Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As toxinas A e B do Clostridium difficile (TcdA e TcdB) sÃo glicosiltransferases homÃlogas que inibem um grupo de pequenas GTPases dentro da cÃlula hospedeira, contudo, vÃrios mecanismos envolvidos na atividade patogÃnica dessas toxinas permanecem desconhecidos. No presente estudo, avaliamos os efeitos das TcdA e TcdB na via de Wnt/Beta-catenina que representa a forÃa motora principal responsÃvel pela proliferaÃÃo das cÃlulas epiteliais nas criptas colÃnicas. Foram utilizadas cÃlulas IEC-6 (cÃlulas epiteliais de criptas de Rattus novergicus) e RKO (cÃlulas de adenocarcinoma de cÃlon humano). Estas cÃlulas foram estimuladas com meio condicionado contendo Wnt3a e incubadas com 10, 50 ou 100 ng/mL de TcdA ou 1, 5 ou 10 ng/mL de TcdB por 24h, resultando em uma inibiÃÃo dose-dependente da via de sinalizaÃÃo canÃnica de Wnt, como demonstrado pelo ensaio de repÃrter de fator de cÃlula T (TCF). Esse resultado foi corroborado pelos dados da imunofluorescÃncia com marcaÃÃo para a localizaÃÃo nuclear de Beta-catenina e por western blotting para Beta-catenina e c-MYC (gene-alvo da via de Wnt). AlÃm disso, os dados do experimento de western blot evidenciaram uma diminuiÃÃo dos nÃveis da proteÃna Beta-catenina, o qual foi prontamente revertido por z-VAD-fmk, um pan-inibidor de caspase. Entretanto, a TcdA ainda foi capaz de inibir a via de Wnt/Beta-catenina mesmo na presenÃa do z-VAD-fmk, cloreto de lÃtio (um inibidor de GSK3Beta) ou plasmÃdeo de Beta-catenina constitutivamente ativo, como determinado pelo ensaio do TCF (TOPFlash/Luciferase). O estudo evidenciou ainda que a prÃ-incubaÃÃo de cÃlulas RKO com TcdA por 12h tambÃm atenuou a ativaÃÃo da via de Wnt mediada por Wnt3a, o que sugere que a inativaÃÃo de RhoGTPases, particularmente Rac1, possui um papel nessa inibiÃÃo. Em conclusÃo, esses achados sugerem que a inibiÃÃo da via canÃnica de Wnt pelas TcdA e TcdB representa um mecanismo importante da sua patogÃnese e explica seus efeitos anti-proliferativos. / Clostridium difficile toxins A and B (TcdA and TcdB) are homologous glycosyltransferases that inhibit a group of small GTPases within host cells, but several mechanisms underlying their pathogenic activity remain unclear. Here, we evaluated the effects of TcdA and TcdB on the Wnt/Beta-catenin pathway, the major driving force behind the proliferation of epithelial cells in colonic crypts. IEC-6 and RKO cells stimulated with Wnt3a-conditioned medium were incubated with 10, 50 and 100 ng/mL of TcdA or TcdB for 24h, resulting in a dose-dependent inhibition of the Wnt signaling, as demonstrated by a T-cell factor (TCF) reporter assay. This was further confirmed by immunofluorescence staining for nuclear localization of Beta-catenin and western blotting for Beta-catenin and c-Myc (encoded by a Wnt target gene). Moreover, our western blot analysis showed a decrease in the Beta-catenin protein levels, which was reversed by z-VAD-fmk, a pan-caspase inhibitor. Nonetheless, TcdA was still able to inhibit the Wnt/Beta-catenin pathway even in the presence of z-VAD-fmk, lithium chloride (a GSK3B inhibitor), or constitutively active Beta-catenin, as determined by a TCF reporter assay. Furthermore, pre-incubation of RKO cells with TcdA for 12h also attenuated Wnt3a-mediated activation of Wnt signaling, suggesting that inactivation of Rho GTPases plays a significant role in that inhibition. Taken together, these findings suggest that attenuation of the Wnt signaling by TcdA and TcdB is important for their anti-proliferative effects.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / DistÃrbios cardiovasculares como a insuficiÃncia cardÃaca e sÃndrome coronariana aguda ocasionam com frequÃncia desordens gastrintestinais, sugerindo a interveniÃncia do sistema cardiovascular no trato gastrintestinal (TGI). VariaÃÃes agudas da volemia alteram o comportamento motor do TGI, contudo, as intervenÃÃes utilizadas para investigar tal fenÃmeno, envolvem manobras invasivas. Assim, o objetivo deste trabalho consiste na avaliaÃÃo das variaÃÃes posturais passivas advindas do teste de inclinaÃÃo como ferramenta nÃo-invasiva para promover a redistribuiÃÃo espontÃnea da volemia e analisar os ajustes fisiolÃgicos advindos desta modificaÃÃo hemodinÃmica. Para tal, ratos foram anestesiados, dotando-os de cateteres e realizaÃÃo de gastrostomia para obtenÃÃo da monitoraÃÃo hemodinÃmica e anÃlise da motilidade gastrintestinal. No oitavo dia apÃs as cirurgias, os ratos foram submetidos por 75 min à monitoraÃÃo contÃnua da PressÃo Arterial MÃdia (PAM, mmHg), FrequÃncia CardÃaca (FC, b.p.m.), PressÃo Venosa Central (PVC, mmHg) e DÃbito CardÃaco (DC, mL/min). ApÃs os 30 min iniciais de monitoraÃÃo (perÃodo basal), os ratos foram alimentados com a refeiÃÃo teste (vermelho de fenol 0,75 mg/ml e glicose 5%), via sonda gÃstrica. Em seguida, foram submetidos à sÃbita mudanÃa postural: Grupo aclive (tilt up +75Â) ou Grupo declive (tilt down -75o), ou mantidos sob posiÃÃo horizontal (Grupo controle). Decorridos 10, 20 ou 30 min, os animais foram eutanasiados para avaliaÃÃo da recuperaÃÃo fracional do corante no estÃmago. Em seguida foi avaliado o trÃnsito intestinal por infusÃo de refeiÃÃo teste via sonda gÃstrica diretamente no intestino delgado 10 min pÃs prandial. Via manometria foi realizada a avaliaÃÃo das contraÃÃes gÃstricas por meio de um balÃo inserido no estÃmago, para determinaÃÃo da frequÃncia e amplitude das contraÃÃes gÃstricas, e o Ãndice de motilidade. O aclive (tilt up +75Â) aumentou (P<0,05) a PAM, FC e o DC. A PVC apresentou uma resposta bifÃsica (P<0,05). No contexto do comportamento motor gastrintestinal, o aclive por sua vez acelerou (P<0,05) o esvaziamento gÃstrico de lÃquido e deslocou a linha de base da manometria, sugerindo o aumento no tÃnus gÃstrico. Jà o sÃbito declive (tilt down -75Â), aumentou (P<0,05) a PVC e o DC, bem como a FC e PAM. No TGI, o declive aumentou a (P<0,05) a retenÃÃo gÃstrica, enquanto reduziu a amplitude das contraÃÃes gÃstricas. Tanto o aclive quanto o declive nÃo modificaram o trÃnsito intestinal de lÃquido. Desta forma, mudanÃas posturais passivas, seja mediante o sÃbito aclive (tilt up +75Â) ou declive (tilt down -75Â), alÃm de ocasionar reajustes hemodinÃmicos modificam o comportamento motor do TGI em ratos acordados. / Cardiovascular disorders such as heart failure and acute coronary syndrome cause gastrointestinal disorders with frequency, suggesting the intervention of cardiovascular physiology in the gastrointestinal tract (GIT). Acute variations in blood volume change motor behavior of GIT, however, interventions used to investigate this phenomenon involve invasive procedures. Thus, postural changes resulting from passive tilt testing emerge as a noninvasive tool to promote spontaneous redistribution of blood volume and the analysis of the physiological role of this phenomenon. For such rats were anesthetized, endowing them with catheters and performing gastrostomy for obtaining hemodynamic monitoring and analysis of gastrointestinal motility. On the eighth day after surgery, the rats was submitted for 75 min to continuous monitoring of Mean Arterial Pressure (MAP, mmHg), Heart Rate (HR, b.p.m.), Central Venous Pressure (CVP, mmHg) and Cardiac Output (CO, mL / min). After the initial 30 minutes monitoring (baseline period), the rats were fed the test meal (phenol red 0.75 mg / ml and 5% glucose) via gastric tube. Then underwent sudden postural change: Group tilt up (+75 Â) or tilt down group (-75 Â), or kept in a horizontal position (control group). After 10, 20 or 30 min, animals were euthanized for evaluation of the fractional recovery of the dye in the stomach. Then we evaluated the intestinal transit by infusion of test meal via gastric tube directly into the small intestine 10 min postprandial. Manometry were performed via the evaluation of gastric contractions by a balloon inserted into the stomach to determine the frequency and amplitude of gastric contractions and motility index. The tilt up (+ 75 Â) increased (P <0.05) the MAP, HR and the CO. CVP showed a biphasic response (P<0.05). In the context of gastrointestinal motor behavior, the tilt-up accelerated (P<0.05) the gastric emptying of liquid and shifted baseline manometry, suggesting an increase in gastric tone. Have a sudden tilt down (-75Â) increased (P<0.05) the PVC and CO, as well as the HR and MAP. GIT in the tilt down increased (P<0.05) gastric retention, while reducing the amplitude of gastric contractions. Both tilt up and tilt down not modify the intestinal transit liquid. Thus, passive position changes, either by sudden tilt up (+75Â) or tilt down (-75Â), and increases to cause hemodynamic changes the motor behavior of the gut in awake rats.

MinistÃre de l'Enseignement SupÃrieur et de la Recherche / A Pentoxifilina (PTX) à uma metilxantina que produz efeitos farmacolÃgicos, por mecanismos como: inibiÃÃo de fosfodiesterases, aumento nos nÃveis de AMPc e GMPc e antagonismo de receptores de adenosina. Apresenta tambÃm efeitos anti-inflamatÃrios, decorrentes da inibiÃÃo da sÃntese de TNF-alfa. Estudos mostraram aÃÃes neuroprotetoras da PTX, em modelos experimentais in vivo e in vitro. O presente trabalho estudou, por meio de avaliaÃÃes comportamental, neuroquÃmica, histolÃgica e imunohistoquÃmica, os possÃveis efeitos da PTX em modelos experimentais de doenÃa de Parkinson (DP) in vivo (lesÃo unilateral estriatal com 6-OHDA) e in vitro (cÃlulas SH-SY5Y). Para isso, dividiram-se ratos machos Wistar (220-250 g) em cinco grupos de 9 a 20 animais cada: falso-operado (FO, submetidos a injeÃÃo intraestriatal de salina), 6-OHDA (lesionados com 6-OHDA), 6-OHDA+PTX10, 6-OHDA+PTX25 e 6- OHDA+PTX50 (lesionados e tratados durante 2 semanas com PTX, nas doses de 10, 25 e 50 mg/kg, v.o.). Os resultados mostraram que o comportamento rotacional contralateral, induzido pela apomorfina e aumentado no grupo lesionado, foi revertido pelo tratamento com PTX. Enquanto a atividade locomotora, avaliada pelo teste do campo aberto, diminuiu com 6-OHDA em relaÃÃo ao grupo FO, tal efeito foi em parte revertido pela PTX, o mesmo ocorrendo com o comportamento de rearing. Mostrou-se tambÃm que a PTX nÃo interferiu no comprometimento da memÃria operacional, observado no grupo lesionado. Ademais, o aumento no tempo de imobilidade (teste do nado forÃado), indicativo de efeito depressivo visto no grupo lesionado foi revertido pelo tratamento com PTX, resultado similar ao do grupo FO. Os nÃveis de dopamina (DA) e DOPAC (metabÃlito da DA) diminuÃram no corpo estriado do grupo lesionado, este efeito foi em parte revertido pela PTX, na dose de 50 mg/kg. AlÃm disso, os nÃveis de glutamato e glicina foram aumentados e reduzidos, respectivamente, no grupo lesionado em relaÃÃo ao FO, tais alteraÃÃes foram revertidas pela PTX. Nos estudos histopatolÃgicos (violeta de cresil e Fluoro Jade B) foi evidenciada uma preservaÃÃo da citoarquitetura celular nos grupos lesionado apÃs tratamento com PTX. A imunoreatividade para tirosina hidroxilase (TH) e transportador de dopamina (DAT) reduziram-se, de modo significativo, no lado direito (lesionado) do grupo 6-OHDA, com relaÃÃo aos lesionados e tratados com PTX. Resultados semelhantes foram observados com a imunomarcaÃÃo para DAT. A imunoreatividade para GFAP (marcador de astrÃcitos) reduziu-se no mesencÃfalo do grupo lesionado e tratado com PTX, em relaÃÃo ao lesionado e nÃo-tratado, e para OX-42 (marcador de micrÃglia) foi reduzida no corpo estriado. Ensaios imunohistoquÃmicos para TNF-alfa mostraram que o aumento da imunomarcaÃÃo, no corpo estriado do grupo lesionado (lado direito), foi atenuado apÃs PTX. Observaram-se resultados semelhantes nas Ãreas CA1 e CA3 do hipocampo. Estes dados mostram que, pelo menos parte, a aÃÃo neuroprotetora da PTX deve-se à inibiÃÃo de TNF-alfa, resultado este reforÃado pelos efeitos anti-COX-2 e anti-iNOS, vistos no estriado e hipocampo dos grupos lesionados, apÃs tratamento com PTX. Por fim, PTX em cÃlulas SH-SY5Y mostrou efeitos citoprotetor, anti-inflamatÃrio e antioxidante. Nossos resultados sugerem, assim, potencial efeito neuroprotetor da PTX, possivelmente decorrente de sua propriedade anti-inflamatÃria e da atuaÃÃo benÃfica nos sistemas dopaminÃrgico, glutamatÃrgico e glicinÃrgico, tornando-a uma opÃÃo terapÃutica para o tratamento de doenÃas neurodegenerativas como a DP. / Pentoxifylline (PTX) is a methylxanthine derivative that produces pharmacological effects by mechanisms as phosphodiesterase inhibition, increase in cAMP and cGMP levels and antagonism of A2A adenosine receptors. The drug also shows anti- inflammatory properties, due to the inhibition of TNF-alpha synthesis. The present work studied, by behavioral, neurochemical, histological and immunohistochemical methods, the possible neuroprotective PTX effects in an experimental model of Parkinsonâs disease (PD), in vivo (striatal lesion with 6-OHDA in rats) and in vitro (SN-SY5Y cells). For the in vivo study, male Wistar rats (220-250 g) were divided into groups of 9 to 20 animals each, as follows: sham-operated (SO, subjected to a striatal injection of saline); 6-OHDA (subjected to a 6-OHDA injection into the right striatum); and 6-OHDA followed by the daily oral administration of PTX (10, 25 and 50 mg/kg), for two weeks. The results showed that the increased apomorphine-induced rotational behavior, observed in the 6-OHDA group, was greatly reduced in the 6-OHDA+PTX groups, towards the SO values. While the locomotor activity decreased in the 6-OHDA group, this parameter was in part reversed in the 6-OHDA+PTX groups and the same was observed with the rearing behavior. On the other hand, PTX did not seem to interfere significantly with the operational memory, as assessed by the Cued Water Maze test, but reversed the increase in the immobility time (indicative of depression) seen in the untreated 6-OHDA group. Furthermore, we showed that while striatal DA and DOPAC levels were significantly decreased in the lesioned right striatum of the 6- OHDA group, as related to the SO controls, this effect was partly reverted by the high PTX dose. In addition, glutamate (excitatory neurotransmitter) and glycine (inhibitory neurotransmitter) concentrations increased and decreased, respectively, in the untreated 6-OHDA-lesioned group, as related to the SO group. Such alterations were reversed in the lesioned group, after PTX treatments. Histopathological analyses (cresyl violet and fluoro jade B) showed a preservation of the cellular architecture in the lesioned groups, after PTX treatments, as related to the untreated lesioned group. Besides, the immunoreactivities for tyrosine hydroxylase (TH, limiting step in the catecholamine synthesis) and dopamine transporter (DAT) were significantly reduced in the striatal right side (lesioned) of the untreated 6-OHDA group, as related to the striatal right sides of the 6-OHDA-PTX-treated groups. Similar results were observed for DAT. As far as immunohistochemistry data are concerned, we showed that, while the immunoreactivity for GFAP (astrocyte marker) was reduced in the mesencephalic tissue of the lesioned group after PTX treatments, as related to the untreated lesioned group, the same effect occurred with the immunoreactivity for OX-42 (microglia marker) in the striatum. Furthermore, the increase in the number of immunopositive cells for TNF-alpha (a pro- inflammatory cytokine) in the right lesioned striatum was attenuated, after PTX treatments. Similar results were seen in the CA1 and CA3 hippocampal areas, suggesting that PTX is possibly a neuroprotective drug and that this action is, at least in part, due to its TNF-alpha inhibitory activity. These results were supported by anti- COX-2 and anti-iNOS effects on the hippocampus and striatum of the lesioned group, after PTX treatments. Additionally, in SH-SY5Y cells (an in vitro model of PD), PTX also presented cytoprotective, anti-inflammatory and antioxidant effects. In conclusion, our results showed that the potential neuroprotective effects of PTX are a consequence of its anti-inflammatory activity and beneficial action on the dopaminergic, glutamatergic and glycinergic systems. Thus, our data suggest that PTX is a potential drug to be included into clinics, as a new therapeutic strategy for PD treatment.

nÃo hà / MinistÃre de l'Enseignement SupÃrieur et de la Recherche / Neste trabalho procuramos estudar os aspectos comportamentais como tambÃm as alteraÃÃes neuroquÃmicas em filhotes de 21 dias de ambos os sexos em mÃdia com 26g de peso, nascidos de fÃmeas de ratos Wistar onde foi administrados diariamente etanol em duas doses diferentes (0,5 e 4 g/Kg, via oral), por 30 dias antes da gravidez e durante todo o perÃodo gestacional. Os testes de campo aberto, labirinto em cruz elevado e nado forÃado foram utilizados para avaliar os efeitos do etanol na locomoÃÃo, ansiedade e depressÃo, respectivamente. Ensaios de binding foram usados para identificar receptores dopaminÃrgicos (D1 e D2) e muscarÃnicos (M1 + M2). Os resultados no teste de labirinto em cruz elevado indicaram aumento significante e dose-dependente no nÃmero de entradas e no tempo de permanÃncia nos braÃos abertos, nos filhotes expostos ao etanol no perÃodo prÃ-natal quando comparado com o controle, indicando um efeito ansiolÃtico. No teste do campo aberto, estes grupos apresentaram diminuiÃÃo na atividade locomotora espontÃnea assim como na ocorrÃncia de rearing e grooming. Os filhotes tambÃm apresentaram aumento do tipo dose-dependente no tempo de imobilidade no teste de nado forÃado, caracterizando um comportamento depressivo. DiminuiÃÃes observadas atravÃs de binding dopaminÃrgico nas Ãreas do hipocampo (D2= 32% e D1= 25%) e corpo estriado (D2= 30% e D1= 52%) foram detectados nos filhotes expostos ao etanol por outro lado, aumentos significantes foram observados no binding muscarÃnico no hipocampo (40%) como no corpo estriado (42%). Este estudo mostra evidÃncias que exposiÃÃes ao etanol na fase uterina produz efeitos em longo prazo no desenvolvimento e nas caracterÃsticas farmacolÃgicas dos sistemas cerebrais que podem ter importantes implicaÃÃes no comportamento e respostas neuroquÃmicas que ocorrem nos filhotes. / The work studied behavioral and neurochemical alterations in 21-day-old pups, from both sexes (26 g on average) born from female Wistar rats administered daily with ethanol (0.5 or 4.0 g/kg, p.o.), for 30 days before mating, and throughout their gestational period. Ethanol administration continued from delivery up to weaning. The open field, elevated plus maze and forced swimming tests were used to evaluate effects of ethanol on locomotion, anxiety and depression, respectively. Binding assays were used to identify dopaminergic (D1- and D2-like) and muscarinic (M1 plus M2) receptors. Results of the plus maze test indicated significant and dose- dependent increases in the number of entrances in the open arms and in the time of permanence in the open arms, in the prenatally ethanol-exposed offspring, as compared to controls, indicating an anxiolytic effect. In the open field test, this group presented decreases in spontaneous locomotor activity as well as in the occurrences of rearing and grooming. Offspring also showed dose-dependent increases in their immobility time in the forced swimming test, characterizing despair behavior. Decreases in the hippocampal (D2: 32%; D1: 25%) and striatal (D2: 30%; D1: 52%) dopaminergic binding were detected in ethanol-exposed offspring. On the other hand, significant increases were observed in muscarinic binding in the hippocampus (40%) as well as in the striatum (42%). This study shows evidence that in utero ethanol exposure produces a long-lasting effect on development and pharmacological characteristics of brain systems that may have important implications in behavioral and neurochemical responsiveness occurring in adulthood.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / IntroduÃÃo: O 5-fluorouracil (5-FU) à uma pirimidina utilizada em diversos protocolos para o tratamento do cÃncer e sua administraÃÃo causa diversos efeitos adversos. Recentemente, seu papel na perda Ãssea tem sido estudado, jà que o 5-FU mostrou diminuiÃÃo da densidade mineral Ãssea e inibiÃÃo do crescimento em ratos jovens. Assim, objetivou-se investigar se o efeito do 5-FU na reabsorÃÃo Ãssea alveolar induzida por ligadura em ratos. MÃtodos e resultados: 146 Ratos Wistar (180-220 g; n=6-10) foram divididos em quatro grupos em que receberam Ãgua destilada (2 ml/kg; IP) ou 5-FU (37,5, 75 ou 150 mg/kg; IP), 1 hora antes da colocaÃÃo da ligadura, sendo sacrificados no 11 dia. As hemiarcadas foram direcionadas anÃlises morfomÃtrica (mm2), histopatolÃgica e histomÃtrica (mm2). Adicionalmente, foram realizadas dosagens de citocinas (TNF-&#945; e IL- 1&#946;; pg/mg), MPO (U/mg) e fosfatase alcalina total e Ãssea (U/ml) Sobrevida, leucograma, variaÃÃo de massa corpÃrea e condiÃÃes hepÃticas, renais e esplÃnicas tambÃm foram avaliadas. p<0,05 foi considerado estatisticamente significante. O trabalho foi aprovado no comità de Ãtica em pesquisa. Observou-se que a ligadura causou uma importante perda Ãssea alveolar e na regiÃo de furca, aumento na atividade de MPO, nas concentraÃÃes de TNF-&#945; e IL-1&#946;, alÃm de diminuiÃÃo da FAO. Em relaÃÃo ao histopatolÃgico, foram observadas maiores lesÃes de furca, destruiÃÃo de osso alveolar e infiltrado inflamatÃrio em hemiarcadas do grupo NT em comparaÃÃo ao normal (p<0,05). Embora o 5-FU nÃo tenha sido capaz de aumentar a atividade de MPO em relaÃÃo ao grupo NT, ele promoveu uma exacerbaÃÃo da destruiÃÃo periodontal, evidenciando uma maior perda Ãssea alveolar e na regiÃo de furca (p<0,05). Outro aspecto observado foi o aumento nas concentraÃÃes de TNF-&#945; e IL-1&#946;. Ainda, o fÃrmaco promoveu diminuiÃÃo nos valores de FAO em relaÃÃo ao gruo normal (p<0,05). Os animais que receberam 5-FU tambÃm mostraram intensa destruiÃÃo das estruturas periodontais e presenÃa de infiltrado inflamatÃrio no histopatolÃgico. Sistemicamente, o 5-FU na dose de 150 mg/kg causou neutropenia, diminuiÃÃo na sobrevida e da massa corpÃrea dos animais. NÃo foram observadas alteraÃÃes nas condiÃÃes hepÃticas, renais ou esplÃnicas avaliadas. ConclusÃo: Em suma, a administraÃÃo de 5-FU exacerbou a reabsorÃÃo Ãssea induzida por ligadura e induziu o aumento de TNF-&#945; e IL-1&#946;, citocinas envolvidas no processo de reabsorÃÃo Ãssea. A neutropenia causada pela administraÃÃo do fÃrmaco pode ter contribuÃdo para exacerbar a destruiÃÃo das estruturas de suporte do dente. / Introduction: 5-fluorouracil (5-FU) is a highly used anticancer drug. Its administration causes several side effects and. its role in bone loss has been recently studied, since 5-FU showed a decrease in bone mineral density and growth inhibition in young rats. The aim of our study was to investigate the effect of 5-FU on the in ligature-induced bone resorption in rats. Methods and results: 146 Wistar rats (180-220 g) were divided in four groups that received distilled water (2 ml/kg, IP) or 5-FU (37.5, 75 or 150 mg/kg, IP 1 hour before the ligature placement. Sacrifice was performed at 11th day. Hemiarcades were submitted to macroscopic (mmÂ), histologic or histometric (mmÂ) analyses. In addition, cytokines (TNF-&#945; and IL-1&#946;; pg/mg) were dosed and the assessment of MPO activity (U/mg) and total and bone-specific alkaline phosphatase (U/ml) was performed. Survival, leukogram, body mass variation and liver, kidney and spleen conditions were also evaluated. p<0.05 was considered significant. The study was approved by the ethics committee in animal research. Ligature placement caused an important alveolar area bone loss, including the furcation area. It also caused an increase in the MPO activity, in the concentrations of TNF-&#945; e IL-1&#946;, and diminished bone-specific alkaline phosphatase. It was observed greater furcation lesions, alveolar bone destruction and an increase in the inflammatory infiltrate when compared to normal (p<0.05). Although 5-FU did not increase MPO activity when compared with NT, it promoted an exacerbation of the periodontal destruction, with a severe alveolar bone loss, including the furcation area when compared with NT (p<0.05). Another finding was the increased concentration of TNF-&#945; e IL-1&#946;. In addition, 5-FU groups presented lower values of bone-specific alkaline phosphatase when compared to normal (p<0.05). It was also observed a severe destruction of the periodontum and a marked inflammatory infiltrate. Systemically, 5-FU (150 mg/kg) caused neutropenia, diminished rate of survival and loss of weight. Finally, it was not observed alterations in the hepatic, renal, or splenic conditions. Conclusion: Briefly, 5-FU increased ligature-induced bone resorption and the concentration of TNF-&#945; and IL-1&#946;, cytokines that are involved in the bone resorption process. Neutropenia was caused by the administration of the drug and contributed to exacerbate the destruction of the periodontium.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A mangiferina à uma glicosilxantona encontrada em algumas plantas medicinais utilizadas tradicionalmente, que tem mostrado mÃltiplos efeitos farmacolÃgicos, como antioxidante, anti-inflamatÃrio e gastroprotetor. A mangiferina utilizada neste trabalho foi extraÃda e isolada a partir das cascas do caule de Mangifera indica L. (mangueira), e seu efeito prÃ-cinÃtico foi investigado utilizando-se modelos experimentais de motilidade gastrintestinal em camundongos. Mangiferina acelerou significativamente o trÃnsito gastrintestinal nas doses orais de 30 e 100 mg/kg (89% e 93%, respectivamente), comparada ao controle veÃculo (63%). Tegaserode (1mg/kg, i.p.), um prÃ-cinÃtico conhecido, estimulou o trÃnsito gastrintestinal (81%). Em uma segunda sÃrie de experimentos, camundongos foram usados para estudar o efeito da mangiferina (30 mg/kg, v.o.) no retardo do trÃnsito gastrintestinal causado por morfina, clonidina, capsaicina, verapamil, ondansetrona ou atropina. Enquanto a co-administraÃÃo de mangiferina reverteu totalmente os efeitos inibitÃrios de morfina, ondansetrona e capsaicina no trÃnsito gastrintestinal, o retardo no trÃnsito causado por clonidina e verapamil foram apenas revertidos parcialmente. A atropina bloqueou completamente o efeito estimulante da mangiferina, sugerindo o envolvimento de receptores muscarÃnicos de acetilcolina. AlÃm disso, a mangiferina (30 e 100 mg/kg, v.o.) aumentou significativamente o esvaziamento gÃstrico em camundongos. Mangiferina, nas doses de 100 mg/kg e 300 mg/kg, e tegaserode 1 mg/kg aumentaram significativamente a saÃda de pelotas fecais em 52%, 40% e 80%, respectivamente, quando comparado à produÃÃo fecal em camundongos tratados com veÃculo. O grupo tegaserode elevou o conteÃdo de Ãgua nas fezes (59%) em relaÃÃo ao controle veÃculo (51%). O Ãleo PÃs-OperatÃrio (IPO) em camundongos foi caracterizado por reduÃÃo do trÃnsito gastrintestinal acompanhada por uma resposta inflamatÃria intestinal. IPO causou uma reduÃÃo significativa do trÃnsito gastrintestinal (46,46  4,56%) quando comparado ao grupo sham (75,09  1,88%). O tratamento oral com mangiferina (30 e 100 mg/kg) acelerou o trÃnsito gastrintestinal, reduziu a atividade da mieloperoxidase, reduziu os nÃveis de nitrato/nitrito e de mediadores inflamatÃrios (TNF-&#945;, IL-1&#946;, IL-6, MCP-1) em camundongos, comparado ao controle veÃculo respectivo. O tratamento com mangiferina reduziu a inflamaÃÃo e protegeu o Ãleo do dano histolÃgico induzido por IPO, alÃm de reduzir a imunoreatividade de NF-&#954;B e iNOS no Ãleo. Este estudo indica o efeito prÃ-cinÃtico da mangiferina, sugerindo que a droga venha a ser uma alternativa Ãs drogas prÃ-cinÃticas disponÃveis para o tratamento de distÃrbios gastrintestinais, como constipaÃÃo, dispepsia e Ãleo pÃs-operatÃrio. / Mangiferin is a glucosylxanthone encountered in several traditionally used medicinal plants that has been shown to exhibit multiple pharmacological effects that include antioxidant, anti-inflammatory and gastroprotective. Mangiferin used in this study was extracted and isolated from the stem bark of Mangifera indica L. (mango), and its prokinetic effect was investigated using experimental models of gastrointestinal motility in mice. Mangiferin significantly accelerated gastrointestinal transit at oral doses of 30 and 100 mg/kg (89% and 93%, respectively), compared with the vehicle control (63%). Tegaserod (1mg/kg, i.p.), a known prokinetic, stimulated gastrointestinal transit (81%). In the second series of experiments, mice were used to study the effect of mangiferin (30 mg/kg, po) on gastrointestinal transit delay caused by morphine, clonidine, capsaicin, verapamil, ondansetron or atropine. While co-administered mangiferin totally reversed the inhibitory effects of morphine, ondansetron and capsaicin on gastrointestinal transit, the transit delays caused by clonidine and verapamil were only partially reversed. Atropine completely blocked the stimulant effect of mangiferin, suggesting the involvement of muscarinic acetylcholine receptor. Also, mangiferin (30 and 100 mg/kg, po) significantly increase gastric emptying in mice. Mangiferin at doses of 100 mg/kg and 300 mg/kg, and tegaserod at 1 mg/kg significantly enhanced the fecal pellets output by 52%, 40%, and 80%, respectively, when compared to fecal output in vehicle treated mice. Tegaserod group elevated water content (59%) relative to the vehicle-treated control (51%). Postoperative ileus (POI) in mice was characterized by decreased gastrointestinal transit accompanied by an intestinal inflammatory response. POI caused a significant decrease (46,46  4,56%) of gastrointestinal transit when compared to sham control (75,09  1,88%). The oral treatment with mangiferin (30 and 100 mg/kg) accelerated gastrointestinal transit, reduced myeloperoxidase activity, reduced nitrate/nitrite and inflammatory mediators (TNF-&#945;, IL-1&#946;, IL-6, MCP-1) levels in mice compared to respective vehicle control. Treatment with mangiferin reduced the inflammation and protected the ileus from histological damage induced by POI, and reduced the NF-&#954;B and iNOS immunoreactivity in the ileum. This study indicate the prokinetic action of mangiferin and suggests that could be an alternative to available prokinetic drugs for the treatment of gastrointestinal disturbances such as constipation, dyspepsia and postoperative ileus.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / &#946;-Citronelol à um monoterpeno encontrado no Ãleo essencial de diversas plantas aromÃticas utilizadas na medicina popular para tratar hipertensÃo, como a Cymbopogon citratus. O &#946;-citronelol possui propriedades hipotensoras e vasorrelaxantes, porÃm seu mecanismo ainda nÃo està claro. Portanto, o presente estudo foi realizado para abordar essa questÃo em ratos normotensos. Para os experimentos in vivo, ratos Wistar macho foram submetidos a cateterizaÃÃo da artÃria e veia femoral esquerda para registro da pressÃo arterial mÃdia e para administraÃÃo de substÃncias, respectivamente. Eletrodos permitiram o registro da frequÃncia cardÃaca e certos grupos de animais foram traqueostomizados para anÃlise da frequÃncia respiratÃria. Para os experimentos in vitro, os Ãtrios direito e esquerdo, e anÃis de artÃria mesentÃrica foram suspensos em cubas para ÃrgÃos isolados sob condiÃÃes fisiolÃgicas. Em ratos anestesiados com uretana, injeÃÃes intravenosas (i.v.) de &#946;-citronelol (5 e 10 mg/kg) causaram hipotensÃo, bradicardia e apneia em duas fases (fase 1 e fase 2), assim como em animais acordados (5, 10 e 20 mg/kg). A fase 1 dessa trÃade (1 â 2 s de latÃncia), foi abolida pela vagotomia bilateral (BV), pelo tratamento perineural com capsaicina (TP) ou pelo prÃ-tratamento com metilatropina (MA, i.v.), assim como pela injeÃÃo do &#946;-citronelol dentro do ventrÃculo esquerdo, mas manteve-se inalterada pelo prÃ-tratamento i.v. com capsazepina, ondansetrona, suramina ou HC-030031. A fase 2 tardia de bradicardia foi tambÃm reduzida pela BV, TP ou MA, enquanto que a apneia de fase 2 foi abolida apenas pela suramina. Em preparaÃÃes atriais, o &#946;-citronelol induziu efeito cronotrÃpico e inotrÃpico negativos, os quais nÃo parecem estar envolvidos com receptores muscarÃnicos ou adrenÃrgicos, ou alteraÃÃes no influxo de cÃlcio. Em anÃis de artÃria mesentÃrica, com e sem endotÃlio, o &#946;-citronelol relaxou totalmente prÃ-contraÃÃes de fenilefrina com equiparÃvel potÃncia. Esses resultados revelam que a fase 1 de efeitos do &#946;-citronelol origina-se atravÃs de um reflexo vago-vagal resultante da estimulaÃÃo de aferÃncias pulmonares vagais, que parecem nÃo envolver receptores TRPV1, TRPA1, 5-HT3 ou P2X. A fase 2 de hipotensÃo e bradicardia parece resultar de uma aÃÃo de vasodilataÃÃo direta e de um efeito cardÃaco depressor, respectivamente. AlÃm disso, receptores P2X parecem estar envolvidos na mediaÃÃo da resposta de fase 2 de apneia induzida por esse monoterpeno acÃclico. / &#946;-Citronellol is a monoterpene found in the essential oil of various aromatic plants used in folk medicine to treat hypertension such as Cymbopogon citratus. &#946;-Citronellol possesses hypotensive and vasorelaxant properties, but the mechanism of such effects remains unclear. Therefore, the present study was undertaken to address this issue in normotensive rats. For in vivo experiments, male Wistar rats were subjected to catheterization of the left femoral artery and vein for mean arterial pressure monitoring and drug injection, respectively. Electrodes allowed heart rate recordings and some groups of rats were tracheostomized for respiratory rate analysis. For in vitro experiments, right and left atria, and mesenteric artery rings were suspended in organ baths at physiological conditions. In urethane-anesthetized rats, intravenous (i.v.) injections of &#946;-citronellol (5 and 10 mg/kg) caused biphasic (phase 1 and phase 2) hypotension, bradycardia and apnea responses. Biphasic responses was observed also following i.v. injection of &#946;-citronellol (5, 10 and 20 mg/kg) in unanesthetized rats. Phase 1 of this triad (onset time of 1-2 s) was abolished by bilateral vagotomy (BV), perineural treatment with capsaicin (PNT) or pretreatment with methylatropine (MA, i.v.), but remained unaltered by i.v. pretreatment with capsazepine, ondansetron, suramin or HC-030031. Phase 1 responses was absent when &#946;-citronellol was injected into the left ventricle. The delayed phase 2 of bradycardia was also partially reduced by BV, PNT or MA while the apnea component of this phase 2 was only abolished by suramin. In atrial preparations, &#946;-citronellol induced chronotropic and inotropic negative responses, an effect that was related to neither muscarinic and adrenergic receptor activation nor to altered calcium influx. In both endothelium-intact and denuded mesenteric artery rings, &#946;-citronellol fully relaxed phenylephrine-induced contractions in a concentration-dependent manner and with equal potency. These findings reveal that the effects evoked by &#946;-citronellol induced vago-vagal reflex due to stimulation of vagal pulmonary afferents, an effect that seems not involving TRPV1, TRPA1, 5-HT3, or P2X receptors. Phase 2 hypotensive and bradycardiac responses to &#946;-citronellol appears resulting from a direct vasodilatory effect upon vascular smooth muscle and cardiac depressor action, respectively. Furthermore, P2X receptors seem to be involved in the mediation of phase 2 apneic response to this acyclic monoterpene.

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-13T18:53:46Z No. of bitstreams: 1 TESE Amanda Karolina Soares e Silva.pdf: 12641265 bytes, checksum: 1a842be4e6f39b5a7034c9b30f4c02af (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-13T18:53:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Amanda Karolina Soares e Silva.pdf: 12641265 bytes, checksum: 1a842be4e6f39b5a7034c9b30f4c02af (MD5) Previous issue date: 2015-06-30 / CNPQ / A doença do fígado gorduroso não-alcoólico (NAFLD) refere-se a um amplo aspectro de doenças hepáticas causadas pelo depósito de gordura nas células do fígado na ausência do consumo de álcool. Provas evidentes demonstram que a NAFLD desempenha um papel relevante na patogênese da aterosclerose. As tiazolidinadionas (TZDs) agem como meléculas sensibilizadoras da ação da insulina e têm sido utilizadas no tratamento de pacientes com diabetes do tipo 2 e outras condições de resistência à insulina, incluindo a NAFLD. Uma vez que a aterosclerose e NAFLD podem compartilhar mecanismos comuns, estratégias terapêuticas similares poderiam ser empregadas no tratamento de ambas as doenças. No presente estudo, foi avaliado a atividade biológica de LPSF/GQ-02 na patogênese da NAFLD e aterosclerose. Os resultados obtidos com um modelo murino de NAFLD indicaram que a LPSF/GQ-02 foi eficaz em melhorar a arquitetura hepática, diminuindo a acumulação de gordura, reduzindo a quantidade de colágeno, diminuindo a inflamação através da redução da IL-6, iNOS, COX-2 e F4/80, e aumento da expressão de proteínas de IκBα citoplasmática, NFkB-65, eNOS e IRS-1 em camundongos deficientes do receptor de LDL (LDLr-/-). Além disso, ambos os tratamentos (15 e 30 dias) com LPSF/GQ-02 resultou em uma redução de colágeno nas lesões ateroscleróticas. Adicionalmente, o tratamento durante 15 dias também diminuiu os níveis de mRNA de CD40, MCP-1, ABCG1, e aumentou os níveis do PPARα, uma vez que o tratamento com 30 dias reduziu os níveis das proteínas LOX-1, p-IκBα e p-NFkB. Estes resultados sugerem uma ação direta da LPSF/GQ-02 sobre os fatores que afetam a inflamação, resistência à insulina e acumulação de gordura no fígado, bem como uma ação sobre a composição e crescimento das lesões ateroscleróticas nos camundongos LDLr-/-. Sendo assim, nossos dados apoiam os resultados anteriores, que mostraram as propriedades anti-inflamatórias de LPSF/GQ-02 e reforça o potencial terapêutico desta TZD para o tratamento da aterosclerose e desordens relacionadas a inflamação. / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) refers to a wide spectrum of liver diseases caused by fat deposit in the liver cells in the absence of excess alcohol consumption. Compelling evidence has demonstrated that NAFLD plays a relevant role in the pathogenesis of atherosclerosis. Thiazolidinediones (TZDs) act as an insulin sensitizer and have been used in the treatment of patients with type 2 diabetes and other insulin-resistant conditions, including NAFLD. Since atherosclerosis and NAFLD might share common mechanisms, similar therapeutic strategies could be employed in the treatment of both disorders. In the present study, we evaluated the biological activity of LPSF/GQ-02 on the NAFLD and atherosclerosis pathogenesis. The results obtained with an NAFLD murine model indicated that LPSF/GQ-02 was effective in improving the hepatic architecture, decreasing fat accumulation, reducing the amount of collagen, decreasing inflammation by reducing IL-6, iNOS, COX-2 and F4 / 80, and increasing the protein expression of IκBα, cytoplasmic NFκB-65, eNOS and IRS-1 in mice deficient in the LDL receptor (LDLr -/-). In addition, both treatment protocols (15 and 30 days) with LPSF/GQ-02 resulted in lower collagen density in the atherosclerotic lesions. Moreover, the treatment for 15 days also decreased mRNA levels of CD40, MCP-1, ABCG1 and upregulated PPARα, whereas the 30-days treatment reduced the protein levels of LOX-1, p-IκBα and p-NFκB. These results suggest a direct action by LPSF/GQ-02 on the factors that affect inflammation, insulin resistance and fat accumulation in the liver of these animals, and affects the composition and growth of atherosclerotic lesions in LDLr -/- mice. Our data also support previous findings showing anti-inflammatory properties of LPSF/GQ-02 and reinforce the therapeutic potential of this TZD for treating atherosclerosis and inflammation-related disorders.

nÃo hà / Dentre as doenÃas obstrutivas das vias aÃreas, a asma envolve processos broncoconstritores e inflamatÃrios, ambos fisiologicamente reversÃveis. O uso terapÃutico do 1,8-cineol (eucaliptol) nessa disfunÃÃo vem sendo estudado nos Ãltimos anos. Nesse estudo, objetivou-se avaliar o efeito do eucaliptol na contratilidade da musculatura lisa das vias aÃreas de cobaias sensibilizadas e desafiadas com antÃgeno, bem como estudar seus efeitos nos parÃmetros fisiopatolÃgicos das vias aÃreas na fase inflamatÃria pÃs-desafio. Foram utilizados anÃis de traquÃia montados em cÃmara para ÃrgÃo isolado para estudar a contratilidade. Os parÃmetros inflamatÃrios foram estudados por meio de anÃlise histolÃgica, contagem das cÃlulas inflamatÃrias, nÃveis de citocinas e de MPO no lavado broncoalveolar. Adicionalmente, foram verificadas as pressÃes inspiratÃria e expiratÃria e a freqÃÃncia respiratÃria desses animais, bem como o transporte mucociliar (TMC). O 1,8-cineol (6 x 10-6 a 2 x 10-2 M) induziu relaxamento concentraÃÃo-dependente no tÃnus basal de preparaÃÃes de animais naive com epitÃlio Ãntegro, cujo valor de pD2 correspondeu a 2.23 [2.10 â 2.37]. Em preparaÃÃes com epitÃlio removido ou ainda em tecidos com o epitÃlio Ãntegro, mas na presenÃa de L-NAME, TEA, TTX ou propranolol, nÃo foram observadas alteraÃÃes significativas da potÃncia ou do efeito mÃximo (Emax) induzido por 1,8-cineol. O 1,8-cineol (6,5 x 10-6 a 6,5 x 10-3 M) foi capaz de reverter significativamente a resposta contrÃtil histaminÃrgica. Quando adicionado em meio sem Ca2+ e na presenÃa de ACh, o 1,8-cineol reduziu a curva concentraÃÃo-efeito promovida pela adiÃÃo de Ba2+, mas foi ineficaz quando na curva foi induzida pela adiÃÃo de Ca2+, efeito semelhante ao do verapamil. 1,8-cineol reduziu a contraÃÃo induzida pela adiÃÃo de OVA (reaÃÃo de Schultz-Dale) em tecidos de animais sensibilizados e desafiados ao antÃgeno. O 1,8-cineol diminuiu a hiperreatividade traqueal ao KCl e ao CCh observada apÃs desafio ao antÃgeno inibindo preferencialmente a curva concentraÃÃo-efeito induzida por KCl. O prÃ-tratamento com 1,8-cineol no grupo de animais desafiados ao antÃgeno reverteu significativamente as alteraÃÃes detrimentais na histologia do tecido traqueal e no TMC promovidas pelo desafio antigÃnico. Foi observada reduÃÃo significativa na contagem total de cÃlulas inflamatÃrias, eosinÃfilos e neutrÃfilos, bem como nos nÃveis de IL-1, TNF-&#945; e MPO no grupo de animais desafiados e tratados com 1,8-cineol. TambÃm foi observado aumento na expressÃo da citocina anti-inflamatÃria, IL-10. A degranulaÃÃo de mastÃcitos foi inibida em animais naive prÃ-tratados com 1,8-cineol, efeito similar ao observado com cromoglicato dissÃdico. O 1,8-cineol reverteu as alteraÃÃes produzidas pelo desafio antigÃnico nas pressÃes expiratÃrias e inspiratÃrias, bem como na freqÃÃncia respiratÃria. Esses resultados demonstram que o 1,8-cineol apresenta efeito anti-inflamatÃrio quando utilizado previamente e tem uma aÃÃo relaxante na musculatura lisa de traquÃias de cobaias, agindo preferencialmente em eventos eletromecÃnicos no mÃsculo liso das vias aÃreas. / Considered as an obstructive disease of airways, asthma involves reversible processes in respiratory tree such as bronchoconstriction and airway inflammation. Therapeutic use of 1,8-cineole (eucalyptol) against this disorder have gained importance recently. This study aimed to evaluate the effects of eucalyptol on the contractile behavior of airway smooth muscle obtained from ovalbumin-sensitized and challenged guinea-pigs. We also aimed to study the effects of 1,8-cineole on pathophysiological parameters changed by airway inflammation induced by antigen challenge. We used tracheal rings which were mounted in isolated organ chambers to study its contractility. Inflammatory parameters were studied by means of histological analysis of tracheal rings, inflammatory cells counting, cytokine levels and myeloperoxidase (MPO) activity in bronchoalveolar lavage. Additionally, the inspiratory and expiratory pressures and respiratory rate of these animals were evaluated, as well as the mucociliary transport (MCT). The 1,8-cineol (6 x 10-6 to 2 x 10-2 M) decreased the basal tone of epithelium-intact tracheal rings from naÃve guinea-pigs with pD2 value correspondent to 2.23 [2.10 to 2.37]. In either epithelium-removed preparations or in epithelium-intact tracheal rings pretreated with L-NAME, TEA, TTX or propranolol, no significant changes in pharmacological potency or maximal relaxant effect (Emax) induced by 1,8-cineole were observed. 1,8-cineol (6.5 x 10-6 to 6.5 x 10-3 M) significantly reversed the histamine-induced contractile response. In Ca2+-free medium maintained in presence of ACh, 1,8-cineole reduced the concentration-effect curve promoted by the addition of Ba2+, but it was ineffective when the curve was induced by adding Ca2+, an effect similar to that of verapamil. 1,8-cineole reduced the contraction induced by the antigen OVA (Schultz-Dale reaction) in tissues obtained from OVA-sensitized and OVA-challenged animals. The 1,8-cineole decreased tracheal hyperreactivity to KCl and CCh observed after antigen challenge by inhibiting selectively the concentration-effect curve induced by KCl. Pretreatment of antigen challenged animals with 1,8-cineole significantly reversed the detrimental changes in histology of the tracheal tissue, as well as changes of the MCT, which were promoted by the antigen challenge. We observed a significant reduction in the total count of inflammatory cells, especially eosinophils and neutrophils, and in the levels of IL-1, TNF-&#945; and MPO in the bronchoalveolar lavage of challenged-animals treated with 1,8-cineole. We also observed increased expression of the anti-inflammatory cytokine, IL-10. Mast cell degranulation was inhibited in naive animals pretreated with 1,8-cineole, an effect similar to that observed with cromolyn. 1,8-cineol reversed the changes produced by antigen challenge in inspiratory and expiratory pressures and respiratory frequency. These results demonstrate that the 1,8-cineole has anti-inflammatory effect when used previously and has a relaxing action on smooth muscle of guinea pig trachea, acting preferentially in electromechanical events in smooth muscle of the airways.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Only a small number of cancer patients benefit from therapy with EGFR inhibitors. It is therefore important to understand the mechanism of action of these drugs and to find predictive markers for drug response to guide the selection of patients who can benefits from these drugs. Although somatic mutations and gene amplification have been correlated with the efficacy of EGFR-targeting therapy, cancer cells and/or patients with normal EGFR expression are also sensitive to these drugs. We then aim to further understand the mechanism underlying the predisposition to sensitivity to EGFR inhibitors in germline cells. We chose 70 human normal fibroblasts cell lines as an in vitro model. Cytotoxicity studies were performed on these cells using two EGFR inhibitors, tarceva (T), gefitinib (G) and AG1478 (AG). Cells were incubated with serial concentrations of the drugs (10, 20, 40 and 60 ÂM for T and G and 5, 10, 15 and 20 ÂM for AG) dissolved in DMSO. Growth inhibition was measured by Alamar Blue. Four polymorphisms, -216G/T, R497K, 787C/T and intron 1 (CA)n, were genotyped in these cells. EGFR expression was measured with real-time PCR. There was considerable variability in drug response in a dose-dependent manner among these cells. No working concentration were found to be toxic for T. The other two drugs behaved quite differently. The fibroblasts had a much more variable response to G (mean of coefficient of variance of survival rates under all 4 concentrations, 61%) when compared to the response to AG (26%). Drug response was not correlated with EGFR expression. A significant correlation was observed between the R497K polymorphism and the survival rate of cells treated with AG at 5 &#956;M (p<0.01) and 10 ÂM (p<0.05) with higher growth inhibition in K allele-carriers. No correlation was observed between any of the four EGFR polymorphisms and G cytotoxicity. These observations suggest that the cytotoxic effects of G and AG are due to different mechanisms, and that other genes such as transporters may also contribute to drug response. The R497K polymorphism may be useful as a predictive marker for response to AG and/or similar agents. Also, pathway studies should be done to clarifyed the relationship between response and cutaneous rash in patients treated with tirosine kinase inhibitors / Apenas um pequeno nÃmero de pacientes beneficiam-se da terapia com inibidores de EGFR. Em razÃo disso, torna-se importante o entendimento dos mecanismos envolvidos na resposta a estas drogas a fim de encontrar marcadores preditores de eficÃcia terapÃutica, auxiliando, entÃo, na seleÃÃo de pacientes que podem se beneficiar com essas drogas. Apesar de mutaÃÃes somÃticas e amplificaÃÃes gÃnicas terem sido correlacionadas à eficÃcia terapÃutica dos inibidores de EGFR, foi demonstrado que cÃlulas neoplÃsicas e/ou pacientes que possuem expressÃo de EGFR normal tambÃm sÃo sensÃveis à estas drogas. Assim, o objetivo deste trabalho foi entender os mecanismos envolvidos na predisposiÃÃo à sensibilidade aos inibidores de tirosina quinases em cÃlulas normais por meio de anÃlise de polimorfismos (germline) no gene EGFR. Para isso, foi escolhido um modelo in vitro, utilizando-se 70 amostras de fibroblastos normais. Os estudos citotÃxicos foram realizados com dois inibidores de EGFR Gefitinib (Ge) e AG1478 (AG). As cÃlulas foram incubadas por 72 horas com diferentes concentraÃÃes (10, 20, 40 e 60 ÂM para Ge e 5, 10, 15 e 20 ÂM para AG) sendo dissolvidas em DMSO. Para a anÃlise genotÃpica, foram avaliados quatro polimorfismos: -216G/T, R497K, 787C/T e intron 1 (CA)n. A expressÃo de EGFR foi analisada por PCR em tempo real. Jà para as outras duas drogas, observou-se que estas se comportaram de forma diferente. Os fibroblastos tiveram uma maior variabilidade na resposta para Ge (coeficiente de variabilidade entre as quatro doses de 61%) quando comparado a resposta para AG (26%). A inibiÃÃo do crescimento nÃo foi correlacionada com o nÃvel de expressÃo de EGFR. Observou-se, ainda, correlaÃÃo significante entre o polimorfismo R497K e a sobrevida das cÃlulas tratadas com AG na dose de 5 ÂM (p<0.01) e 10 ÂM (p<0.05) com uma maior inibiÃÃo do crescimento celular nos alelos K. Nenhuma correlaÃÃo foi observada entre os polimorfismos e a citotoxicidade de Ge. Essas observaÃÃes sugerem que os efeitos citotÃxicos de G e AG possuem mecanismos diferentes, e que outros genes tais como trasportadores podem contribuir para a resposta a essas drogas. O polimorfismo R497K pode ser Ãtil como marcador de prediÃÃo de resposta a AG e/ou agentes semelhantes. Mais estudos envolvendo vias de sinalizaÃÃo devem ser realizados para esclarecer a relaÃÃo entre resposta e rash cutÃneo em pacientes tratados com inibidores de tirosina quinase