Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Brazil is one of the largest producers of cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.], a very important legume for human dietary protein and carbohydrate supply. Nevertheless, there are some factors which limit its productivity and utilization. The insect Callosobuchus maculatus (cowpea weevil) is considered the principal pest that attacks stored grains. In the Northeast of Brazil, breeding efforts involving cowpea have been directed towards the selection of high yielding varieties associated with traits of resistance to diseases and pests. However, studies on the nutritional quality of these improved genotypes are scanty. In this study, the research was conducted with two cowpea genotypes, BR9 Longà e IT81D 1053, susceptible and resistant to cowpea weevil, respectively, to evaluate whether the probable factors related to the resistance would interfere with the nutritional value. Proximate composition showed that both genotypes are good sources of proteins (23.45 and 26.61 g/100 g dry matter), carbohydrates (61.62 and 62.94 g/100 g dry matter) and crude fiber (4.32 and 5.20 g/100 g dry matter), presenting low contents of oil (3.30 and 3.89 g/100 g dry matter). Polyacrylamide gel electrophoresis of the seed flours showed similar patterns for both genotypes, except for the presence of a very prominent 29 kDa band in the resistant genotype. The presence of antinutritional factors such as lectin, urease and trypsin inhibitor was detected in both cowpea genotypes. Lectin (0.10 UH/mgF) and urease (25.13 and 25.41 U/gF) amounts were similar in the susceptible and resistant genotypes. The resistant genotype presented a higher content of trypsin inhibitor (18.55 mg trypsin inhibited/gF) than the susceptible one (12.57 mg trypsin inhibited/gF). Feeding trial conducted with rats fed the experimental diets containing seed flour of BR9 Longà and IT81D 1053 as the sole protein source, at 10% level, were not sufficient to promote animal growth compared to the animals fed the high quality diet containing egg white. However, when compared the treatments containing susceptible and resistant cowpea genotypes most of parameters analyzed were similar. Diets containing the chitin binding proteins (CBP), purified from susceptible and resistant cowpea genotypes and complemented / O Brasil à um dos grandes produtores de feijÃo caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.], uma importante leguminosa para consumo humano por ser boa fonte proteÃnas e carboidratos. Todavia, hà vÃrios fatores que limitam a produtividade e utilizaÃÃo dessa cultura, destacando-se o ataque pelo inseto Callosobruchus maculatus (gorgulho), conhecido como uma das principais pragas de armazenamento. No Nordeste do Brasil, genÃtipos de feijÃo caupi foram criados atravÃs de melhoramento genÃtico, visando aumento da produtividade e resistÃncia a doenÃas e pragas. PorÃm, à detectada a escassez de informaÃÃes relacionando resistÃncia e valor nutricional. Assim sendo, no presente estudo, dois genÃtipos melhorados geneticamente, BR9 Longà e IT81D 1053, suscetÃvel e resistente ao gorgulho, respectivamente, foram selecionados, para verificar se as alteraÃÃes promovidas pelo melhoramento afetariam sua qualidade nutricional. Os dados de composiÃÃo centesimal mostraram que ambos os genÃtipos constituem-se em boa fonte de proteÃnas (23,45 e 26,61 g/100 g de matÃria seca), carboidratos (61,62 e 62,94 g/100 g de matÃria seca) e fibra bruta (4,32 e 5,20 g/100 g de matÃria seca), apresentando baixos conteÃdos de lipÃdios (3,30 e 3,89 g/100 g de matÃria seca). Os perfis eletroforÃticos da farinha de sementes dos dois genÃtipos mostraram-se muito semelhantes entre si, exceto a existÃncia de uma banda mais proeminente na regiÃo de 29 kDa verificada no genÃtipo resistente. Fatores antinutricionais tais como lectina, urease e inibidor de tripsina foram verificados nos dois genÃtipos de feijÃo caupi avaliados. Os teores de lectina (0,10 UH/mgF) e de urease (25,13 e 25,41 U/gF) se mostraram bem similares nos genÃtipos suscetÃvel e resistente. Jà os conteÃdos de inibidor de tripsina foram diferentes, tendo o genÃtipo resistente apresentado maior atividade (18,55 mg de tripsina inibida/gF) em comparaÃÃo ao suscetÃvel (12,57 mg de tripsina inibida/gF). Farinhas dos genÃtipos BR9 Longà e IT81D 1053, quando incluÃdas em dietas para ratos como Ãnica fonte protÃica, a 10%, nÃo foram capazes de promover o crescimento dos animais de forma similar à albumina da clara do ovo (proteÃna padrÃo). Todavia, quando comparado o tratamento AvaliaÃÃo da BiosseguranÃa Alimentar de GenÃtipos... contendo farinha do genÃtipo suscetÃvel com aquele contendo o genÃtipo resistente, para a maioria dos parÃmetros analisados, as respostas foram bem parecidas. Dietas contendo proteÃnas ligantes à quitina (PLQ), purificadas do genÃtipo suscetÃvel e do resistente, complementadas com albumina da clara do ovo, apresentaram valor nutricional igual ou superior ao padrÃo (somente clara do ovo). Diante dos parÃmetros analisados, os resultados permitem concluir que o melhoramento genÃtico do feijÃo caupi, o qual conferiu resistÃncia ao Callosobruchus maculatus, nÃo foi capaz de alterar a qualidade nutricional dessa leguminosa. AlÃm disso, diferentemente ao verificado com o Callosobruchus maculatus, nÃo foram observados efeitos antinutricionais, tÃxicos e/ou alergÃnicos para os animais testados (ratos e camundongos), associados ao consumo das PLQ provenientes do genÃtipo suscetÃvel ou do resistente

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera Lam. à uma planta originÃria do Noroeste da Ãndia, bem adaptada Ãs regiÃes tropicais. De suas sementes foi isolada uma nova proteÃna ligante à quitina, a Mo-CBP3, com propriedades coagulantes e atividade antifÃngica contra o fitopatÃgeno Fusarium solani. As proteÃnas foram extraÃdas da farinha delipidada de sementes com o tampÃo Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M. O teor mÃdio de proteÃna da farinha correspondeu a 216,44 mgP/gF. O extrato total foi fracionado em albuminas e globulinas por diÃlise contra Ãgua seguida de centrifugaÃÃo. As albuminas foram concentradas com sulfato de amÃnio a 90% de saturaÃÃo. A F0-90% foi submetida à cromatografia de afinidade em coluna de quitina, previamente equilibrada com o tampÃo de extraÃÃo. Foram obtidos um pico nÃo retido e dois picos retidos, correspondentes Ãs proteÃnas ligantes à quitina (CBP). O primeiro destes foi eluÃdo com soluÃÃo de N-acetil-D-glucosamina 0,1 M (PNAG), e o segundo, com Ãcido acÃtico 0,05 M, pH 3,0 (PAC). PNAG foi aplicado em coluna de troca catiÃnica, Resource S, acoplada a um sistema de FPLC, equilibrada com tampÃo acetato de sÃdio 0,05 M, pH 5,2. Dos picos obtidos, o terceiro correspondeu à proteÃna Mo-CBP3 - eluÃda com 0,5 M de NaCl no tampÃo de equilÃbrio. O teor protÃico mÃdio calculado para a proteÃna purificada Mo-CBP3 foi de 1,17 mgP/gF, representando um rendimento final de 0,54% das proteÃnas do extrato total. A massa molecular aparente por SDS-PAGE foi de 18,0 kDa sem o agente redutor e, de 9,0 kDa, na presenÃa deste. O resultado sugere que Mo-CBP3 seja uma proteÃna dimÃrica formada de subunidades idÃnticas, unidas por pontes dissulfeto. A massa molecular de Mo-CBP3, por cromatografia de exclusÃo molecular, foi de 14,34 kDa, e o pI de 10,8. Trata-se de uma glicoproteÃna com 2,5% de carboidratos, que nÃo apresenta atividade hemaglutinante ou quitinÃsica. Sua seqÃÃncia NH2-Terminal obtida foi CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, com 22 aminoÃcidos, confirmando sua caracterÃstica bÃsica. Mo-CBP3 mostrou-se tÃo eficiente quanto o AlK(SO4)2 na capacidade de coagular matÃria em suspensÃo na Ãgua. Mo-CBP3 foi fungicida para esporos de Fusarium solani a 0,1 mg/mL. O aquecimento da proteÃna a 98 ÂC, por 1 h, e a prÃ-incubaÃÃo com o aÃÃcar N-acetil-D-glucosamina, nÃo reverteram sua aÃÃo. Mo-CBP3 mostrou-se capaz de retardar o crescimento micelial do fungo ainda na menor dose testada, 0,05 mg/mL. Mo-CBP3 à inativa contra o oomiceto Pythium oligandrum, que apresenta celulose no lugar da quitina na parede celular. A proteÃna foi, ainda, capaz de inibir cerca de 80% da acidificaÃÃo do meio, por esporos de F. solani, induzida por glicose, o que sugere a influÃncia de Mo-CBP3 sobre as bombas de prÃtons (H+ATPases) presentes na membrana celular dos esporos deste fungo. / Moringa oleifera Lam. is native from Northwest India, well adapted to tropical regions. From its seeds it was isolated a new chitin binding protein, Mo-CBP3, which has coagulant properties and antifungal activity against the phytopathogen Fusarium solani. Proteins were extracted from defatted seeds flour by 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 0.15 M NaCl. The average protein content of the flour was 216.44 mgP/gF. The crude extract was fractionated in albumins and globulins by dialysis and centrifugation. Albumins were concentrated by 90% ammonium sulfate saturation. This fraction was applied into a chitin column, previously equilibrated with the same buffer. An unadsorbed and two adsorbed peaks were obtained. The first adsorbed peak was eluted with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine (PNAG), and the second one, with 0.05 M acetic acid, pH 3.0 (PAC). PNAG was applied into a cation exchange column, Resource S, equilibrated with 0.05 M sodium acetate buffer, pH 5.2. The third peak corresponded to Mo-CBP3 â eluted with 0.5 M NaCl in equilibrium buffer. The protein content of Mo- CBP3 was 1.17 mgP/gF. It represents a final yield of 0.54% of crude extract proteins. Apparent molecular mass by SDS-PAGE was 18.0 kDa in the absence of β-ME, and 9.0 kDa, in its presence. Results suggest that Mo-CBP3 is a dimeric protein, made of identical subunits, linked by disulfide bonds. By molecular exclusion chromatography, calculated molecular mass was 14.34 kDa, pI 10.8. Mo-CBP3 is a glycoprotein with 2.5% of carbohydrates, which has not hemagglutinating or chitinase activities. Its NH2- terminal sequence was CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, with 22 amino acids, conffirming its basic character. Mo-CBP3 was as efficient as AlK(SO4)2 in the capacity of coagulating suspended material in water. Mo-CBP3 (0.1 mg/mL) was fungicide to Fusarium solani spores. Heat treatment of the protein at 98 ÂC, du ring 1 h, and pre incubation with N-acetyl-D-glucosamine, did not reverse its action. Mo-CBP3 was able to retard the mycelial growth of the fungus even at the lowest tested dose of 0.05 mg/mL. Mo-CBP3 was inactive against the oomycete Pythium oligandrum, which has cellulose in spite of chitin in cell wall. Protein was also able to inhibit about 80% of medium acidification, induced by glucose, by F. solani spores, that suggests the influence of Mo-CBP3 over the proton pumps (H+ATPases) present in cellular membranes of F. solani spores.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Mo-CBP4 à uma proteÃna ligante à quitina, com atividade anti-inflamatÃria e antinociceptiva, isolada de sementes de Moringa oleifera Lamarck, uma Ãrvore conhecida pelo seu valor medicinal. Este trabalho teve como objetivo a caracterizaÃÃo estrutural, farmacolÃgica e toxicolÃgica de Mo-CBP4, com foco na sua utilizaÃÃo como agente terapÃutico. Mo-CBP4 à um heterodÃmero de 11,8 kDa, composto por cadeias de 3,9 kDa e 8,4 kDa. O sequenciamento de Mo-CBP4 por degradaÃÃo de Edman e espectrometria de massas mostrou a presenÃa de muitos resÃduos de aminoÃcidos bÃsicos e alta similaridade com proteÃnas isoladas de sementes de M. oleifera. AnÃlises espectroscÃpicas utilizando dicroÃsmo circular demonstraram que Mo-CBP4 à composta por α-hÃlices (36%), folhas-β (15%), voltas (19%) e estruturas ao acaso (30%), com alta estabilidade estrutural frente a variaÃÃes de temperatura e pH. Mo-CBP4 (0,1, 1,0 e 10 mg/kg), por via endovenosa, mostrou atividade anti-inflamatÃria no modelo de peritonite induzida por carragenina em ratos, com inibiÃÃo (79%) da migraÃÃo de neutrÃfilos jà na menor dose. Atividade anti-inflamatÃria de Mo-CBP4 (40 mg/kg) tambÃm ocorreu por via oral em camundongos, usando o mesmo modelo citado, com significativa inibiÃÃo (48%) da migraÃÃo de neutrÃfilos. Tal atividade permaneceu mesmo apÃs aquecimento da proteÃna a 100 ÂC por 1 hora, porÃm, a prÃ-incubaÃÃo com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi capaz de reverter sua aÃÃo. Os nÃveis sÃricos de IL-1β e IL-10, apÃs induÃÃo de peritonite, sofreram alteraÃÃo com o prÃ-tratamento da proteÃna. Adicionalmente, Mo-CBP4 (10 mg/kg) mostrou atividade antinociceptiva, verificada atravÃs do teste da formalina (2,5%), quando administrada via intraperitoneal, inibindo apenas a dor perifÃrica. No modelo de hipernocicepÃÃo mecÃnica induzida por carragenina, animais tratados via oral com a proteÃna (20, 40 e 80 mg/kg), 1 hora antes do agente inflamatÃrio, mostraram-se mais resistentes à sensibilizaÃÃo apÃs 1, 3 e 5 horas, apresentando inibiÃÃo mÃxima na dose de 40 mg/kg, estando essa atividade relacionada com a reduÃÃo da migraÃÃo de neutrÃfilos. A hipernocicepÃÃo direta causada por PGE2 ou epinefrina nÃo sofreu alteraÃÃo com o prÃ-tratamento de Mo-CBP4. A proteÃna tambÃm nÃo causou comprometimento na atividade locomotora dos animais, quando submetidos ao teste do campo aberto. A administraÃÃo oral de Mo-CBP4 em dose Ãnica (2000 mg/kg) ou em doses repetidas (10, 40 e 100 mg/kg) nÃo resultou em efeitos tÃxicos ou adversos. Similarmente, avaliaÃÃo da citotoxicidade e genotoxicidade de Mo-CBP4, utilizando cÃlulas tumorais ou normais, mostrou ausÃncia de toxicidade. Os resultados obtidos sugerem que devido Ãs propriedades anti-inflamatÃria e antinociceptiva, alta estabilidade e aparente ausÃncia de toxicidade, Mo-CBP4 possui grande potencial como um futuro biofÃrmaco. / Mo-CBP4 is a chitin-binding protein that is associated with the antinociceptive and anti-inflammatory effects of Moringa oleifera seeds, a tree known for its medicinal value. The aim of this study was the structural, pharmacological and toxicological characterization of Mo-CBP4, focusing on its use as a therapeutic agent. Mo-CBP4 is a 11.8 kDa heterodimer, composed by 3.9 kDa and 8.4 kDa chains. Mo-CBP4 sequencing by Edman degradation and mass spectrometry showed the presence of many basic amino acid residues and high similarity with other proteins from M. oleifera seeds. Circular dichroism spectroscopy showed that the Mo-CBP4 contains 36% α-helix, 15% β-sheet, 19% turn and 30% unordered and high structural stability to temperature and pH variations. Mo-CBP4 (0.1, 1.0 and 10 mg/kg) by intravenous administration showed anti-inflammatory activity on the model of carrageenan-induced peritonitis in rats, with inhibition (79%) of neutrophil migration already at the lowest dose. Mo-CBP4 (40 mg/kg), when administered by oral route on mice, using the same mentioned model, also presented anti-inflammatory activity, causing a significant inhibition (48%) of neutrophil migration. Mo-CBP4 retained this activity even after heating at 100 ÂC or pre-incubation with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine, both for 1 hour. Serum levels of IL-1β and IL-10 after peritonitis induction changed in Mo-CBP4-pretreated mice. In addition, Mo-CBP4 (10 mg/kg), administered intraperitoneally, also showed antinociceptive activity by using the formalin (2.5%) test in mice model, inhibiting just the peripheral pain. In the carrageenan-induced mechanical hypernociception model, animals pretreated with oral Mo-CBP4 (20, 40 and 80 mg/kg), 1 hour prior to inflammatory agent use, proved to be more resistant to sensitization after 1, 3 and 5 hours, with maximal inhibition at a dose of 40 mg/kg, being this activity correlated with the reduction of neutrophil migration. Direct hypernociception caused by epinephrine or PGE2 was not affected with Mo-CBP4 pretreatment. Mo-CBP4 did not impair the locomotor activity of animals in the open field test. In general, no toxic signs or adverse effects were seen after oral administration of Mo-CBP4 at a single dose (2000 mg/kg) or after repeated doses (10, 40 and 100 mg/kg). Similarly, cytotoxicity and genotoxicity tests with Mo-CBP4, using tumour or normal cells, showed no toxicity. The results suggest that due to anti-inflammatory and antinociceptive properties, high stability and apparent lack of toxicity, Mo-CBP4 has great potential as a future biopharmaceutical drug.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera Lam. à uma Ãrvore conhecida pelo seu valor medicinal, uma vez que extratos de todas as partes desta planta mostraram propriedades farmacolÃgicas reconhecidas pelo uso popular e corroboradas pela comunidade cientÃfica. Dentre as atividades farmacolÃgicas, destacam-se Ãquelas relacionadas a processos inflamatÃrios. Este trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterizaÃÃo de uma proteÃna ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera e avaliaÃÃo de suas atividades antinociceptiva e anti-inflamatÃria. As proteÃnas foram extraÃdas da farinha delipidada de sementes e o extrato total foi fracionado em albuminas e globulinas. A fraÃÃo albumÃnica foi submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A fraÃÃo ligante à quitina eluÃda com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi submetida à cromatografia de troca iÃnica acoplada a um sistema de FPLC, rendendo cinco picos protÃicos. O material eluÃdo com tampÃo acetato de sÃdio 0,5 M, pH 5,2, contendo NaCl 0,6 M, denominado Mo-CBP4 (Mo â Moringa oleifera; âCBP â âchitin binding proteinâ), teve um rendimento final de 0,54% e foi escolhido para dar continuidade ao trabalho. Mo-CBP4 apresentou-se como duas bandas protÃicas de massas moleculares aparentes de 27,5 e 16,5 kDa, em condiÃÃes nÃo-redutoras, e de 9,8 kDa em condiÃÃes redutoras. Eletroforese bidimensional desta proteÃna revelou a presenÃa de dois spots (18,7 e 13,4 kDa), com mesmo ponto isoelÃtrico (pI de 10,55). Trata-se de uma glicoproteÃna com 2,85% de carboidratos, nÃo apresentando atividade hemaglutinante. Mo-CBP4 mostrou-se tÃo eficiente quanto o sulfato de alumÃnio e potÃssio na capacidade de coagular material em suspensÃo na Ãgua. A proteÃna em questÃo foi resistente à proteÃlise no teste de digestibilidade in vitro utilizando pepsina, tripsina e quimotripsina. Para avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatÃrio de Mo-CBP4, foi utilizado o modelo de contorÃÃes abdominais induzidas pela injeÃÃo de Ãcido acÃtico 0,8% (via i.p.) em camundongos. A proteÃna, nas doses de 1,0, 3,5 e 10 mg/kg, foi capaz de prevenir as contorÃÃes de maneira dose dependente, chegando a 98,9% de inibiÃÃo na dose de 10 mg/kg. Mo-CBP4 tambÃm apresentou atividade antinociceptiva por via oral (10 mg/kg), atingindo uma inibiÃÃo de 52,9% quando administrada 60 minutos antes da injeÃÃo de Ãcido acÃtico. Mo-CBP4 inibiu o aumento da permeabilidade vascular (89,1%) e a migraÃÃo leucocitÃria (60,9%) na dose de 10 mg/kg via i.p. A propriedade antinociceptiva parece ser independente do sÃtio de interaÃÃo ao carboidrato N-acetil-D-glucosamina, enquanto que a atividade anti-inflamatÃria mostrou um decrÃscimo quando a regiÃo de ligaÃÃo ao carboidrato foi bloqueada. Os resultados apresentados suportam cientificamente o uso popular da M. oleifera e mostram que uma proteÃna ligante à quitina, Mo-CBP4, està associada aos efeitos antinociceptivo e anti-inflamatÃrio das sementes / Moringa oleifera Lam. is a perennial multipurpose tree with a strong scientific evidence of its curative power and used in folk medicine to cure several inflammatory processes. This work aimed to isolate and characterize a chitin-binding protein from Moringa oleifera seeds, and evaluate its antinociceptive and anti-inflammatory effects. Chitin-binding proteins were obtained after application of albumin fraction from crude extract of M. oleifera seeds into a chitin column and the adsorbed fraction was applied in a Resource-S matrix attached to FPLC system. The fraction eluted with 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.2, containing 0.6 M NaCl, named Mo-CBP4 was used for the experiment. Mo-CBP4 showed a single band on SDS-PAGE (molecular mass 9.8 kDa) in presence of reducing agent, however in the absence of 2-mercaptoethanol two bands corresponding to 27.5 and 16.5 kDa were observed. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (18.7 and 13.4 kDa), with the same isoeletric point value corresponding to 10.55. Mo-CBP4 is a glycoprotein containing 2.85% neutral sugar, which failed to agglutinate untreated or trypsin-treated erythrocytes from rabbit or human origin. This protein showed coagulant activity, similar to aluminum and potassium sulfate, the coagulant most widely used in water treatment. Mo-CBP4 was subjected to in vitro digestion with pepsin, trypsin, or chymotrypsin and appeared to be markedly resistant to digestion. Acetic acid-induced abdominal constrictions, increase in vascular permeability and leukocyte migration tests were used for the antinociceptive and anti-inflammatory activities assessment. Mo-CBP4 (1.0, 3.5 and 10 mg/kg) into mice potently and significantly reduced the occurrence of abdominal writhing in a dose dependent manner by 18.9, 44.6% and 98.9%, respectively. In addition, the oral administration of the protein (10 mg/kg) resulted in 18% and 52.9% reductions in abdominal writhing when given 30 and 60 min prior to acetic acid administration, respectively. Mo-CBP4 also caused a significant and dose-dependent inhibition of peritoneal capillary permeability induced by acid acetic and significantly inhibited leukocyte accumulation in the peritoneal cavity. The effect antinociceptive appeared to be independent on the carbohydrate recognition site. However the anti-inflammatory activity was partially reversed when Mo-CBP4 was pre-incubated with specific carbohydrate ligand, showing that this effect is dependent on the carbohydrate recognition site