biosseguranÃa alimentar proposta pelo ILSI nÃo à esperado qualquer risco associado ao consumo da proteÃna Mo-CBP3 pelo homem e demais animais monogÃstricos. / Mo-CBP3 is a chitin binding protein purified from Moringa oleifera seeds which has an apparent molecular mass of 18.0 kDa and consists of multiple heterodimeric isoforms. Mo-CBP3 is a highly stable protein that has a broad spectrum of activity against phytopathogenic fungi and maintains its secondary structure and antifungal activity at extreme temperatures and different pH values. Thus, the Mo-CBP3 protein presents itself as a promising tool for the development of transgenic plants resistant to fungi attack. For such purpose, the Mo-CBP3 protein was subjected to food safety tests to ensure the safety of its expression in plants, minimizing the risk to non-target animals, which include human beings. The food safety assessment of the protein followed the two-tiered approach, based on weight of evidences, proposed by International Life Sciences Institute (ILSI). The research evidenced the long history of safe use, supported by scientific literature, of the M. oleifera species, source of Mo-CBP3 protein. In silico analysis did not reveal any identity of Mo-CBP3 with allergenic, toxic and/or antinutritional proteins. Additionally, were not found in the protein potential epitopes able to lead to cross reaction and unleash an allergic response. Identity with allergenic proteins was found only when a window of 80 amino acids was used. Potential sites of N-glycosylation were not found in the mature protein. The protein showed resistance to thermal treatment and digestibility by simulated gastric fluid, but was completely susceptible to digestion in simulated intestinal fluid. In addition, Mo-CBP3 caused no relevant adverse effects to mice subjected to high oral doses from 5 to 2000 mg/kg, showing its innocuous nature. Based on the food safety approach proposed by ILSI is not expected any risk associated to use of Mo-CBP3 protein for humans and other monogastric animals.

PEREIRA, Mirella Leite. Identificação de uma proteína ligante à quitina em sementes de Moringa oleifera Lamarck com atividades antinociceptiva e anti-inflamatória. 2010. 148 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-22T12:58:11Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_mlpereira.pdf: 2928438 bytes, checksum: baa96d60cb675c47c7cfb74d94bbcad3 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:02:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_mlpereira.pdf: 2928438 bytes, checksum: baa96d60cb675c47c7cfb74d94bbcad3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:02:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_mlpereira.pdf: 2928438 bytes, checksum: baa96d60cb675c47c7cfb74d94bbcad3 (MD5) Previous issue date: 2010 / Moringa oleifera Lam. is a perennial multipurpose tree with a strong scientific evidence of its curative power and used in folk medicine to cure several inflammatory processes. This work aimed to isolate and characterize a chitin-binding protein from Moringa oleifera seeds, and evaluate its antinociceptive and anti-inflammatory effects. Chitin-binding proteins were obtained after application of albumin fraction from crude extract of M. oleifera seeds into a chitin column and the adsorbed fraction was applied in a Resource-S matrix attached to FPLC system. The fraction eluted with 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.2, containing 0.6 M NaCl, named Mo-CBP4 was used for the experiment. Mo-CBP4 showed a single band on SDS-PAGE (molecular mass 9.8 kDa) in presence of reducing agent, however in the absence of 2-mercaptoethanol two bands corresponding to 27.5 and 16.5 kDa were observed. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (18.7 and 13.4 kDa), with the same isoeletric point value corresponding to 10.55. Mo-CBP4 is a glycoprotein containing 2.85% neutral sugar, which failed to agglutinate untreated or trypsin-treated erythrocytes from rabbit or human origin. This protein showed coagulant activity, similar to aluminum and potassium sulfate, the coagulant most widely used in water treatment. Mo-CBP4 was subjected to in vitro digestion with pepsin, trypsin, or chymotrypsin and appeared to be markedly resistant to digestion. Acetic acid-induced abdominal constrictions, increase in vascular permeability and leukocyte migration tests were used for the antinociceptive and anti-inflammatory activities assessment. Mo-CBP4 (1.0, 3.5 and 10 mg/kg) into mice potently and significantly reduced the occurrence of abdominal writhing in a dose dependent manner by 18.9, 44.6% and 98.9%, respectively. In addition, the oral administration of the protein (10 mg/kg) resulted in 18% and 52.9% reductions in abdominal writhing when given 30 and 60 min prior to acetic acid administration, respectively. Mo-CBP4 also caused a significant and dose-dependent inhibition of peritoneal capillary permeability induced by acid acetic and significantly inhibited leukocyte accumulation in the peritoneal cavity. The effect antinociceptive appeared to be independent on the carbohydrate recognition site. However the anti-inflammatory activity was partially reversed when Mo-CBP4 was pre-incubated with specific carbohydrate ligand, showing that this effect is dependent on the carbohydrate recognition site / Moringa oleifera Lam. é uma árvore conhecida pelo seu valor medicinal, uma vez que extratos de todas as partes desta planta mostraram propriedades farmacológicas reconhecidas pelo uso popular e corroboradas pela comunidade científica. Dentre as atividades farmacológicas, destacam-se àquelas relacionadas a processos inflamatórios. Este trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterização de uma proteína ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera e avaliação de suas atividades antinociceptiva e anti-inflamatória. As proteínas foram extraídas da farinha delipidada de sementes e o extrato total foi fracionado em albuminas e globulinas. A fração albumínica foi submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A fração ligante à quitina eluída com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi submetida à cromatografia de troca iônica acoplada a um sistema de FPLC, rendendo cinco picos protéicos. O material eluído com tampão acetato de sódio 0,5 M, pH 5,2, contendo NaCl 0,6 M, denominado Mo-CBP4 (Mo – Moringa oleifera; “CBP – “chitin binding protein”), teve um rendimento final de 0,54% e foi escolhido para dar continuidade ao trabalho. Mo-CBP4 apresentou-se como duas bandas protéicas de massas moleculares aparentes de 27,5 e 16,5 kDa, em condições não-redutoras, e de 9,8 kDa em condições redutoras. Eletroforese bidimensional desta proteína revelou a presença de dois spots (18,7 e 13,4 kDa), com mesmo ponto isoelétrico (pI de 10,55). Trata-se de uma glicoproteína com 2,85% de carboidratos, não apresentando atividade hemaglutinante. Mo-CBP4 mostrou-se tão eficiente quanto o sulfato de alumínio e potássio na capacidade de coagular material em suspensão na água. A proteína em questão foi resistente à proteólise no teste de digestibilidade in vitro utilizando pepsina, tripsina e quimotripsina. Para avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório de Mo-CBP4, foi utilizado o modelo de contorções abdominais induzidas pela injeção de ácido acético 0,8% (via i.p.) em camundongos. A proteína, nas doses de 1,0, 3,5 e 10 mg/kg, foi capaz de prevenir as contorções de maneira dose dependente, chegando a 98,9% de inibição na dose de 10 mg/kg. Mo-CBP4 também apresentou atividade antinociceptiva por via oral (10 mg/kg), atingindo uma inibição de 52,9% quando administrada 60 minutos antes da injeção de ácido acético. Mo-CBP4 inibiu o aumento da permeabilidade vascular (89,1%) e a migração leucocitária (60,9%) na dose de 10 mg/kg via i.p. A propriedade antinociceptiva parece ser independente do sítio de interação ao carboidrato N-acetil-D-glucosamina, enquanto que a atividade anti-inflamatória mostrou um decréscimo quando a região de ligação ao carboidrato foi bloqueada. Os resultados apresentados suportam cientificamente o uso popular da M. oleifera e mostram que uma proteína ligante à quitina, Mo-CBP4, está associada aos efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório das sementes

PINTO, Clidia Eduarda Moreira. Biossegurança alimentar da proteína antifúngica Mo-CBP3 de sementes de Moringa oleifera Lam: uma candidata para o desenvolvimento de plantas transgênicas, Fortaleza - CE, 2014. 119 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-20T12:05:40Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_cempinto.pdf: 4842222 bytes, checksum: 4eddade7939a6a0bcab415ce2f86bc31 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-05-20T12:37:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_cempinto.pdf: 4842222 bytes, checksum: 4eddade7939a6a0bcab415ce2f86bc31 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T12:37:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_cempinto.pdf: 4842222 bytes, checksum: 4eddade7939a6a0bcab415ce2f86bc31 (MD5) Previous issue date: 2014 / Mo-CBP3 is a chitin binding protein purified from Moringa oleifera seeds which has an apparent molecular mass of 18.0 kDa and consists of multiple heterodimeric isoforms. Mo-CBP3 is a highly stable protein that has a broad spectrum of activity against phytopathogenic fungi and maintains its secondary structure and antifungal activity at extreme temperatures and different pH values. Thus, the Mo-CBP3 protein presents itself as a promising tool for the development of transgenic plants resistant to fungi attack. For such purpose, the Mo-CBP3 protein was subjected to food safety tests to ensure the safety of its expression in plants, minimizing the risk to non-target animals, which include human beings. The food safety assessment of the protein followed the two-tiered approach, based on weight of evidences, proposed by International Life Sciences Institute (ILSI). The research evidenced the long history of safe use, supported by scientific literature, of the M. oleifera species, source of Mo-CBP3 protein. In silico analysis did not reveal any identity of Mo-CBP3 with allergenic, toxic and/or antinutritional proteins. Additionally, were not found in the protein potential epitopes able to lead to cross reaction and unleash an allergic response. Identity with allergenic proteins was found only when a window of 80 amino acids was used. Potential sites of N-glycosylation were not found in the mature protein. The protein showed resistance to thermal treatment and digestibility by simulated gastric fluid, but was completely susceptible to digestion in simulated intestinal fluid. In addition, Mo-CBP3 caused no relevant adverse effects to mice subjected to high oral doses from 5 to 2000 mg/kg, showing its innocuous nature. Based on the food safety approach proposed by ILSI is not expected any risk associated to use of Mo-CBP3 protein for humans and other monogastric animals. / Mo¬-CBP3 é uma proteína ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com massa molecular aparente de 18,0 kDa, consistindo de múltiplas isoformas heterodiméricas. Mo-CBP3 é uma proteína altamente estável, que possui amplo espectro de ação contra fungos fitopatogênicos e mantém sua estrutura secundária e atividade antifúngica em extremos de temperaturas e diferentes valores de pH. Dessa forma, a proteína Mo-CBP3 se apresenta como uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes ao ataque de fungos. Para tanto, Mo-CBP3 foi submetida a testes de biossegurança alimentar, visando garantir sua utilização através da expressão em plantas, minimizando, assim, os riscos para animais não alvo, incluindo o homem. A avaliação de biossegurança alimentar da proteína seguiu o teste de duas etapas, baseado em pesos de evidência, proposto pelo Instituto Internacional de Ciências da Vida (ILSI). A pesquisa evidenciou o longo histórico de uso seguro, fundamentado em dados científicos, da espécie M. oleifera, fonte da proteína Mo-CBP3. Análises in silico mostraram que Mo-CBP3 não possui qualquer identidade com proteínas alergênicas, tóxicas e/ou antinutricionais. Adicionalmente, não foram encontrados na proteína epítopos potencialmente capazes de promover reação cruzada e desencadear uma resposta alergênica. Identidade com proteínas alergênicas (> 35%) foi encontrada apenas quando uma janela de 80 aminoácidos foi utilizada. Sítios potenciais de N-glicosilação não foram encontrados na proteína madura. A proteína mostrou resistência ao tratamento térmico e à digestibilidade por fluido gástrico simulado, mas foi completamente susceptível à digestão em fluido intestinal simulado. Em adição, Mo-CBP3 não causou efeitos adversos relevantes em camundongos submetidos a doses elevadas de 5 a 2000 mg/kg, via oral, evidenciando seu caráter inócuo. A partir da avaliação de biossegurança alimentar proposta pelo ILSI não é esperado qualquer risco associado ao consumo da proteína Mo-CBP3 pelo homem e demais animais monogástricos.

FREIRE, José Ednésio da Cruz. Análise in silico da sequência deduzida de Mo-CBP3, uma proteína ligante à quitina de Moringa oleifera LAM. 2013. 116 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-30T12:44:05Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_jecfreire.pdf: 2576370 bytes, checksum: c3841faa82a44a8e3de82ce42c785dc5 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-11T23:29:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_jecfreire.pdf: 2576370 bytes, checksum: c3841faa82a44a8e3de82ce42c785dc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-11T23:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_jecfreire.pdf: 2576370 bytes, checksum: c3841faa82a44a8e3de82ce42c785dc5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Moringa oleifera is a tree belonging to the Moringaceae family. This plant is native from India where it is named as drumstick tree. In Brazil M. oleifera was introduced in the 1950’s decade and it is known as moringa. Approximately 40% of the fresh weight of these seeds is formed by proteins, some of which were isolated and characterized as flocculants and antinutritional proteins. In addition, the chitin binding proteins have been identified and isolated, especially among which is the Mo-CBP3, a thermostable glycoprotein of apparent molecular mass of around 14.3 kDa, with potent inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In order to characterize the deduced sequence of Mo-CBP3, moringa fruits were collected 65 days after anthesis and their seeds subjected to extraction of total RNA. cDNA synthesis was directed by ‘5’ RACE’-PCR. The PCR products were subcloned into appropriate vectors (pGEM-T Easy) and then introduced into Escherichia coli cloning host TOP10F'. The recombinant plasmids were purified from transformed bacterial cell and subjected to DNA sequencing. The computational analysis of the deduced protein sequence of Mo-CBP3 showed that this protein has an apparent molecular mass of 12.85 kDa and it is unstable in cytoplasmic conditions. It has derived signal sequences, one for the signal peptide with 30 amino acids, and a sequence at the C-terminus of this protein, related to the anchorage to the plasma membrane as well as the endoplasmic reticulum. Moreover, probable sites of O-glycosylation and phosphorylation were identified. One domain related to the lipid transfer functions, reserve and trypsin inhibitors and alpha-amylase was identified following Mo-CBP3, thereby contributing to the understanding of its potent action against phytopathogenic fungi. / A Moringa oleifera é uma planta pertencente à família Moringaceae. Esta planta é nativa da Índia, sendo lá conhecida como drumstick (baqueta ou bastão de tambor). No Brasil, a M. oleifera foi introduzida na década de 1950, e é conhecida como moringa. Aproximadamente 40% do peso fresco das sementes é composto por proteínas, das quais algumas foram isoladas e caracterizadas como sendo floculantes e proteínas antinutricionais. Em adição, proteínas ligantes à quitina têm sido identificadas e isoladas, destacando-se dentre estas a Mo-CBP3, uma glicoproteína termoestável de massa molecular aparente em torno de 14,3 kDa, com potente atividade inibitória contra fungos fitopatogênicos. A fim caracterizar a sequência deduzida da Mo-CBP3, frutos de moringa foram coletados após 65 dias da antese e suas sementes submetidas à extração de RNA total. A síntese de cDNA foi dirigida por meio da técnica PCR-RACE 5'. Os produtos de PCR foram subclonados em vetores apropriados (pGEM-T Easy) e, em seguida, introduzido em hospedeiro de clonagem Escherichia coli TOP10F'. Os plasmídeos recombinantes foram purificados de células bacterianas transformadas e submetidos ao sequenciamento de DNA. A análise computacional da sequência deduzida da proteína Mo-CBP3 mostrou que esta é uma proteína de massa molecular aparente em torno de 12,85 kDa e, em condições citoplasmáticas apresenta-se instável. Possui sequências sinais deduzidas, sendo uma para peptídeo sinal, com 30 aminoácidos, e uma sequência na região C-terminal relacionada à ancoragem desta proteína à membrana plasmática, bem como ao retículo endoplasmático. Ademais, prováveis sítios de O-glicosilação e de fosforilação foram identificados. Um domínio relacionado às funções de transferência de lipídeos, de reserva e de inibidores de tripsina e de alfa-amilase foi identificado na sequência de Mo-CBP3, contribuindo, desse modo, para o entendimento de sua potente ação contra fungos fitopatogênicos.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CleysyvanSM_DISSERT.pdf: 1173359 bytes, checksum: 82a094c436e4d9b81948c390ed5d9ed1 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Chitin-binding vicilins from legume seeds (Erythrina velutina. Canavalia ensiformes and Phaseolus vulgares) were isolated by ammonium sulfate followed by affinity chromatography on a chitin column. Effect of these vicilins on female adults of Ceratitis capitata was examined by bioassay and in a semi-field assay model. Mechanism of action of the vicilins was determined by in vivo digestibility and chitin affinity. Among the tested vicilins, E. velutina when added to diet caused strong effect on mortality at 10% dose. This insecticidal property was tested in a semi-field assay which showed the same effect observed in laboratory conditions, where doses of 10% and 15% were lethal to female adults of C. capitata. These deleterious effects were not only associated to the binding to chitin structures present in peritrophic membrane, but principally to its low digestibility in the C. capitata digestive tract. This fact was confirmed because chiting binding proteins as WGA and the other tested vicilins were not toxic to female adults of C. capitata due susceptibility of these proteins to digestive enzymes of the insects. By other side EvV was more resistant to digestive enzymes, causing deleterious effects on female adults of C. capitata. These results showed that EvV may be part of the pest management programs or an alternative in plant improvement program in the population control of this fruticulture pest / Vicilinas ligantes a quitina de sementes de Erythrina velutina, Canavalia ensiformis e Phaseoulus vulgaris foram isoladas atrav?s de procedimento que consistiu de precipita??o com sulfato de am?nio seguida de cromatografia de afinidade em coluna de quitina. O efeito dessas vicilinas sobre f?meas adultas de Ceratitis capitata foi examinada por bioensaios em condi??es de laborat?rio e por bioensaios em condi??es de semi-campo. O mecanismo de a??o dessas vicilinas foi determinado por um ensaio de digestibilidade in vivo e pela propriedade de liga??o a uma matriz de quitina. Entre as vicilinas testadas, a vicilina de E. velutina foi a ?nica letal, causando mortalidade de 100% quando adicionada ? dieta das moscas das frutas adultas na concentra??o de 10% (p/p). Este efeito inseticida da vicilina de E. velutina foi tamb?m testado em condi??es de semi-campo, onde concentra??es de 10 % e 15% (p/p) de vicilina adicionada ? dieta foram letais para f?meas adultas de C. capitata. Esse efeito delet?rio das prote?nas ligantes ? quitina n?o foi associado somente ? propriedade de liga??o ? quitina, visto que as outras vicilinas, al?m da lectina de g?rmen de trigo (WGA) foram t?xicas quando adicionadas ? dieta das moscas das frutas. Entretanto, a resist?ncia/susceptibilidade dessas prote?nas aos processos digest?rios desses insetos poderia explicar os diferentes efeitos observados. Das prote?nas ligantes ? quitina, apenas aquelas refrat?rias ? a??o das enzimas digestivas nos processos digest?rios teve a??o inseticida. Esses resultados mostraram que vicilina de E. velutina ? um bioinseticida com potencial de uso nos programas de controle de pragas diminuindo a popula??o de moscas das frutas no campo

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos. No presente trabalho, novas propriedades estruturais da Mo-CBP3 sÃo descritas, revelando correlaÃÃo entre sua estabilidade estrutural e atividade antifÃngica. Em adiÃÃo, para melhor compreensÃo dos mecanismos pelos quais essa proteÃna exerce aÃÃo antifÃngica, sua habilidade de induzir a produÃÃo endÃgena de espÃcies reativas de oxigÃnio e de causar alteraÃÃes morfolÃgicas e ultraestruturais foi analisada, usando Fusarium solani como modelo. F. solani à uma espÃcie de fÃcil manuseio e desenvolvimento rÃpido, ideal para ensaios in vitro, e de relevÃncia, por se tratar de um fungo que ataca culturas economicamente importantes. Com foco na utilizaÃÃo segura da Mo-CBP3 como agente quÃmico contra fungos, seus efeitos citotÃxicos sobre cÃlulas eucariÃticas tambÃm foram investigados. Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina de 18,0 kDa, de acordo com PAGE-SDS. Todavia, anÃlise por espectrometria de massas revelou que essa proteÃna consiste de mÃltiplas isoformas com massas moleculares variando entre 12,2 e 12,3 kDa. Mo-CBP3 à composta por duas cadeias polipeptÃdicas de 5,0 e 9,0 kDa, denominadas de cadeia A e cadeia B, respectivamente. A cadeia B contÃm a sequÃncia NH2-terminal representada por CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, enquanto que a cadeia A tem o resÃduo NH2-terminal bloqueado. cDNA codificador da cadeia B foi obtido com iniciadores sintetizados a partir de sua sequÃncia NH2-terminal. AnÃlises in silico das sequÃncias de nucleotÃdeos e de aminoÃcidos deduzida confirmaram a presenÃa de isoformas e massa molecular da Mo-CBP3 e identificaram sÃtios potenciais de O-glicosilaÃÃo e fosforilaÃÃo. AlÃm disso, similaridades entre Mo-CBP3 e outras proteÃnas de M. oleifera, bem como com albuminas 2S, foram detectadas. A estrutura secundaria da Mo-CBP3 à composta por 30,3% α-hÃlices, 16,3% folhas β, 22,3% voltas e 30,4% estruturas ao acaso. Na espectroscopia de fluorescÃncia, excitaÃÃes de uma soluÃÃo da Mo-CBP3 a 280 nm e 295 nm produziram emissÃo mÃxima a 303 e 309 nm, respectivamente. A estrutura da Mo-CBP3 à altamente estÃvel, se apresentando indiferente Ãs mudanÃas de temperatura e pH. Mo-CBP3 (0,05-0,1 mg/mL) se mostrou capaz de inibir a germinaÃÃo de conÃdios de vÃrios fungos fitopatogÃnicos, incluindo F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides. Similarmente, Mo-CBP3 (0,05 mg/mL) foi capaz de inibir o crescimento micelial de F. solani e apresentou tanto efeito fungistÃtico como fungicida, dependendo da concentraÃÃo usada. LigaÃÃo da Mo-CBP3 à superfÃcie de cÃlulas fÃngicas ocorre, pelo menos em parte, via interaÃÃo eletrostÃtica, jà que NaCl 0,15 M aboliu seu efeito inibitÃrio. Mo-CBP3 induziu a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio e causou perda de assimetria e deformaÃÃes em cÃlulas de F. solani. DesorganizaÃÃo do sistema de endomembranas, condensaÃÃo do citosol e aumento de vacuolizaÃÃo tambÃm foram observados. Mo-CBP3 nÃo mostrou atividade hemolÃtica e nem foi capaz de alterar a viabilidade das cÃlulas MCF-7 e Caco-2, sugerindo que essa proteÃna nÃo à tÃxica para cÃlulas humanas. Com base na alta estabilidade e no amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos em baixas concentraÃÃes e, tambÃm, na ausÃncia de citotoxicidade para cÃlulas humanas testadas, Mo-CBP3 tem grande potencial para desenvolvimento de novas drogas antifÃngicas ou na produÃÃo de plantas transgÃnicas mais resistentes a fungos. / Mo-CBP3 is a chitin-binding protein purified from Moringa oleifera seeds that displays broad inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In this work, we report new structural features of Mo-CBP3 that reveal a correlation between its structural stability and antifungal activity. In addition, to gain better insights into the mechanisms by which this protein acts as an antifungal agent, its ability to induce the endogenous production of reactive oxygen species and to trigger morphologic and ultrastructural alterations were analysed using Fusarium solani as a model. F. solani is an easy-to-handle and fast-developing species, making it ideal for in vitro assays, and it holds relevance as a phytopathogenic fungus that attacks economically important crop plants. To fully explore the biosafety of Mo-CBP3 as a chemical agent against fungi, its cytotoxic effects on eukaryotic cells were also investigated. Mo-CBP3 is a chitin-binding protein of 18.0 kDa, according to SDS-PAGE. However, by mass spectrometry analysis, it was observed that this protein consists of multiple isoforms with molecular masses ranging between 12.2 and 12.3 kDa. Mo-CBP3 is composed by two polypeptide chains of 5.0 and 9.0 kDa, named A and B chain, respectively. The B chain contains the following NH2-terminal sequence CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ while the A chain has a blocked NH2-terminal residue. cDNA encoding the B chain was obtained with primers of its NH2-terminal sequence. In silico analyses of nucleotide and deduced amino acid sequences confirmed the presence of isoforms and molecular mass of Mo-CBP3 and identified potential sites of O-glicosylation and phosphorilation. Moreover, similarities between Mo-CBP3 and other M. oleifera proteins as well as 2S albumins were detected. The secondary structure of Mo-CBP3 showed 30.3% α-helices, 16.3% β-sheets, 22.3% turns and 30.4% unordered forms. In the fluorescence spectroscopy, excitation of Mo-CBP3 solution at 280 nm and 295 nm gave emission maxima at 303 and 309 nm, respectively. The Mo-CBP3 structure is highly stable and retains its antifungal activity regardless of temperature and pH. Mo-CBP3 (0.05-0.1 mg/mL) was able to inhibit the conidia germination of several phytopathogenic fungi, including F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae and C. gloeosporioides. Similarly, Mo-CBP3 was inhibitory to the mycelial mass development of F. solani at 0.05 mg/mL and has both fungistatic and fungicidal effects, depending on the concentration used. Binding of Mo-CBP3 to the fungal cell surface is achieved, at least in part, via electrostatic interactions, as 150 mM NaCl abolished its inhibitory effect. Mo-CBP3 induced the production of reactive oxygen species and caused in F. solani cells a marked loss of asymmetry, deformations and deep wrinkles in comparison to control cells. Disorganisation of the endomembrane system and condensation and shrinkage of cytosol with increased vacuolation and the loss of normal structure and content were also observed. Mo-CBP3 did not show haemolytic activity and it was not capable to alter de viability of both MCF-7 and Caco-2 cells, suggesting that this protein is not toxic for human cells. Based on its high stability and broad-spectrum efficacy against important phytopathogenic fungi at low inhibitory concentrations and absence of cytotoxicity to human cells, Mo-CBP3 has great potential in the development of new antifungal drugs or in transgenic crops with enhanced resistance to fungi.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Mo-CBP4 à uma proteÃna ligante à quitina, com atividade anti-inflamatÃria e antinociceptiva, isolada de sementes de Moringa oleifera Lamarck, uma Ãrvore conhecida pelo seu valor medicinal. Este trabalho teve como objetivo a caracterizaÃÃo estrutural, farmacolÃgica e toxicolÃgica de Mo-CBP4, com foco na sua utilizaÃÃo como agente terapÃutico. Mo-CBP4 à um heterodÃmero de 11,8 kDa, composto por cadeias de 3,9 kDa e 8,4 kDa. O sequenciamento de Mo-CBP4 por degradaÃÃo de Edman e espectrometria de massas mostrou a presenÃa de muitos resÃduos de aminoÃcidos bÃsicos e alta similaridade com proteÃnas isoladas de sementes de M. oleifera. AnÃlises espectroscÃpicas utilizando dicroÃsmo circular demonstraram que Mo-CBP4 à composta por α-hÃlices (36%), folhas-β (15%), voltas (19%) e estruturas ao acaso (30%), com alta estabilidade estrutural frente a variaÃÃes de temperatura e pH. Mo-CBP4 (0,1, 1,0 e 10 mg/kg), por via endovenosa, mostrou atividade anti-inflamatÃria no modelo de peritonite induzida por carragenina em ratos, com inibiÃÃo (79%) da migraÃÃo de neutrÃfilos jà na menor dose. Atividade anti-inflamatÃria de Mo-CBP4 (40 mg/kg) tambÃm ocorreu por via oral em camundongos, usando o mesmo modelo citado, com significativa inibiÃÃo (48%) da migraÃÃo de neutrÃfilos. Tal atividade permaneceu mesmo apÃs aquecimento da proteÃna a 100 ÂC por 1 hora, porÃm, a prÃ-incubaÃÃo com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi capaz de reverter sua aÃÃo. Os nÃveis sÃricos de IL-1β e IL-10, apÃs induÃÃo de peritonite, sofreram alteraÃÃo com o prÃ-tratamento da proteÃna. Adicionalmente, Mo-CBP4 (10 mg/kg) mostrou atividade antinociceptiva, verificada atravÃs do teste da formalina (2,5%), quando administrada via intraperitoneal, inibindo apenas a dor perifÃrica. No modelo de hipernocicepÃÃo mecÃnica induzida por carragenina, animais tratados via oral com a proteÃna (20, 40 e 80 mg/kg), 1 hora antes do agente inflamatÃrio, mostraram-se mais resistentes à sensibilizaÃÃo apÃs 1, 3 e 5 horas, apresentando inibiÃÃo mÃxima na dose de 40 mg/kg, estando essa atividade relacionada com a reduÃÃo da migraÃÃo de neutrÃfilos. A hipernocicepÃÃo direta causada por PGE2 ou epinefrina nÃo sofreu alteraÃÃo com o prÃ-tratamento de Mo-CBP4. A proteÃna tambÃm nÃo causou comprometimento na atividade locomotora dos animais, quando submetidos ao teste do campo aberto. A administraÃÃo oral de Mo-CBP4 em dose Ãnica (2000 mg/kg) ou em doses repetidas (10, 40 e 100 mg/kg) nÃo resultou em efeitos tÃxicos ou adversos. Similarmente, avaliaÃÃo da citotoxicidade e genotoxicidade de Mo-CBP4, utilizando cÃlulas tumorais ou normais, mostrou ausÃncia de toxicidade. Os resultados obtidos sugerem que devido Ãs propriedades anti-inflamatÃria e antinociceptiva, alta estabilidade e aparente ausÃncia de toxicidade, Mo-CBP4 possui grande potencial como um futuro biofÃrmaco. / Mo-CBP4 is a chitin-binding protein that is associated with the antinociceptive and anti-inflammatory effects of Moringa oleifera seeds, a tree known for its medicinal value. The aim of this study was the structural, pharmacological and toxicological characterization of Mo-CBP4, focusing on its use as a therapeutic agent. Mo-CBP4 is a 11.8 kDa heterodimer, composed by 3.9 kDa and 8.4 kDa chains. Mo-CBP4 sequencing by Edman degradation and mass spectrometry showed the presence of many basic amino acid residues and high similarity with other proteins from M. oleifera seeds. Circular dichroism spectroscopy showed that the Mo-CBP4 contains 36% α-helix, 15% β-sheet, 19% turn and 30% unordered and high structural stability to temperature and pH variations. Mo-CBP4 (0.1, 1.0 and 10 mg/kg) by intravenous administration showed anti-inflammatory activity on the model of carrageenan-induced peritonitis in rats, with inhibition (79%) of neutrophil migration already at the lowest dose. Mo-CBP4 (40 mg/kg), when administered by oral route on mice, using the same mentioned model, also presented anti-inflammatory activity, causing a significant inhibition (48%) of neutrophil migration. Mo-CBP4 retained this activity even after heating at 100 ÂC or pre-incubation with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine, both for 1 hour. Serum levels of IL-1β and IL-10 after peritonitis induction changed in Mo-CBP4-pretreated mice. In addition, Mo-CBP4 (10 mg/kg), administered intraperitoneally, also showed antinociceptive activity by using the formalin (2.5%) test in mice model, inhibiting just the peripheral pain. In the carrageenan-induced mechanical hypernociception model, animals pretreated with oral Mo-CBP4 (20, 40 and 80 mg/kg), 1 hour prior to inflammatory agent use, proved to be more resistant to sensitization after 1, 3 and 5 hours, with maximal inhibition at a dose of 40 mg/kg, being this activity correlated with the reduction of neutrophil migration. Direct hypernociception caused by epinephrine or PGE2 was not affected with Mo-CBP4 pretreatment. Mo-CBP4 did not impair the locomotor activity of animals in the open field test. In general, no toxic signs or adverse effects were seen after oral administration of Mo-CBP4 at a single dose (2000 mg/kg) or after repeated doses (10, 40 and 100 mg/kg). Similarly, cytotoxicity and genotoxicity tests with Mo-CBP4, using tumour or normal cells, showed no toxicity. The results suggest that due to anti-inflammatory and antinociceptive properties, high stability and apparent lack of toxicity, Mo-CBP4 has great potential as a future biopharmaceutical drug.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera Lam. à uma Ãrvore conhecida pelo seu valor medicinal, uma vez que extratos de todas as partes desta planta mostraram propriedades farmacolÃgicas reconhecidas pelo uso popular e corroboradas pela comunidade cientÃfica. Dentre as atividades farmacolÃgicas, destacam-se Ãquelas relacionadas a processos inflamatÃrios. Este trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterizaÃÃo de uma proteÃna ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera e avaliaÃÃo de suas atividades antinociceptiva e anti-inflamatÃria. As proteÃnas foram extraÃdas da farinha delipidada de sementes e o extrato total foi fracionado em albuminas e globulinas. A fraÃÃo albumÃnica foi submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A fraÃÃo ligante à quitina eluÃda com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi submetida à cromatografia de troca iÃnica acoplada a um sistema de FPLC, rendendo cinco picos protÃicos. O material eluÃdo com tampÃo acetato de sÃdio 0,5 M, pH 5,2, contendo NaCl 0,6 M, denominado Mo-CBP4 (Mo â Moringa oleifera; âCBP â âchitin binding proteinâ), teve um rendimento final de 0,54% e foi escolhido para dar continuidade ao trabalho. Mo-CBP4 apresentou-se como duas bandas protÃicas de massas moleculares aparentes de 27,5 e 16,5 kDa, em condiÃÃes nÃo-redutoras, e de 9,8 kDa em condiÃÃes redutoras. Eletroforese bidimensional desta proteÃna revelou a presenÃa de dois spots (18,7 e 13,4 kDa), com mesmo ponto isoelÃtrico (pI de 10,55). Trata-se de uma glicoproteÃna com 2,85% de carboidratos, nÃo apresentando atividade hemaglutinante. Mo-CBP4 mostrou-se tÃo eficiente quanto o sulfato de alumÃnio e potÃssio na capacidade de coagular material em suspensÃo na Ãgua. A proteÃna em questÃo foi resistente à proteÃlise no teste de digestibilidade in vitro utilizando pepsina, tripsina e quimotripsina. Para avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatÃrio de Mo-CBP4, foi utilizado o modelo de contorÃÃes abdominais induzidas pela injeÃÃo de Ãcido acÃtico 0,8% (via i.p.) em camundongos. A proteÃna, nas doses de 1,0, 3,5 e 10 mg/kg, foi capaz de prevenir as contorÃÃes de maneira dose dependente, chegando a 98,9% de inibiÃÃo na dose de 10 mg/kg. Mo-CBP4 tambÃm apresentou atividade antinociceptiva por via oral (10 mg/kg), atingindo uma inibiÃÃo de 52,9% quando administrada 60 minutos antes da injeÃÃo de Ãcido acÃtico. Mo-CBP4 inibiu o aumento da permeabilidade vascular (89,1%) e a migraÃÃo leucocitÃria (60,9%) na dose de 10 mg/kg via i.p. A propriedade antinociceptiva parece ser independente do sÃtio de interaÃÃo ao carboidrato N-acetil-D-glucosamina, enquanto que a atividade anti-inflamatÃria mostrou um decrÃscimo quando a regiÃo de ligaÃÃo ao carboidrato foi bloqueada. Os resultados apresentados suportam cientificamente o uso popular da M. oleifera e mostram que uma proteÃna ligante à quitina, Mo-CBP4, està associada aos efeitos antinociceptivo e anti-inflamatÃrio das sementes / Moringa oleifera Lam. is a perennial multipurpose tree with a strong scientific evidence of its curative power and used in folk medicine to cure several inflammatory processes. This work aimed to isolate and characterize a chitin-binding protein from Moringa oleifera seeds, and evaluate its antinociceptive and anti-inflammatory effects. Chitin-binding proteins were obtained after application of albumin fraction from crude extract of M. oleifera seeds into a chitin column and the adsorbed fraction was applied in a Resource-S matrix attached to FPLC system. The fraction eluted with 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.2, containing 0.6 M NaCl, named Mo-CBP4 was used for the experiment. Mo-CBP4 showed a single band on SDS-PAGE (molecular mass 9.8 kDa) in presence of reducing agent, however in the absence of 2-mercaptoethanol two bands corresponding to 27.5 and 16.5 kDa were observed. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (18.7 and 13.4 kDa), with the same isoeletric point value corresponding to 10.55. Mo-CBP4 is a glycoprotein containing 2.85% neutral sugar, which failed to agglutinate untreated or trypsin-treated erythrocytes from rabbit or human origin. This protein showed coagulant activity, similar to aluminum and potassium sulfate, the coagulant most widely used in water treatment. Mo-CBP4 was subjected to in vitro digestion with pepsin, trypsin, or chymotrypsin and appeared to be markedly resistant to digestion. Acetic acid-induced abdominal constrictions, increase in vascular permeability and leukocyte migration tests were used for the antinociceptive and anti-inflammatory activities assessment. Mo-CBP4 (1.0, 3.5 and 10 mg/kg) into mice potently and significantly reduced the occurrence of abdominal writhing in a dose dependent manner by 18.9, 44.6% and 98.9%, respectively. In addition, the oral administration of the protein (10 mg/kg) resulted in 18% and 52.9% reductions in abdominal writhing when given 30 and 60 min prior to acetic acid administration, respectively. Mo-CBP4 also caused a significant and dose-dependent inhibition of peritoneal capillary permeability induced by acid acetic and significantly inhibited leukocyte accumulation in the peritoneal cavity. The effect antinociceptive appeared to be independent on the carbohydrate recognition site. However the anti-inflammatory activity was partially reversed when Mo-CBP4 was pre-incubated with specific carbohydrate ligand, showing that this effect is dependent on the carbohydrate recognition site