Current studies of koalas in the wild mainly rely on information gathered by traditional field methods, such as community sightings, spotlighting, radiotracking, animal trappings, ear tagging and faecal pellet incidence. Collection of faeces is potentially the most reliable source of non-invasively obtaining DNA samples, which can be used to identify specific individuals. This thesis demonstrated a simple, rapid and reproducible method of extracting DNA from Koala faecal pellets using a commercially available DNA extraction kit, shows the maximum age of pellets from which DNA can be reliably extracted and defines the conditions required for the long term storage of pellets before DNA extraction is carried out. Mitochondrial DNA PCR analysis provided a simple and rapid indication of the success of both the faecal DNA extraction and pellet collection process. The faecal DNA was successfully used for microsatellite analysis and the subsequent genetic profiling of individuals from within the Campbelltown Koala population. The study paves the way for the analysis of microsatellite loci in koala faecal pellet DAN to study populations, which are too sparsely distributed to allow the capture of individual koalas / Master of Science (M. Sc.) (Hons.)

<p>Abstract</p><p>Gaining accurate population information is crucial for the conservation and management of species. The National Monitoring Program for Large Carnivores monitors the Swedish lynx population (species Lynx lynx) by surveying family groups, non-invasive sampling and genetic analysis. Ten microsatellite regions were used as genetic markers to retrieve unique individual genotypes, through polymerase chain reactions (PCR) with specific primer-pairs and capillary-electrophoresis. Complete genotypes were matched using an internal database. The aim of this degree project was to show how monitoring of lynx through genetic analysis is carried out at the Department of Evolutionary Biology at Uppsala University, and to evaluate how effective these methods are and how they might be improved.</p><p>Even though most of the methods used were fairly robust and reproducible, non-invasive sampling and microsatellite analysis posed some problems regarding DNA quality and quantity, and increased the risks of certain genotyping errors. These risks might be worth taking though, as genetic analysis, in combination with field observations, gives a more comprehensive picture of the Swedish lynx population.</p>

Abstract Gaining accurate population information is crucial for the conservation and management of species. The National Monitoring Program for Large Carnivores monitors the Swedish lynx population (species Lynx lynx) by surveying family groups, non-invasive sampling and genetic analysis. Ten microsatellite regions were used as genetic markers to retrieve unique individual genotypes, through polymerase chain reactions (PCR) with specific primer-pairs and capillary-electrophoresis. Complete genotypes were matched using an internal database. The aim of this degree project was to show how monitoring of lynx through genetic analysis is carried out at the Department of Evolutionary Biology at Uppsala University, and to evaluate how effective these methods are and how they might be improved. Even though most of the methods used were fairly robust and reproducible, non-invasive sampling and microsatellite analysis posed some problems regarding DNA quality and quantity, and increased the risks of certain genotyping errors. These risks might be worth taking though, as genetic analysis, in combination with field observations, gives a more comprehensive picture of the Swedish lynx population.

O veado-mão-curta (Mazama nana) é uma espécie de cervídeo que ocupa a região Sul do Brasil, norte da Argentina e leste do Paraguai, tendo sido severamente afetada pela redução drástica das áreas florestadas. Trata-se, também, da espécie de cervídeo neotropical menos estudada pela ciência. Frente a essa situação, o presente projeto propôs-se a entender como essa espécie se distribui em sua área de ocorrência, propôs áreas prioritárias para sua conservação e estimou a densidade de duas populações. Dada a raridade e a alta elusividade da espécie, propôs-se o uso de metodologias indiretas para se atingir o objetivo proposto. Assim, foram usadas metodologias baseadas na coleta de amostras fecais, extração do DNA e posterior análises molecular e genética. Foram coletadas amostras fecais com o auxílio de um cão farejador em unidades de conservação distribuídas ao longo do Sul do Brasil. Após a identificação da espécie por meio da amplificação de um fragmento do citocromo B e corte com enzimas de restrição (PCR/RFLP) e com os dados de localização das amostras, foram feitas modelagens de distribuição com o software Maxent. Foram escolhidas duas unidades de conservação, onde foram realizadas coletas de amostras fecais, baseadas em faixas, para possibilitar a estimativa da densidade de animais nestas populações. Estabeleceu-se a distribuição geográfica potencial de M. nana no Brasil para os Estados do Paraná, Santa Catarina, norte e centro do Rio Grande do Sul, extremo sul de São Paulo e Mato Grosso do Sul. Porção leste do Paraguai e, na Argentina para a província de Missiones. A densidade da espécie para a região norte do Parque Nacional do Iguaçu foi de 1,9 ind/km2 e para o Parque Estadual Vila Rica do Espírito Santo foi de 5,5 ind/km2. A população potencial da espécie foi de 152.991 indivíduos, sendo 15.524 indivíduos a população dentro das áreas protegidas. Sugere-se a manutenção do estado de conservação da espécie como Vulnerável, tanto na lista Brasileira como na lista Internacional de fauna ameaçada de extinção. / The Brazilian dwarf brocket (Mazama nana) is a deer species that occupies the forests of southern Brazil, north of Argentina and east of Paraguay. It has been greatly affected by the drastic reduction of forested areas. It is also the less studied neotropical deer. Considering this situation, this project aimed to shed light on the species distribution along its range, to indicate conservation priority areas and estimate the density of two populations. Given the rarity and high elusiveness of the species, it is proposed the use of indirect methods to achieve this goal. Fecal samples collection based methodologies were used, followed by DNA extraction and subsequent molecular and genetic analysis. Fecal samples were tracked and collected in protected areas spread over south Brazil, with the help of a scat detection dog. After species identification by PCR/RFLP and samples spatialization, species distribution modeling was carried out using Maxent software suit. Two protected areas were chosen for a faecal sampling based on transects, in order to estimate the population density. Potential geographical distribution of M. nana in Brazil was stablished at states of Paraná, Santa Catarina, northern and center Rio Grande do Sul, extreme South of São Paulo and Mato Grosso do Sul. Also at Eastern Paraguay and Missiones province in Argentina. Species density at the northern area of Iguaçu National Park was 1.9 ind/km2 and at the State Park of Vila Rica do Espírito Santo was 5.5 ind/km2. The species potential population was 152,991 individuals, including 15,524 individuals inside protected areas. It is suggested to maintain species conservation status as vulnerable on the Brazilian and on the International red list of threatened species.

O gênero Mazama é composto por cinco espécies no Brasil. São animais de visualização dificultada por causa de comportamentos evasivos, o que torna as capturas e os estudos comportamentais quase impossíveis. Assim, o uso de metodologias não invasivas para estudos ecológicos e genéticos destas espécies se torna necessário. A análise do DNA fecal está dentro das técnicas mais promissoras para esse fim. Este estudo objetivou genotipar amostras fecais, de uma população de veado-mateiro (Mazama americana) para a obtenção de informações genéticas e ecológicas. Para tanto, foram coletadas, com auxílio de um cão farejador, georreferenciadas e estocadas em etanol absoluto, 52 amostras fecais de cervídeos. A coleta realizou-se em um fragmento (21o20S 47o17W) de 600 ha de floresta estacional semidecidual. Dessas amostras coletadas, 31% (n=16) foram classificadas como frescas e 69% (n=36) como não frescas. O DNA foi extraído em torno de 30 dias após a coleta, usando o kit comercial QIAamp® DNA Stool Mini Kit, seguindo o protocolo do fabricante. Das 52 amostras, 45 foram identificadas por PCR/RFLP como pertencentes a M. americana e as demais apresentaram problemas de amplificação e digestão, permanecendo sem identificação. Amplificaram-se por PCR cinco locos microssatélites, e o sucesso de amplificação, visualizado em gel de agarose, variou com o tamanho dos locos e com a classe das amostras. O sucesso de amplificação foi de 65% das amostras da categoria fresca e 35% das amostras da categoria não fresca. Encontrou-se uma correlação negativa (R= -0,82) entre o tamanho dos fragmentos dos locos de microssatélites e o sucesso de amplificação. Foi possível identificar o sexo do animal em 43,7% das amostras fecais, pela amplificação do gene da amelogenina. Os locos microssatélites amplificados foram analisados em sequenciador automático. Os eletroferogramas gerados pelo seqüenciador impossibilitaram a genotipagem da maioria dos locos e amostras, tornando inviável qualquer análise genética e ecológica com confiabilidade. Fica evidente a dificuldade de se trabalhar com a metodologia do DNA fecal para a identificação individual e sexagem de amostras obtidas de Cervídeos florestais em vida livre. Algumas melhorias metodológicas (coleta de amostras fecais frescas, seleção de iniciadores para locos menores e quantificação do DNA extraído por PCR em tempo real) são sugeridas para o aumento nos índices de sucesso na genotipgem em estudos futuros. / Mazama genus is composed by five species in Brazil. All of them are difficult to observe due to their evasive behaviors, what makes the captures and behavioral studies almost impossible. Thus, the use of non invasive methodologies is necessary to study the ecology and genetics of these species. The fecal DNA analysis is one of the most promising techniques for this purpose. This study aimed to genotype a Mazama americana population faecal samples for obtaining genetics and ecological information. For this, 52 deer faecal samples were collected in a 600ha seasonal semideciduos forest fragment (21o20S 47o17W), with the help of a detection dog, stored in ethanol and georeferenced. Of these samples 31% (n=16) was classified as fresh and 69% (n=36) as not fresh. About thirty days after the collection the DNA was extracted using the QIAamp® DNA Stool Mini Kit following the manufacturers instructions. From the 52 samples collected and extracted, 45 were identified by PCR/RFLP as M. americana and the others showed amplification and digestion problems, remaining without identification. Five microsatellite loci were amplified by PCR and the amplification success, visualized in agarose gel, varied with the loco size and age class. The amplifications success occurred in 65% of the fresh samples and in 35% of the non-fresh samples and a negative correlation (R= -0.82) was found between amplification success and loci sizes. It was possible to identify the animal sex in 43% of the samples by the amelogenin gene. The microsatellite loci amplifications were analyzed in an automatic sequencer. The majority of the samples and loci were impossible to genotype because of the quality of the elestroferograms, what made impossible any reliable genetic and ecological analysis. It is evident the difficulty to work with the faecal DNA methodology using field collected forests deer samples for individual and sexual identifications. Some methodological improvements (collect fresh samples, select primers for shorter loci and quantify the extracted DNA by real time PCR) are suggested to increase the genotyping success indexes in future studies

O veado-mão-curta (Mazama nana) é uma espécie de cervídeo que ocupa a região Sul do Brasil, norte da Argentina e leste do Paraguai, tendo sido severamente afetada pela redução drástica das áreas florestadas. Trata-se, também, da espécie de cervídeo neotropical menos estudada pela ciência. Frente a essa situação, o presente projeto propôs-se a entender como essa espécie se distribui em sua área de ocorrência, propôs áreas prioritárias para sua conservação e estimou a densidade de duas populações. Dada a raridade e a alta elusividade da espécie, propôs-se o uso de metodologias indiretas para se atingir o objetivo proposto. Assim, foram usadas metodologias baseadas na coleta de amostras fecais, extração do DNA e posterior análises molecular e genética. Foram coletadas amostras fecais com o auxílio de um cão farejador em unidades de conservação distribuídas ao longo do Sul do Brasil. Após a identificação da espécie por meio da amplificação de um fragmento do citocromo B e corte com enzimas de restrição (PCR/RFLP) e com os dados de localização das amostras, foram feitas modelagens de distribuição com o software Maxent. Foram escolhidas duas unidades de conservação, onde foram realizadas coletas de amostras fecais, baseadas em faixas, para possibilitar a estimativa da densidade de animais nestas populações. Estabeleceu-se a distribuição geográfica potencial de M. nana no Brasil para os Estados do Paraná, Santa Catarina, norte e centro do Rio Grande do Sul, extremo sul de São Paulo e Mato Grosso do Sul. Porção leste do Paraguai e, na Argentina para a província de Missiones. A densidade da espécie para a região norte do Parque Nacional do Iguaçu foi de 1,9 ind/km2 e para o Parque Estadual Vila Rica do Espírito Santo foi de 5,5 ind/km2. A população potencial da espécie foi de 152.991 indivíduos, sendo 15.524 indivíduos a população dentro das áreas protegidas. Sugere-se a manutenção do estado de conservação da espécie como Vulnerável, tanto na lista Brasileira como na lista Internacional de fauna ameaçada de extinção. / The Brazilian dwarf brocket (Mazama nana) is a deer species that occupies the forests of southern Brazil, north of Argentina and east of Paraguay. It has been greatly affected by the drastic reduction of forested areas. It is also the less studied neotropical deer. Considering this situation, this project aimed to shed light on the species distribution along its range, to indicate conservation priority areas and estimate the density of two populations. Given the rarity and high elusiveness of the species, it is proposed the use of indirect methods to achieve this goal. Fecal samples collection based methodologies were used, followed by DNA extraction and subsequent molecular and genetic analysis. Fecal samples were tracked and collected in protected areas spread over south Brazil, with the help of a scat detection dog. After species identification by PCR/RFLP and samples spatialization, species distribution modeling was carried out using Maxent software suit. Two protected areas were chosen for a faecal sampling based on transects, in order to estimate the population density. Potential geographical distribution of M. nana in Brazil was stablished at states of Paraná, Santa Catarina, northern and center Rio Grande do Sul, extreme South of São Paulo and Mato Grosso do Sul. Also at Eastern Paraguay and Missiones province in Argentina. Species density at the northern area of Iguaçu National Park was 1.9 ind/km2 and at the State Park of Vila Rica do Espírito Santo was 5.5 ind/km2. The species potential population was 152,991 individuals, including 15,524 individuals inside protected areas. It is suggested to maintain species conservation status as vulnerable on the Brazilian and on the International red list of threatened species.

O gênero Mazama é composto por cinco espécies no Brasil. São animais de visualização dificultada por causa de comportamentos evasivos, o que torna as capturas e os estudos comportamentais quase impossíveis. Assim, o uso de metodologias não invasivas para estudos ecológicos e genéticos destas espécies se torna necessário. A análise do DNA fecal está dentro das técnicas mais promissoras para esse fim. Este estudo objetivou genotipar amostras fecais, de uma população de veado-mateiro (Mazama americana) para a obtenção de informações genéticas e ecológicas. Para tanto, foram coletadas, com auxílio de um cão farejador, georreferenciadas e estocadas em etanol absoluto, 52 amostras fecais de cervídeos. A coleta realizou-se em um fragmento (21o20S 47o17W) de 600 ha de floresta estacional semidecidual. Dessas amostras coletadas, 31% (n=16) foram classificadas como frescas e 69% (n=36) como não frescas. O DNA foi extraído em torno de 30 dias após a coleta, usando o kit comercial QIAamp® DNA Stool Mini Kit, seguindo o protocolo do fabricante. Das 52 amostras, 45 foram identificadas por PCR/RFLP como pertencentes a M. americana e as demais apresentaram problemas de amplificação e digestão, permanecendo sem identificação. Amplificaram-se por PCR cinco locos microssatélites, e o sucesso de amplificação, visualizado em gel de agarose, variou com o tamanho dos locos e com a classe das amostras. O sucesso de amplificação foi de 65% das amostras da categoria fresca e 35% das amostras da categoria não fresca. Encontrou-se uma correlação negativa (R= -0,82) entre o tamanho dos fragmentos dos locos de microssatélites e o sucesso de amplificação. Foi possível identificar o sexo do animal em 43,7% das amostras fecais, pela amplificação do gene da amelogenina. Os locos microssatélites amplificados foram analisados em sequenciador automático. Os eletroferogramas gerados pelo seqüenciador impossibilitaram a genotipagem da maioria dos locos e amostras, tornando inviável qualquer análise genética e ecológica com confiabilidade. Fica evidente a dificuldade de se trabalhar com a metodologia do DNA fecal para a identificação individual e sexagem de amostras obtidas de Cervídeos florestais em vida livre. Algumas melhorias metodológicas (coleta de amostras fecais frescas, seleção de iniciadores para locos menores e quantificação do DNA extraído por PCR em tempo real) são sugeridas para o aumento nos índices de sucesso na genotipgem em estudos futuros. / Mazama genus is composed by five species in Brazil. All of them are difficult to observe due to their evasive behaviors, what makes the captures and behavioral studies almost impossible. Thus, the use of non invasive methodologies is necessary to study the ecology and genetics of these species. The fecal DNA analysis is one of the most promising techniques for this purpose. This study aimed to genotype a Mazama americana population faecal samples for obtaining genetics and ecological information. For this, 52 deer faecal samples were collected in a 600ha seasonal semideciduos forest fragment (21o20S 47o17W), with the help of a detection dog, stored in ethanol and georeferenced. Of these samples 31% (n=16) was classified as fresh and 69% (n=36) as not fresh. About thirty days after the collection the DNA was extracted using the QIAamp® DNA Stool Mini Kit following the manufacturers instructions. From the 52 samples collected and extracted, 45 were identified by PCR/RFLP as M. americana and the others showed amplification and digestion problems, remaining without identification. Five microsatellite loci were amplified by PCR and the amplification success, visualized in agarose gel, varied with the loco size and age class. The amplifications success occurred in 65% of the fresh samples and in 35% of the non-fresh samples and a negative correlation (R= -0.82) was found between amplification success and loci sizes. It was possible to identify the animal sex in 43% of the samples by the amelogenin gene. The microsatellite loci amplifications were analyzed in an automatic sequencer. The majority of the samples and loci were impossible to genotype because of the quality of the elestroferograms, what made impossible any reliable genetic and ecological analysis. It is evident the difficulty to work with the faecal DNA methodology using field collected forests deer samples for individual and sexual identifications. Some methodological improvements (collect fresh samples, select primers for shorter loci and quantify the extracted DNA by real time PCR) are suggested to increase the genotyping success indexes in future studies

The field of conservation genetics, in combination with non-invasive sampling, provides a powerful set of tools for investigating the conservation status and natural history of rare species that are otherwise difficult to study. A systematic literature review demonstrated that this is certainly the case for many forest associated antelope species, which are poorly studied and yet constitute some of the most heavily hunted wildlife in Africa. The aim of the present study was to use non-invasive sampling to investigate genetic patterns in forest antelope populations in the high-biodiversity Udzungwa Mountains, Tanzania, within the context of the conservation of these species and the wider ecosystem. Genetic information was derived from faecal samples collected across the Udzungwa landscape and assigned to five antelope species (N = 618, collected 2006-09). Faecal pellet length was measured for a subset of samples but statistical assignment to species by this method proved unreliable. Phylogenetic analysis using mitochondrial control region sequences unexpectedly revealed that Harvey’s duiker within the Udzungwas are paraphyletic with respect to sequences from a putative sister species from southern Africa. However, there was no corresponding pattern in the microsatellite dataset suggesting that these mitochondrial lineages do not represent contemporary genetic isolation. Instead, Harvey’s duiker nuclear variation is shaped both by isolation by distance, due to positive spatial autocorrelation at short distances, and clustering of distinct genotypes from western outlying forests. These forests also harbour the endangered Abbott’s duiker and therefore require effective conservation management. Despite being detected throughout the Udzungwas, genetic diversity in Abbott’s duiker was very low in comparison to other species. These results suggest several promising research directions but also have significant conservation implications that will be disseminated to the Tanzanian wildlife authorities and the wider conservation community.