Le facteur VIII (FVIII) est une glycoprotéine de la coagulation plasmatique, co-facteur du facteur IX activé (FIXa). Son métabolisme dépend de multiples facteurs limitant ou favorisant sa survie ou sa fonction. L’objectif de ce travail était d’analyser les différents paramètres pouvant influencer le taux de FVIII circulant et sa fonction pro-coagulante. Il a compris 4 volets : 1) Nous avons montré que la rétention intra-cellulaire connue du FVIII était en grande partie liée à son agrégation et sa dégradation par les 2 voies protéasomale et lysosomale. 2) Nous avons analysé les mutations du gène F8 responsables de l’hémophilie A dans une large cohorte de patients. Leur analyse bio-informatique a permis de démontrer leur caractère délétère pour le FVIII. L’influence de ces mutations sur la survenue d’allo-anticorps anti-FVIII a été étudiée et stratifiée, en association avec l’origine ethnique et la recherche d’antécédents familiaux d’nticorps. 3) La recherche des facteurs influençant les taux de FVIII chez les conductrices d’hémophilie A a mis en évidence des déterminants majeurs : l’existence d’une maladie génétique additionnelle responsable d’un déficit en FVIII, le taux de facteur Willebrand et l’inactivation non aléatoire du chromosome X ; et des déterminants secondaires : l’âge, la sévérité de l’hémophilie, le polymorphisme D1241E du gène F8 et 5 nouveaux polymorphismes de la LRP1 localisés dans ses sites de liaison pour le FVIII. 4) Nous avons analysé 8 FVIII recombinant mutés in vitro en alanine dans la région 1808-1818 du FVIII. Les études antérieures n’analysant que la chaîne légère, ont montré que cette région était la plus affine pour le FIXa. Nous démontrons ici que la région 1808-1818 ne paraît pas si essentielle à la fonction du FVIIIcar au sein de la molécule entière, son affinité diminue et ses mutations n’altèrent que très modérément l’activité du FVIII. / The factor VIII (FVIII) is a glucoprotein of the coagulation, being the cofactor of the activated factor IX (FIXa). Its metabolism depends on various limiting factors or enhancing its survey or function. The objective of this research’s work was to analyse different parameters that could influence the plasma FVIII level and its pro-coagulant function. It included 4 parts : 1) We showed that the known intra-cellular retention of FVIII was mainly due to its aggregation and degradation following both proteasomal and lysosomal pathways. 2) We analysed FVIII gene mutations responsible for hemophilia A in a large patients cohort. The bio-informatic analysis demonstrated its deleterious consequence. The influence of these mutations on the anti-FVIII antibodies occurrence was stratified, in association with ethnicity and familial antecedent of inhibitor. 3) The research of factors influencing FVIII levels in hemophilia A carriers showed : i) major determinants such as the presence of an additional genetic disease characterised by a FVIII deficiency, the factor Willebrad’s level and the non-random inactivation of the X chromosome; and ii) minor determinants : age, severity of hemophilia, the polymorphism D1241E of FVIII gene, and 5 new polymorphisms of LRP1 located in its binding site for FVIII.4) We analysed 8 recombinant FVIII with in vitro created mutations in its 1808-1818 region. Previous studies that analysed only the FVIII light chain, have shown that this region constituted the more affine binding site of FVIII for FIXa. We demonstrated here that the 1808-1818 region is not as essential as it was reported because within the entire molecule, its affinity decreases and mutations affecting it do alter mildly the FVIII activity.

L’administration de Facteur VIII thérapeutique (FVIII) chez les patients hémophiles A entraine l’apparition d’anticorps anti-FVIII appelés « inhibiteurs » chez 30% des hémophiles A sévères. Ceci constitue alors une impasse thérapeutique. Si de nombreuses investigations ont permis de caractériser les effecteurs lymphocytaires T et B impliqués dans cette réponse immunitaire, elles n’ont toutefois pas permis de proposer aux patients des stratégies thérapeutiques pour prévenir l’apparition des inhibiteurs du FVIII. La première partie de ma thèse explore la possibilité de prévenir la réponse immunitaire anti-FVIII en inhibant la capture et l’apprêtement antigénique du FVIII par les cellules présentatrices de l’antigène (CPA). Il avait été montré précédemment que les deux structures hautement mannosylées du FVIII, sur les asparagines 239 et 2118, étaient reconnues par le CD206 exprimé par les cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes, et que cette voie d’endocytose menait à l’apprêtement antigénique du FVIII. Je me suis donc intéressée à la possibilité de réduire l’immunogénicité du FVIII en éliminant ces deux glycosylations. La seconde partie de ma thèse porte sur la possibilité de prévenir ou d’éradiquer la réponse immunitaire anti-FVIII en inhibant une molécule de la signalisation du récepteur des lymphocytes B (LB) : la tyrosine kinase de Bruton (BTK). La BTK jouant un rôle central dans la signalisation des LB, l’inhibition de celle-ci a montré un intérêt thérapeutique dans le cas de certaines pathologies malignes et auto-immunes. J’ai donc exploré le potentiel thérapeutique d’un inhibiteur de la BTK dans la réponse immunitaire anti-FVIII. / Administration of therapeutic factor VIII (FVIII) to hemophilia A patients leads to the development of anti-FVIII antibodies called “inhibitors” in 30% of severe hemophilia A patients. Despite a well characterization of T and B effectors cells involved in this immune response, there is still no therapeutic strategy proposed to the patients to prevent the occurrence of FVIII inhibitors. The first part of my thesis explores the possibility to prevent the anti-FVIII immune response by blocking FVIII capture and processing by antigen presenting cells (APC). It has been previously demonstrated that the two highly mannosylated structures on FVIII, on asparagines 239 and 2118, were recognized by the CD206 expressed on human monocyte-derived dendritic cells. This endocytic pathway led to FVIII processing and presentation to T cells. Therefore, I have investigated the possibility to reduce FVIII immunogenicity by eliminating those two glycosylations. The second part of my thesis focuses on the possibility to prevent or eradicate the anti-FVIII immune response by inhibiting a molecule involved in B cell receptor signaling: the Bruton’s tyrosine kinase (BTK). BTK plays a key role in B cells signaling and inhibition of BTK has shown a great interest in B cell malignancies, but also in some auto-immune diseases. Therefore, I have investigated the therapeutic potential of a new BTK inhibitor against the development of the anti-FVIII immune response.

L'hémophilie A (HA) est une maladie hémorragique congénitale qui se traduit par un défaut en facteur VIII (FVIII) de la coagulation. Le traitement privilégié des saignements est l'administration de FVIII exogène cependant, 30% des patients développent une réponse anticorps alloimmune contre le FVIII thérapeutique qui inhibe son activité pro-coagulante. L'endocytose du FVIII par les cellules dendritiques (DC) et sa présentation aux lymphocytes T ont été documentées. Cependant, la nature des signaux de danger (SD) responsables de la maturation des DC indispensable à l'initiation de la réponse immunitaire anti-FVIII, est inconnue. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à identifier l'origine de ces SD et envisagé 3 possibilités: Une origine liée à la structure intrinsèque du FVIII, au contexte inflammatoire avant l'administration de FVIII, ou au contexte inflammatoire généré par l'injection de FVIII. Mes résultats ont montré que le FVIII n'était pas capable d'induire la maturation de macrophages ou d'activer directement le TLR2. J'ai également écarté l'hypothèse d'un état d'activation compensatoire des plaquettes (PLT) dans un organisme privé de FVIII. En revanche, mes travaux ont mis en évidence un rôle des PLT dans l'initiation de la réponse immunitaire anti-FVIII dans le modèle murin d'HA. Mes résultats suggèrent que l'implication des PLT passe par leur activation par la thrombine générée lors de l'administration de FVIII. L'identification des médiateurs de l'inflammation issus de l'activation plaquettaire devrait ouvrir des perspectives thérapeutiques intéressantes dans le contrôle de l'inflammation au moment de l'administration de FVIII, afin de réduire son immunogénicité.

L’apparition d’une réponse immunitaire contre le Facteur VIII (FVIII) de la coagulation est une complication majeur qui survient chez 30% des hémophile A sévères. Bien que des avancées importantes aient abouti au développement de nouvelles molécules de FVIII thérapeutiques, les mécanismes conduisant à l’apparition d’une réponse immunitaire anti-FVIII restent non élucidés. Des facteurs de risques génétiques et environnementaux ont été identifiés ou suggérés, mais une compréhension complète des processus immunologiques permettant l’initiation de cette réponse au dépend de l’induction de tolérance immune chez 30% des patients restent incomprise. Ma thèse porte sur les aspects fonctionnels et structurels du FVIII et leur rôle dans l’initiation de la réponse immunitaire anti-FVIII chez le modèle murin hémophile A. Le premier rôle du FVIII est sa participation à la cascade de la coagulation, et donc la première partie de ma thèse adresse le rôle du processus de coagulation dans l’initiation de la réponse immunitaire anti-FVIII. La seconde partie de ma thèse se concentre sur l’importance des résidus du domaine C2 impliqué dans la liaison aux phospholipides dans l’endocytose et la présentation du FVIII par les cellules présentatrices de l’antigène in vitro et discute de leur relevance in vivo. / Immunogenicity of Factor VIII (FVIII) is a major hurdle that affects about 30% of severe hemophilia A patients. Though a significant advancement has been accomplished in the development of newer FVIII molecules, the factors that drive FVIII immune responses remain elusive. Many genetic and environmental risk factors have been identified or suggested but a complete understanding of the immunological basis for the antibody formation and the mechanism(s) behind tolerance induction, in the 30% of the patients that never develop anti-FVIII antibodies, are not understood. My thesis involves overlapping aspects important for initiation of an anti-FVIII immune response in a mouse model of hemophilia A. The primary role of FVIII is its participation in coagulation-associated events and thus, the first part of my thesis addresses whether coagulation events per se are implicated in the initiation of anti-FVIII immune responses. The second part of my thesis focuses on the importance of the membrane binding residues within the C2 domain of FVIII in antigen uptake and presentation by antigen presenting cells in vitro and discusses its relevance in vivo.

L’hémophilie A est une maladie hémorragique rare liée au chromosome X qui se traduit par un déficit en facteur VIII (FVIII) fonctionnel. Chez les patients atteints de la forme sévère de l’hémophilie A, l’apparition d’hémorragies incontrôlées augmente la morbidité et affecte leur qualité de vie. Le traitement de choix permettant de prévenir ou de traiter les saignements consiste en l’injection intraveineuse de FVIII thérapeutique. Cependant, chez 5 à 30% des patients, une réponse immunitaire dirigée contre le FVIII se développe. La réponse anti-FVIII est caractérisée par l’apparition d’anticorps qui inhibent l’activité pro-coagulante du FVIII. Ainsi l’apparition de ces anticorps, appelés « inhibiteurs » représente-t-elle la complication majeure du traitement des patients hémophiles A. Plusieurs facteurs de risque ont été suggérés ou proposés comme affectant le développement de la réponse anti-FVIII. Parmi eux, supporté par la théorie du « danger », la présence de médiateurs pro-inflammatoires générés par les épisodes de saignement est considérée comme adjuvant dans la réponse immunitaire anti-FVIII. Cependant, les saignements induisent de nombreux mécanismes pro mais aussi anti-inflammatoires. Ainsi, l’activation de l’endothélium vasculaire induit-elle le recrutement et l’activation des cellules effectrices appartenant aux compartiments innés et adaptatifs du système immunitaire. Au cours de ma thèse, je me suis concentré sur le rôle des saignements dans le développement de la réponse immunitaire dirigée contre le FVIII. Ainsi, ai-je découvert une association entre la présence d’un polymorphisme dans un gène induit par les saignements et la présence d’inhibiteurs du FVIII dans une cohorte de patients hémophiles A sévères. J’ai également étudié le développement de la réponse immunitaire dirigée contre le FVIII thérapeutique dans un modèle murin qui mime les saignements locaux observés chez les patients hémophiles A sévères. Finalement, j’ai caractérisé l’effet des formes réactives de l’oxygène (FRO), qui sont générées au niveau du site de saignement, sur la structure, la fonction et l’immunogénicité du FVIII. Les résultats obtenus au cours de ma thèse démontrent que les saignements ne sont pas associés à un risque plus élevé de développer des inhibiteurs dans le modèle murin largement utilisé d’hémophilie A sévère, contrairement à ce qui est communément admis. De plus, j’ai démontré une association entre un polymorphisme présent dans le promoteur du gène HMOX1 et la survenue d’inhibiteurs dans une cohorte de patients atteints d’hémophilie A sévère. En parallèle, je décris pour la première fois une altération du statut oxydatif chez les souris déficientes en FVIII et je démontre que le contrôle du statut oxydatif in vivo permet de moduler la réponse immunitaire anti-FVIII. Au contraire, l’exposition du FVIII aux FRO augmente son immunogénicité. De fait, mes résultats suggèrent que, bien que les molécules pro-inflammatoires libérées suite aux saignements puissent affecter positivement la réponse immunitaire dirigée contre le FVIII, de puissants médiateurs anti-inflammatoires sont générés in vivo et amenuisent l’effet potentiellement adjuvant des saignements. Également, ces résultats soulignent la balance complexe entre les médiateurs pro- et anti-inflammatoires qui sont générés consécutivement aux saignements ainsi que leurs effets sur la réponse immunitaire dirigée contre le FVIII thérapeutique. / Hemophilia A is a rare X-linked hemorrhagic disease consecutive to the lack of functional pro-coagulant factor VIII (FVIII). In patients with the severe form of hemophilia A, uncontrolled hemorrhages increase the morbidity and affect the quality of life. To prevent or treat bleeding episodes, therapeutic FVIII is administered intravenously. However, an anti-FVIII immune response develops in 5 to 30% of the patients. The anti-FVIII immune response is characterized by the development of anti-FVIII IgG antibodies that inhibit FVIII activity. These antibodies, referred to as “FVIII inhibitors” represent the major complication in the treatment of hemophilia A patients. Several risk factors have been suggested or proposed to predispose to the development of FVIII inhibitors. Amongst them, inspired by the “danger” theory, the presence of inflammatory mediators released upon bleeding episodes is thought to adjuvant the anti-FVIII immune response. Bleeding episodes trigger several pro and anti-inflammatory mechanisms. Thus, damage to the endothelium triggers the recruitment and activation of effector cells from the innate and adaptive compartments of the immune system. During my PhD, I investigated the role of bleedings in the development of the anti-FVIII immune response. Thus, I discovered an association between a polymorphism in the promoter region of a gene that is induced in response to bleedings, and the presence of FVIII inhibitors in a cohort of patients with severe hemophilia A. I followed the development of the immune response to therapeutic FVIII in a mouse model that mimics the localized bleedings found in patients with severe hemophilia A. Ultimately, I characterized the effects of reactive oxygen species (ROS) that are potentially released at the bleeding site in view of the structure, function and immunogenicity of the FVIII molecule. The results I obtained during my PhD demonstrate that bleedings are not associated with a higher risk for FVIII inhibitor development in the commonly used mouse model of severe FVIII deficiency. Additionally, I demonstrated an association between a polymorphism in the promoter of the HMOX1 gene and the presence of FVIII inhibitors. In parallel, I report for the first time an exacerbated oxidative status in FVIII-deficient mice as compared to control mice, and demonstrate that the control of the oxidative status in vivo reduces the anti-FVIII immune response. Conversely, the exposure of FVIII to ROS ex vivo increases the immunogenicity of the FVIII molecule. Taken together, my results suggest that, although the pro-inflammatory molecules released upon bleeding may positively affect the anti-FVIII immune response, several strong anti-inflammatory compounds are generated in vivo that dampen the potential adjuvant effect of bleedings. Ultimately, these results highlight the complex balance between the pro and anti-inflammatory mediators generated upon bleeding and their effect on the anti-FVIII immune response.

La survenue d'anticorps neutralisant le facteur VIII de la coagulation (FVIII) chez les patients hémophiles A constitue un échec thérapeutique majeur. Si les étapes effectrices de la réponse immunitaire, la nature des cellules immunitaires impliquées et les propriétés des anticorps ont été largement documentées, les étapes précoces de la réponse immunitaire restent mal connues et constituent l'objet de ma thèse. La première partie de ma thèse aborde le rôle du microenvironnement rencontré par le FVIII une fois administré in vivo, notamment le rôle des molécules du complément. Acteur majeur de l'immunité innée, le système du complément participe également aux réponses immunitaires adaptatives et peut interagir avec la cascade de la coagulation. Alors que le complément est impliqué dans les réponses immunitaires contre des agents pathogènes, son implication dans les réponses immunitaires dirigées contre les protéines thérapeutiques n'a jamais été décrite jusqu'à présent. Je me suis donc intéressé au potentiel rôle des molécules du complément dans l'immunogénicité du FVIII thérapeutique.La seconde partie de ma thèse aborde l'implication de la structure du FVIII pour sa reconnaissance par le système immunitaire. Ainsi, a-t-il été démontré l'importance du domaine C1 du FVIII pour sa prise en charge par les cellules du système immunitaire in vitro et pour son immunogénicité in vivo. En raison des fortes homologies de structure entre les domaines C1 et C2, je me suis intéressé au rôle potentiel du domaine C2 dans la capture du FVIII par les cellules présentatrices d'antigènes et l'élaboration de la réponse immunitaire anti-FVIII. / Occurrence of pro-coagulant factor VIII (FVIII) neutralizing antibodies in hemophilia A patients constitutes a major therapeutic failure. While the effector steps of the immune response, the nature of the involved immune cells and the antibodies properties have been well-reported, the early stages of the immune response are poorly described and constitute the topic of my PhD thesis. The first part of my thesis deals with the role of the microenvironment encountered by FVIII once administered in vivo, especially the role of complement system molecules. While complement system is a major actor of the innate immunity, it also participates to adaptive immune responses and can interact with the coagulation cascade. Though complement is involved in immune responses against pathogens, its contribution to immune responses against therapeutic proteins has never been reported so far. Therefore I have investigated the potential role of the complement system in the immunogenicity of therapeutic FVIII. The second part of my thesis focuses on the involvement of FVIII structure for its recognition by the immune system. It has been demonstrated that FVIII C1 domain plays a major role of its uptake by immune cells in vitro and its immunogenicity in vivo. Because of strong structural homologies between C1 and C2 domains, I investigated the potential role of FVIII C2 domain for its endocytosis by antigen presenting cells and the elicitation of the anti-FVIII immune response.

Les cristaux d'UMS sont connus comme agents étiologiques de la goutte et au cours de l'accès goutteux, le neutrophile est une des premières cellules immunitaires à s'accumuler en grand nombre au site inflammatoire dans les cavités articulaires. Durant l'inflammation, le plasma traverse les vaisseaux sanguins et transporte les protéines vers le site enflammé. Plusieurs protéines plasmatiques peuvent alors servir à recruter le neutrophile, comme les composants du complément (C5a ), les kinines (bradykinine ou agonistes du récepteur B1) et bien d'autres. Au début de l'inflammation, initialement les cristaux interagissent probablement avec le plasma et ses protéines recouvrent les cristaux. Cependant, nous savons que le plasma ayant servi à l'opsonisation des cristaux d'urate monosodique subit des changements conduisant à l'activation du système du complément. Ainsi, les objectifs de ce mémoire étaient de confirmer la libération du facteur C5a et de la bradykinine dans le plasma humain activé par les cristaux d'urate monosodique et de déterminer les effets de ces facteurs plasmatiques sur l'activité du neutrophile. La chimiotaxie a été étudiée en réponse au plasma activé par les cristaux, mettant en évidence la présence de facteurs du complément, en particulier le C5a qui est majoritairement responsable de cette chimiotaxie. Le plasma activé provoque aussi une mobilisation de calcium par l'intermédiaire du C5a et certainement par d'autres facteurs qui ne sont pas encore identifiés. Les résultats obtenus ont aussi montré que l'agoniste du récepteur B1 des kinines induisait la migration des neutrophiles. En revanche, nous n'avons pas réussi à identifier la bradykinine dans le plasma ayant servi à l'opsonisation des cristaux d'UMS. Les résultats de notre travail servirons de base pour des études subséquentes sur le plasma activé par les cristaux d'UMS.

La Maladie Thrombo-Embolique Veineuse (MTEV) est une maladie dont les facteurs de risque sont à la fois environnementaux et génétiques. Les facteurs de risque génétiques bien établis sont les déficits en anti-thrombine, en protéine S, en protéine C, la mutation du Facteur V de Leiden (FVL), la mutation du Facteur (F) II G20210A, ainsi que le gène ABO dont les allèles A1 et B augmentent le risque de MTEV par rapport aux allèles A2 et O. Alors qu'une part importante de l'héritabilité de la MTEV reste inexpliquée, les études contemporaines se heurtent à un manque de puissance pour découvrir de nouveaux facteurs génétiques dont les effets sont de plus en plus faibles. En vue d'augmenter la puissance de détection de nouveaux gènes de susceptibilité à la MTEV, j'ai recherché les déterminismes génétiques de deux de ses phénotypes intermédiaires : les taux d'activité plasmatique du FVIII et les taux d'antigénémie de sa protéine de transport, le Facteur de von Willebrand (vWF). Dans un premier temps, j'ai réalisé une analyse de liaison des taux de FVIII et de vWF à partir d'un échantillon de cinq grandes familles franco-canadiennes (totalisant 255 personnes) recrutées via un cas de MTEV avec mutation FVL. Quatre régions liées aux taux de FVIII et/ou vWF ont été identifiées. L'une de ces régions correspondait au locus du gène ABO déjà connu pour influencer les taux de FVIII et vWF. La recherche de gènes candidats au sein des autres signaux de liaison s'est effectuée par l'étude in silico d'une analyse d'association pangénomique de la MTEV incluant 419 cas et 1228 témoins. Deux gènes candidats ont été identifiés : STAB2 et BAI3. J'ai ensuite réalisé des études d'associations de cinq polymorphismes de BAI3. L'un d'entre eux était d'une part associé à une élévation des taux de vWF (résultat obtenu dans un échantillon de 108 familles nucléaires en bonne santé et reproduit dans un échantillon de 916 patients non apparentés atteints de MTEV), et d'autre part associé au risque de survenue de MTEV parmi les sujets non porteurs de mutations FVL et FII de deux échantillons cas-témoins (respectivement 916 cas et 801 témoins, et 250 cas et 607 témoins). Quant à STAB2, durant le courant de ma thèse, deux de ces polymorphismes ont été décrits comme associés aux taux de FVIII et vWF au cours d'une vaste étude d'association pangénomique (GWAS) menée par le consortium CHARGE rassemblant 23 600 personnes. Dans un second temps, j'ai réalisé une méta-analyse de trois GWAS des taux de FVIII et vWF. Ces analyses avaient été conduites avec l'échantillon des cinq grandes familles franco-canadiennes et deux échantillons de 972 et 570 patients atteints de MTEV. Elles étaient ajustées sur les polymorphismes du gène ABO permettant de distinguer les allèles A1, A2, B et O, dans l'optique d'augmenter la puissance des analyses en diminuant la variance résiduelle des phénotypes. Aucun polymorphisme n'était associé ni aux taux de vWF ni à ceux de FVIII après prise en compte de la correction de Bonferroni pour tests multiples (p<10-7). Cependant, parmi les onze gènes qui présentaient des polymorphismes associés aux taux de vWF ou de FVIII avec une significativité p<10-5, de manière intéressante se trouvait STAB2. Cette étude a de plus permis de confirmer les associations nouvellement découvertes de polymorphismes situés dans les gènes VWF, STXBP5 et STX2.

Le facteur VIII (FVIII) joue un rôle essentiel dans la coagulation sanguine. Lorsque le FVIII fait génétiquement défaut, une pathologie hémorragique grave survient: l'hémophilie A (HA) congénitale. La complication majeure de la prise en charge de ces patients est l'apparition d'allo-anticorps (alloAcs) dirigés contre le FVIII thérapeutique administré. Dès lors, la seule thérapeutique efficace est l'induction de tolérance immune (ITI) qui vise à les éradiquer. Cependant, ce traitement échoue dans 30% des cas, sans qu'aucun facteur ne permette actuellement de prédire l'échec de ce traitement contraignant et coûteux. des facteurs immunologiques prédictifs de l'efficacité de l'ITI ont été recherchés chez 25 patients par analyse du répertoire épitopique et isotypique des Acs anti-FVIII à l'aide de la technologie x-MAP. Des biomarqueurs individuels (Acs anti-A2 et -A1 du FVIII), et des combinaisons originales ont été identifiés (0,841 < AUC < 0,946). Des manifestations hémorragiques peuvent apparaitre chez des patients non hémophiles, dues à des autoAcs anti-FVIII (HA acquise). Dans certains cas, les autoAcs se développent au moment du postpartum. peu de données sont disponibles sur cette réponse immune. Dans une seconde étude portant sur 73 cas, nous avons découvert un profil immunologique (autoAcs anti-A1) différenciant les HA du postpartum et les autres HA acquises. Les profils d'IgG anti-FVIII que nous avons établis s'avèrent prometteurs pour prédire l'efficacité de l'ITI et engendrer une cartographie précise de la réponse autoimmune chez les patients atteints d'HA acquise. / Factor VIII (FVIII) plays a critical role in blood coagulation. When FVIII s genetically defective, a serious hemorrhagic disease occurs: congenital hemophilia A (HA). The main complication of the management of these patients is the appearance of alloantibodies (alloAbs) directed against administred therapeutic FVIII. therefore, the only effective treatment is the immune tolerance induction (ITI), which aims to eradicate these alloAbs. However, this treatment fails in up to 30% of cases, without any factor currently able to predict the failure of this constraining and expensive treatment. Immunological factors predictive to the efficacy of ITI were investigated in 25 patients by analysis of epitopic and isotypic IgG profile of anti-FVIII Abs using x-MAP technology. Individual biomarkers (anti-FVIII A1 and -A2 Abs), and original combinations were identified (0,841 < AUC < 0,946). Hemorrhagic manifestations can occur in non-hemophiliac patients, due to anti-FVIII autoAbs (acquired HA). In some patients, the autoAbs appear in postpartum period but few data are available on the immune response due to the rarity of the disease. In a second study of 73 cases, we found a different immunological profile between patients with postpartum HA and the other acuired HA patients. IgG profiles of anti-FVIII we have established are promising for predicting the effectiveness of ITI and generate an accurate mapping of autoimmune response in patients with acquired HA.

La Maladie Thrombo-Embolique Veineuse (MTEV) est une maladie dont les facteurs de risque sont à la fois environnementaux et génétiques. Les facteurs de risque génétiques bien établis sont les déficits en anti-thrombine, en protéine S, en protéine C, la mutation du Facteur V de Leiden (FVL), la mutation du Facteur (F) II G20210A, ainsi que le gène ABO dont les allèles A1 et B augmentent le risque de MTEV par rapport aux allèles A2 et O. Alors qu’une part importante de l’héritabilité de la MTEV reste inexpliquée, les études contemporaines se heurtent à un manque de puissance pour découvrir de nouveaux facteurs génétiques dont les effets sont de plus en plus faibles. En vue d’augmenter la puissance de détection de nouveaux gènes de susceptibilité à la MTEV, j’ai recherché les déterminismes génétiques de deux de ses phénotypes intermédiaires : les taux d’activité plasmatique du FVIII et les taux d’antigénémie de sa protéine de transport, le Facteur de von Willebrand (vWF). Dans un premier temps, j’ai réalisé une analyse de liaison des taux de FVIII et de vWF à partir d’un échantillon de cinq grandes familles franco-canadiennes (totalisant 255 personnes) recrutées via un cas de MTEV avec mutation FVL. Quatre régions liées aux taux de FVIII et/ou vWF ont été identifiées. L’une de ces régions correspondait au locus du gène ABO déjà connu pour influencer les taux de FVIII et vWF. La recherche de gènes candidats au sein des autres signaux de liaison s’est effectuée par l’étude in silico d’une analyse d’association pangénomique de la MTEV incluant 419 cas et 1228 témoins. Deux gènes candidats ont été identifiés : STAB2 et BAI3. J’ai ensuite réalisé des études d’associations de cinq polymorphismes de BAI3. L’un d’entre eux était d’une part associé à une élévation des taux de vWF (résultat obtenu dans un échantillon de 108 familles nucléaires en bonne santé et reproduit dans un échantillon de 916 patients non apparentés atteints de MTEV), et d’autre part associé au risque de survenue de MTEV parmi les sujets non porteurs de mutations FVL et FII de deux échantillons cas-témoins (respectivement 916 cas et 801 témoins, et 250 cas et 607 témoins). Quant à STAB2, durant le courant de ma thèse, deux de ces polymorphismes ont été décrits comme associés aux taux de FVIII et vWF au cours d’une vaste étude d’association pangénomique (GWAS) menée par le consortium CHARGE rassemblant 23 600 personnes. Dans un second temps, j’ai réalisé une méta-analyse de trois GWAS des taux de FVIII et vWF. Ces analyses avaient été conduites avec l’échantillon des cinq grandes familles franco-canadiennes et deux échantillons de 972 et 570 patients atteints de MTEV. Elles étaient ajustées sur les polymorphismes du gène ABO permettant de distinguer les allèles A1, A2, B et O, dans l’optique d’augmenter la puissance des analyses en diminuant la variance résiduelle des phénotypes. Aucun polymorphisme n’était associé ni aux taux de vWF ni à ceux de FVIII après prise en compte de la correction de Bonferroni pour tests multiples (p<10-7). Cependant, parmi les onze gènes qui présentaient des polymorphismes associés aux taux de vWF ou de FVIII avec une significativité p<10-5, de manière intéressante se trouvait STAB2. Cette étude a de plus permis de confirmer les associations nouvellement découvertes de polymorphismes situés dans les gènes VWF, STXBP5 et STX2. / The Venous Thromboembolism (VTE) risk factors are environmental and genetic. The well established risk factors are anti-thrombin, protein C, protein S deficiency, Factor V Leiden and factor II mutation and ABO gene, with A1 and B allele increasing the risk of VTE. While an important part of VTE heritability remains unexplained, contemporary studies fail to discover new susceptibility genes with weaker effects. In order to increase the discovery power, I searched for genetic geterminism of two intermediary phenotypes of VTE : Factor VIII plasmatic activity (FVIII) and von Willebrand factor antigenemia (vWF)First, I performed a linkage study of FVIII and vWF from a sample of 5 large pedigrees (N=255). Four loci have been identified. One included ABO gene. I searched for candidate genes located in the others loci by studying in silico results from o Genome Wide Association Study (GWAS) of the VTE including 419 cases and and 1228 controls. témoins. Two candidate genes were identified : STAB2 et BAI3. Then I performed association studies of five SNPs in BAI3 with FVIII and vWF. One of them was associated to vWF (in a sample of 108 nuclear families and 916 VTE patients), and associated to VTE in two case-controls samples (respectively 916 cases and 801 controls, and 250 cases et 607 controls).Second, I performed a meta-analysis of three GWAS of FVIII and vWF from the same 5 pedigrees and two samples of VTE (N=972 and 570) adjusted on ABO blood group. No polymorphisms were significant after Bonferoni correction (p<10-7). Nevertheless, among 11 genes carrying polymorphisms with a p<10-5, interestingly was STAB2. Futhermore, this study allowed to confirm newly discoverd association with VWF, STXBP5 et STX2.