La vigne (Vitis vinifera) est sensible à de nombreuses maladies, nécessitant l'utilisation massive de produits phytosanitaires. Des méthodes alternatives doivent être développées. Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, les gènes AtNPR1, AtNDR1 et AtEDS1 interviennent dans la voie de signalisation contrôlée par l'acide salicylique (SA) en réponse aux agents pathogènes biotrophes. Nous avons identifié par une approche gène candidat chez V. vinifera, de potentiels orthologues de ces trois gènes (VvNPR1.1, VvNPR1.2, VvNHL1 et VvEDS1).Nos travaux ont montré que les protéines VvNPR1 fusionnées à la GFP sont localisées dans le noyau. De plus, la surexpression transitoire des VvNPR1 stimule l'expression de gènes de défense en système hétérologue et homologue. La surexpression de VvNPR1.1 chez le mutant npr1 restaure les différents phénotypes du mutant, contrairement à la surexpression de VvNPR1.2. VvNPR1.1 est semble être l'orthologue d'AtNPR1. La surexpression de VvNHL 1 chez le mutant ndr1 ne rétablit pas la résistance à Pseudomonas syringae. Cependant, ces plantes sont plus sensibles à Botrytis cinerea, probablement par l'accentuation d'un processus de mort cellulaire. L'expression de VvNHL 1 est réprimée en réponse à B. cinerea, constituant un mécanisme de défense contre les nécrotrophes. VvNHL1 semble donc promouvoir la mort cellulaire. L'expression de VvEDS1 est stimulée en réponse à des agents pathogènes et à un traitement par le SA. L'étude de sa fonction est en cours par surexpression chez des mutants eds1. La compréhension des voies de signalisation des réponses de défense chez la vigne devrait permettre l'obtention de vignes plus résistantes aux agents pathogènes. / Vitis vinifera is susceptible to many pathogens, thus requiring a massive use of phytochemicals. Alternative methods have to be developed. In the madel plant Arabidopsis thaliana, the AtNPR1, AtNDR1 and AtEDS1 genes are components of the salicylic acid (SA) signalling pathway involved in resistance to biotrophic pathogens. Using a candidate gene approach, we have identified putative orthologs of these genes in the grapevine genome (VvNPR1.1, VvNPR1.2, VvNHL 1 and VvEDS1).Our work shows thal VvNPR1-GFP fusion proteins are localized in the nucleus. Moreover, transient overexpression of VvNPR1 genes induces defence gene expression, in bath heterologous and homologous systems. Overexpression of VvNPR1.1 in npr1 mutants restores the different phenotypes of the mutants, while VvNPR1.2 overexpression does not. These results strongly suggest that VvNPR1.1 is the AtNPR1 ortholog. Overexpression of VvNHL 1 in ndr1 mutants does not restore resistance to Pseudomonas syringae. However, resistance to Botrytis cinerea in these plants is weakened, probably because of stimulation of cell death. Furthermore, VvNHL1 repression following B. cinerea infection in V. vinifera could be considered as a defence mechanism against necrotrophic pathogens and suggests thal VvNHL1 is involved in promotion of cell death. VvEDS1 expression is induced by pathogens infection and SA treatment. VvEDS1 functional characterization is in progress using eds1 Arabidopsis mutants overexpressing VvEDS1. Knowledge of defence signalling pathways in V. vinifera will contribute to obtain pathogen resistant grapevines.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A soja à uma das leguminosas mais utilizadas no mundo, sendo o uso justificado pelo elevado teor nutricional de seus grÃos, constituÃdos, principalmente, por proteÃnas e lipÃdios. A estimativa atual da produÃÃo mundial de soja à de 250.000 toneladas/ano, porÃm hà fatores limitantes dessa produÃÃo, como o ataque de pragas. As doenÃas causadas por fungos, por exemplo, causam na soja perdas em torno de 4%, sendo 20% destas causadas por Septoria glycines e Cercospora kikuchii. Assim, a busca por medidas alternativas de controle à crescente, particularmente em diminuiÃÃo ao uso de agrotÃxicos, mas, para isso, à importante o entendimento dos mecanismos de defesa vegetal. Das sementes de soja foi purificada uma proteÃna, denominada toxina da soja (SBTX), que à ativa contra diversos fungos de plantas e do homem e, tambÃm, à neurotÃxica para ratos e camundongos, razÃo pela qual recebeu o nome de toxina. A SBTX apresenta massa molecular de 44 kDa, constituÃda por duas subunidades (17 e 27 kDa) codificadas por genes distintos e jà foi identificada nas sementes, raÃzes, caules e folhas. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o perfil de expressÃo gÃnica da SBTX em plantas cujas folhas primÃrias foram tratadas com elicitores (biÃtico e abiÃtico), usando a tÃcnica de PCR em tempo real, na tentativa de reforÃar o papel fisiolÃgico de defesa proposto para proteÃna. Assim sendo, Ãcido salicÃlico, injÃria mecÃnica e esporos do fungo Cercospora kikuchii foram utilizados como elicitores e os nÃveis de transcritos para as duas subunidades proteicas de SBTX avaliados. Respostas de induÃÃo foram verificadas para ambas as subunidades da SBTX, porÃm os perfis de expressÃo gÃnica foram diferenciados. Para o gene SBTX 27 kDa, o maior nÃvel de transcritos foi detectado quando o tratamento envolveu injÃria mecÃnica associada ao Ãcido salicÃlico, correspondendo a um aumento de cerca de 100 vezes apÃs 12 horas de aplicaÃÃo do tratamento. Jà para o gene SBTX 17 kDa este aumento nÃo foi verificado na mesma intensidade, tendo sido apenas em torno de 10 vezes. Os dados em conjunto mostram que SBTX à uma proteÃna passÃvel de induÃÃo por elicitores biÃticos e abiÃticos, reforÃando o seu papel fisiolÃgico de defesa, podendo vir a ser utilizada como ferramenta biotecnolÃgica no sentido de amenizar as perdas causadas por fungos. / Soybean is a legume most commonly utilized in the world, whose use is justified by the high nutritional content of its grain, consisting mainly of proteins and lipids. The current estimate of global soybean production is 250,000 tons/year, but there are limiting factors of this production, such as the pest attack. The fungal diseases, for example, cause losses in soybeans around 4%, where 20% of these are derived from infection by Septoria glycines and Cercospora kikuchii. Thus, the search for alternative measures is increasing, particularly in reducing the use of pesticides, but for this it is important to understand the plant defense mechanisms. Soybean toxin (SBTX) is a protein purified from soybean seeds with activity against plant and human pathogenic fungi and neurotoxic action to rats and mice, hence the reason it received the name of toxin. SBTX shows a molecular mass of 44 kDa, composed of two subunits (17 and 27 kDa) encoded by distinct genes and it has been detected seeds, roots, stems and leaves. This study aimed to evaluate the gene expression profile of SBTX in soybean plants whose primary leaves were treated with elicitors (biotic and abiotic), using the real-time PCR technique, in an attempt to strength the physiological role of defense proposed for this protein. Therefore, salicylic acid, mechanic injury and Cercospora kikuchii spores were used as elicitors and it was measured the transcript levels of SBTX subunits. Induction responses were observed for both subunits of SBTX, but the gene expression profiles were different. For SBTX 27 kDa gene, the highest transcript level was detected when the treatment involved mechanic injury associated to salicylic acid, an increase of about 100 fold after 12 hours of treatment application. Nevertheless, for SBTX 17 kDa gene the induction response was much smaller, it was only around 10 times. The data together show that SBTX is an inducible protein by biotic and abiotic elicitors, reinforcing its physiological role of defense, which could eventually be used as biotechnological tool in order to mitigate losses caused by fungi.

MORAIS, Vanessa Duarte de. Avaliação da expressão gênica da toxina da soja (SBTX) por indutores da defesa de plantas. 2012. 92 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-15T13:11:16Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_vdmorais.pdf: 9943329 bytes, checksum: 9b36af801a5a86f10c3a4153e39f1e80 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:24:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_vdmorais.pdf: 9943329 bytes, checksum: 9b36af801a5a86f10c3a4153e39f1e80 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:24:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_vdmorais.pdf: 9943329 bytes, checksum: 9b36af801a5a86f10c3a4153e39f1e80 (MD5) Previous issue date: 2012 / Soybean is a legume most commonly utilized in the world, whose use is justified by the high nutritional content of its grain, consisting mainly of proteins and lipids. The current estimate of global soybean production is 250,000 tons/year, but there are limiting factors of this production, such as the pest attack. The fungal diseases, for example, cause losses in soybeans around 4%, where 20% of these are derived from infection by Septoria glycines and Cercospora kikuchii. Thus, the search for alternative measures is increasing, particularly in reducing the use of pesticides, but for this it is important to understand the plant defense mechanisms. Soybean toxin (SBTX) is a protein purified from soybean seeds with activity against plant and human pathogenic fungi and neurotoxic action to rats and mice, hence the reason it received the name of toxin. SBTX shows a molecular mass of 44 kDa, composed of two subunits (17 and 27 kDa) encoded by distinct genes and it has been detected seeds, roots, stems and leaves. This study aimed to evaluate the gene expression profile of SBTX in soybean plants whose primary leaves were treated with elicitors (biotic and abiotic), using the real-time PCR technique, in an attempt to strength the physiological role of defense proposed for this protein. Therefore, salicylic acid, mechanic injury and Cercospora kikuchii spores were used as elicitors and it was measured the transcript levels of SBTX subunits. Induction responses were observed for both subunits of SBTX, but the gene expression profiles were different. For SBTX 27 kDa gene, the highest transcript level was detected when the treatment involved mechanic injury associated to salicylic acid, an increase of about 100 fold after 12 hours of treatment application. Nevertheless, for SBTX 17 kDa gene the induction response was much smaller, it was only around 10 times. The data together show that SBTX is an inducible protein by biotic and abiotic elicitors, reinforcing its physiological role of defense, which could eventually be used as biotechnological tool in order to mitigate losses caused by fungi. / A soja é uma das leguminosas mais utilizadas no mundo, sendo o uso justificado pelo elevado teor nutricional de seus grãos, constituídos, principalmente, por proteínas e lipídios. A estimativa atual da produção mundial de soja é de 250.000 toneladas/ano, porém há fatores limitantes dessa produção, como o ataque de pragas. As doenças causadas por fungos, por exemplo, causam na soja perdas em torno de 4%, sendo 20% destas causadas por Septoria glycines e Cercospora kikuchii. Assim, a busca por medidas alternativas de controle é crescente, particularmente em diminuição ao uso de agrotóxicos, mas, para isso, é importante o entendimento dos mecanismos de defesa vegetal. Das sementes de soja foi purificada uma proteína, denominada toxina da soja (SBTX), que é ativa contra diversos fungos de plantas e do homem e, também, é neurotóxica para ratos e camundongos, razão pela qual recebeu o nome de toxina. A SBTX apresenta massa molecular de 44 kDa, constituída por duas subunidades (17 e 27 kDa) codificadas por genes distintos e já foi identificada nas sementes, raízes, caules e folhas. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o perfil de expressão gênica da SBTX em plantas cujas folhas primárias foram tratadas com elicitores (biótico e abiótico), usando a técnica de PCR em tempo real, na tentativa de reforçar o papel fisiológico de defesa proposto para proteína. Assim sendo, ácido salicílico, injúria mecânica e esporos do fungo Cercospora kikuchii foram utilizados como elicitores e os níveis de transcritos para as duas subunidades proteicas de SBTX avaliados. Respostas de indução foram verificadas para ambas as subunidades da SBTX, porém os perfis de expressão gênica foram diferenciados. Para o gene SBTX 27 kDa, o maior nível de transcritos foi detectado quando o tratamento envolveu injúria mecânica associada ao ácido salicílico, correspondendo a um aumento de cerca de 100 vezes após 12 horas de aplicação do tratamento. Já para o gene SBTX 17 kDa este aumento não foi verificado na mesma intensidade, tendo sido apenas em torno de 10 vezes. Os dados em conjunto mostram que SBTX é uma proteína passível de indução por elicitores bióticos e abióticos, reforçando o seu papel fisiológico de defesa, podendo vir a ser utilizada como ferramenta biotecnológica no sentido de amenizar as perdas causadas por fungos.

FREIRE, José Ednésio da Cruz. Análise in silico da sequência deduzida de Mo-CBP3, uma proteína ligante à quitina de Moringa oleifera LAM. 2013. 116 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-30T12:44:05Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_jecfreire.pdf: 2576370 bytes, checksum: c3841faa82a44a8e3de82ce42c785dc5 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-11T23:29:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_jecfreire.pdf: 2576370 bytes, checksum: c3841faa82a44a8e3de82ce42c785dc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-11T23:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_jecfreire.pdf: 2576370 bytes, checksum: c3841faa82a44a8e3de82ce42c785dc5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Moringa oleifera is a tree belonging to the Moringaceae family. This plant is native from India where it is named as drumstick tree. In Brazil M. oleifera was introduced in the 1950’s decade and it is known as moringa. Approximately 40% of the fresh weight of these seeds is formed by proteins, some of which were isolated and characterized as flocculants and antinutritional proteins. In addition, the chitin binding proteins have been identified and isolated, especially among which is the Mo-CBP3, a thermostable glycoprotein of apparent molecular mass of around 14.3 kDa, with potent inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In order to characterize the deduced sequence of Mo-CBP3, moringa fruits were collected 65 days after anthesis and their seeds subjected to extraction of total RNA. cDNA synthesis was directed by ‘5’ RACE’-PCR. The PCR products were subcloned into appropriate vectors (pGEM-T Easy) and then introduced into Escherichia coli cloning host TOP10F'. The recombinant plasmids were purified from transformed bacterial cell and subjected to DNA sequencing. The computational analysis of the deduced protein sequence of Mo-CBP3 showed that this protein has an apparent molecular mass of 12.85 kDa and it is unstable in cytoplasmic conditions. It has derived signal sequences, one for the signal peptide with 30 amino acids, and a sequence at the C-terminus of this protein, related to the anchorage to the plasma membrane as well as the endoplasmic reticulum. Moreover, probable sites of O-glycosylation and phosphorylation were identified. One domain related to the lipid transfer functions, reserve and trypsin inhibitors and alpha-amylase was identified following Mo-CBP3, thereby contributing to the understanding of its potent action against phytopathogenic fungi. / A Moringa oleifera é uma planta pertencente à família Moringaceae. Esta planta é nativa da Índia, sendo lá conhecida como drumstick (baqueta ou bastão de tambor). No Brasil, a M. oleifera foi introduzida na década de 1950, e é conhecida como moringa. Aproximadamente 40% do peso fresco das sementes é composto por proteínas, das quais algumas foram isoladas e caracterizadas como sendo floculantes e proteínas antinutricionais. Em adição, proteínas ligantes à quitina têm sido identificadas e isoladas, destacando-se dentre estas a Mo-CBP3, uma glicoproteína termoestável de massa molecular aparente em torno de 14,3 kDa, com potente atividade inibitória contra fungos fitopatogênicos. A fim caracterizar a sequência deduzida da Mo-CBP3, frutos de moringa foram coletados após 65 dias da antese e suas sementes submetidas à extração de RNA total. A síntese de cDNA foi dirigida por meio da técnica PCR-RACE 5'. Os produtos de PCR foram subclonados em vetores apropriados (pGEM-T Easy) e, em seguida, introduzido em hospedeiro de clonagem Escherichia coli TOP10F'. Os plasmídeos recombinantes foram purificados de células bacterianas transformadas e submetidos ao sequenciamento de DNA. A análise computacional da sequência deduzida da proteína Mo-CBP3 mostrou que esta é uma proteína de massa molecular aparente em torno de 12,85 kDa e, em condições citoplasmáticas apresenta-se instável. Possui sequências sinais deduzidas, sendo uma para peptídeo sinal, com 30 aminoácidos, e uma sequência na região C-terminal relacionada à ancoragem desta proteína à membrana plasmática, bem como ao retículo endoplasmático. Ademais, prováveis sítios de O-glicosilação e de fosforilação foram identificados. Um domínio relacionado às funções de transferência de lipídeos, de reserva e de inibidores de tripsina e de alfa-amilase foi identificado na sequência de Mo-CBP3, contribuindo, desse modo, para o entendimento de sua potente ação contra fungos fitopatogênicos.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior