Ziel der Studie war die morphologisch-funktionelle Charakterisierung der Endometrose mittels konventioneller histopathologischer und neuer immunhistologischer Methoden. Die Ergebnisse wurden mit den Abfohlraten der untersuchten Stuten verglichen, um eine genauere Prognose hinsichtlich der Fertilität zu erhalten. Innerhalb der physiologischen Decksaison wurden von 159 klinisch gesunden, östrischen Stuten (3 bis 21 Jahre alt) Endometriumbioptate entnommen. Die Stuten wurden danach im selben Jahr besamt und nach Erfassen der Abfohlraten im folgenden Jahr in zwei Gruppen eingeteilt: güste Stuten und nicht güste Stuten. Im Rahmen einer Doppelblind-Studie wurden endometriale Alterationen lichtmikroskopisch erfasst sowie Grad und Qualität der Endometrose histomorphologisch definiert. Repräsentativ ausgewählte Bioptate (n=82) wurden immunhistologisch auf die Expression der Steroidhormonrezeptoren (Östrogenrezeptor, ER; Progesteronrezeptor, PR) und ausgewählter endometrialer Proteine (Uteroglobin, UG; Uterokalin, UK; CalbindinD9k, CAL; Uteroferrin, UF) untersucht. 101/159 Stuten zeigen eine, qualitativ und quantitativ variierende, Endometrose. Die fibrotischen Uterindrüsen weisen, im Vergleich zu unveränderten Drüsen, ein zyklusasynchrones, teilweise innerhalb eines Drüsenquerschnittes ungleichmäßiges endometriales Proteinmuster auf. Das ungleichmäßige Expressionsmuster kann als Zeichen einer endometrialen Fehldifferenzierung innerhalb fibrotischer Areale interpretiert werden. Die Aktivität der Endometrose hat keinen Einfluss auf das endometriale Proteinmuster. Güste Stuten besitzen häufiger einemittelgradige, vorwiegend destruierende, inaktive oder gemischte Endometrose. Insbesondere in Arealen mittelgradiger destruierender Endometrosen ist eine deutlich verminderte Expression von UG und UK nachweisbar. Auch in der geringgradigen Endometrose werden häufiger beide Proteine gleichzeitig zyklusasynchron exprimiert. UF wird innerhalb höhergradiger destruierender fibrotischer Herde überweigend intensiver exprimiert als in den unveränderten Epithelien, während CAL vielfach ein variables Proteinmuster besitzt. Nicht güste Stuten hingegen zeigen häufig eine geringgradige aktive oder inaktive Endometrose. Bei diesen Stuten weist ein hoher Anteil betroffener glandulärer Epithelien in der mittelgradigen Endometrose entweder eine zyklussynchrone oder geringgradig zyklusasynchrone Expression von UG, UK und CAL auf. UF wird auch in dieser Gruppe häufig intensiver in fibrotischen Drüsen exprimiert. Zwischen güsten und nicht güsten Stuten bestehen charakteristische Unterschiede im Expressionsmuster von UG und UK: nicht güste Stuten besitzen in gering- und mittelgradig fibrotisch veränderten Uterindrüsen häufiger eine zyklussynchrone Proteinexpression als güste Stuten und seltener deutliche Abweichungen in der Expression von entweder UG oder UK. Stuten beider Gruppen besitzen eine zyklusasynchrone Expression der ER und PR sowohl in den periglandulären fibrotischen Stromazellen als auch im Drüsenepithel. Die glanduläre Hormonrezeptorexpression ist tendenziell abhängig von der Aktivität der Endometrose. Diese Resultate sprechen für eine Abkopplung fibrotischer Areale von den uterinen Kontrollmechanismen. Im Rahmen dieser Studie konnte überwiegend bei güsten Stuten in der Endometrose, im Vergleich zu unveränderten Drüsen, ein deutlich abweichendes endometriales Proteinmuster von UG und UK dargestellt werden. Insbesondere bei Tieren, die an einer mittelgradigen destruierenden Endometrose leiden, könnte diese Tatsache als Hinweis auf eine fertilitätsmindernde Beeinflussung des uterinen Mikromilieus im Rahmen der Endometrose interpretiert werden. Die vorliegende Untersuchung unterstreicht die Notwendigkeit einer genaueren Klassifizierung der Endometrose und empfiehlt, zusätzlich zum Grad auch die Qualität der Endometrose sowie das endometriale Expressionsmuster von UG und UK in der Epikrise für eine präzisere Fertilitätsprognose zu berücksichtigen.

Ziel der Studie war die morphologisch-funktionelle Charakterisierung der Endometrose mittels konventioneller histopathologischer und neuer immunhistologischer Methoden. Die Ergebnisse wurden mit den Abfohlraten der untersuchten Stuten verglichen, um eine genauere Prognose hinsichtlich der Fertilität zu erhalten. Innerhalb der physiologischen Decksaison wurden von 159 klinisch gesunden, östrischen Stuten (3 bis 21 Jahre alt) Endometriumbioptate entnommen. Die Stuten wurden danach im selben Jahr besamt und nach Erfassen der Abfohlraten im folgenden Jahr in zwei Gruppen eingeteilt: güste Stuten und nicht güste Stuten. Im Rahmen einer Doppelblind-Studie wurden endometriale Alterationen lichtmikroskopisch erfasst sowie Grad und Qualität der Endometrose histomorphologisch definiert. Repräsentativ ausgewählte Bioptate (n=82) wurden immunhistologisch auf die Expression der Steroidhormonrezeptoren (Östrogenrezeptor, ER; Progesteronrezeptor, PR) und ausgewählter endometrialer Proteine (Uteroglobin, UG; Uterokalin, UK; CalbindinD9k, CAL; Uteroferrin, UF) untersucht. 101/159 Stuten zeigen eine, qualitativ und quantitativ variierende, Endometrose. Die fibrotischen Uterindrüsen weisen, im Vergleich zu unveränderten Drüsen, ein zyklusasynchrones, teilweise innerhalb eines Drüsenquerschnittes ungleichmäßiges endometriales Proteinmuster auf. Das ungleichmäßige Expressionsmuster kann als Zeichen einer endometrialen Fehldifferenzierung innerhalb fibrotischer Areale interpretiert werden. Die Aktivität der Endometrose hat keinen Einfluss auf das endometriale Proteinmuster. Güste Stuten besitzen häufiger einemittelgradige, vorwiegend destruierende, inaktive oder gemischte Endometrose. Insbesondere in Arealen mittelgradiger destruierender Endometrosen ist eine deutlich verminderte Expression von UG und UK nachweisbar. Auch in der geringgradigen Endometrose werden häufiger beide Proteine gleichzeitig zyklusasynchron exprimiert. UF wird innerhalb höhergradiger destruierender fibrotischer Herde überweigend intensiver exprimiert als in den unveränderten Epithelien, während CAL vielfach ein variables Proteinmuster besitzt. Nicht güste Stuten hingegen zeigen häufig eine geringgradige aktive oder inaktive Endometrose. Bei diesen Stuten weist ein hoher Anteil betroffener glandulärer Epithelien in der mittelgradigen Endometrose entweder eine zyklussynchrone oder geringgradig zyklusasynchrone Expression von UG, UK und CAL auf. UF wird auch in dieser Gruppe häufig intensiver in fibrotischen Drüsen exprimiert. Zwischen güsten und nicht güsten Stuten bestehen charakteristische Unterschiede im Expressionsmuster von UG und UK: nicht güste Stuten besitzen in gering- und mittelgradig fibrotisch veränderten Uterindrüsen häufiger eine zyklussynchrone Proteinexpression als güste Stuten und seltener deutliche Abweichungen in der Expression von entweder UG oder UK. Stuten beider Gruppen besitzen eine zyklusasynchrone Expression der ER und PR sowohl in den periglandulären fibrotischen Stromazellen als auch im Drüsenepithel. Die glanduläre Hormonrezeptorexpression ist tendenziell abhängig von der Aktivität der Endometrose. Diese Resultate sprechen für eine Abkopplung fibrotischer Areale von den uterinen Kontrollmechanismen. Im Rahmen dieser Studie konnte überwiegend bei güsten Stuten in der Endometrose, im Vergleich zu unveränderten Drüsen, ein deutlich abweichendes endometriales Proteinmuster von UG und UK dargestellt werden. Insbesondere bei Tieren, die an einer mittelgradigen destruierenden Endometrose leiden, könnte diese Tatsache als Hinweis auf eine fertilitätsmindernde Beeinflussung des uterinen Mikromilieus im Rahmen der Endometrose interpretiert werden. Die vorliegende Untersuchung unterstreicht die Notwendigkeit einer genaueren Klassifizierung der Endometrose und empfiehlt, zusätzlich zum Grad auch die Qualität der Endometrose sowie das endometriale Expressionsmuster von UG und UK in der Epikrise für eine präzisere Fertilitätsprognose zu berücksichtigen.:1 EINLEITUNG........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ....................................................................................... 2 2.1 Fertilität in der Pferdezucht.............................................................................................. 2 2.2 Die Endometriumbiopsie bei der Stute ............................................................................ 4 2.2.1 Indikationen................................................................................................................... 4 2.2.2 Repräsentativität............................................................................................................ 4 2.2.3 Kategorisierung ............................................................................................................. 5 2.3 Der Sexualzyklus der Stute................................................................................................ 7 2.3.1 Allgemeine Betrachtungen............................................................................................ 7 2.3.2 Histomorphologie des Endometriums in den Zyklusphasen......................................... 9 2.3.3 Regulation des endometrialen Zyklus......................................................................... 12 2.3.4 Immunhistologische Untersuchungen zur Expression der Östrogen- und Progesteronrezeptoren am Endometrium der Stute im Zyklusverlauf ........................ 13 2.4 Sekretorische Aktivitäten des Uterus ............................................................................. 15 2.4.1 Allgemeine Betrachtung........................................................................................... 15 2.4.2 Endometriale Proteine .............................................................................................. 16 2.4.2.1 Uteroglobin............................................................................................................... 16 2.4.2.2 Uteroferrin................................................................................................................ 17 2.4.2.3 Uterokalin................................................................................................................. 18 2.4.2.4 CalbindinD9k ............................................................................................................. 19 2.4.2.5 Regulation der endometrialen Proteine.................................................................... 19 2.4.2.6 Die endometrialen Proteine im Zyklusverlauf bei der Stute.................................... 21 2.4.2.7 Die endometrialen Proteine während der Gravidität bei der Stute .......................... 22 2.5 Die equine Endometrose .................................................................................................. 24 IV 2.5.1 Allgemeine Betrachtungen....................................................................................... 24 2.5.2 Histomorphologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen der Endometrose............................................................................................................. 25 2.5.3 Immunhistologische Untersuchungen der Endometrose.......................................... 29 2.5.3.1 Östrogen- und Progesteronrezeptoren...................................................................... 29 2.5.3.2 Sekretorische Proteine.............................................................................................. 30 2.5.4 Die Endometrose während der Gravidität und im Puerperium................................ 31 2.5.5 Mögliche Einflussfaktoren auf die Endometrose ..................................................... 32 2.5.6 Ansätze zur Ätiologie und Pathogenese der Endometrose ...................................... 33 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 36 3.1 Tiergut und Probenherkunft........................................................................................... 36 3.2 Nähere Charakterisierung des Tiergutes....................................................................... 36 3.3 Methoden.......................................................................................................................... 37 3.3.1 Probenentnahme und Probenaufbereitung .................................................................. 37 3.3.2 Anfertigung und Färbung der Schnitte........................................................................ 37 3.3.3 Lichtmikroskopische Auswertung und Kategorisierung............................................. 37 3.4 Immunhistologische Methoden ....................................................................................... 39 3.4.1 Immunhistologische Kontrollen.................................................................................. 39 3.4.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen............................................. 39 3.5 Statistische Untersuchungen ........................................................................................... 41 4 ERGEBNISSE....................................................................................................... 42 4.1 Allgemeine histopathologische Befunderhebung im eigenen Untersuchungsgut....... 42 4.1.1 Gruppeneinteilung der Stuten mit einer Endometrose ................................................ 43 4.1.2 Prävalenz der Endometrose im Untersuchungsgut...................................................... 44 4.1.3 Endometrose und Endometritis ................................................................................... 46 4.1.4 Endometrose und Angiosklerose................................................................................. 46 V 4.1.5 Endometrose und Perivaskulitis.................................................................................. 46 4.1.6 Kategorisierung ........................................................................................................... 46 4.2 Histomorphologische Charakteristika der Endometrose im eigenen Untersuchungsgut unter Berücksichtigung der anamnestischen Daten ..................... 48 4.2.1 Aktive Endometrose.................................................................................................... 51 4.2.2 Inaktive Endometrose.................................................................................................. 52 4.2.3 Gemischte Endometrose.............................................................................................. 53 4.2.4 Aktive destruierende Endometrose ............................................................................. 53 4.2.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................... 54 4.2.6 Gemischte destruierende Endometrose ....................................................................... 54 4.3 Gruppenspezifischer Vergleich zwischen Stuten mit einer Endometrose und Stuten mit einer Endometrose und Endometritis ......................................................... 55 4.4 Immunhistologische Untersuchungen der unterschiedlichen Erscheinungsformen der Endometrose im eigenen Untersuchungsgut........................................................... 58 4.4.1 Immunhistologische Ergebnisse der Steroidhormonrezeptor-Analyse.................... 58 4.4.1.1 Aktive Endometrose................................................................................................. 58 4.4.1.2 Inaktive Endometrose............................................................................................... 59 4.4.1.3 Gemischte Endometrose........................................................................................... 60 4.4.1.4 Aktive destruierende Endometrose .......................................................................... 61 4.4.1.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................ 61 4.4.1.6 Gemischte destruierende Endometrose .................................................................... 62 4.4.2 Immunhistologische Ergebnisse zum Nachweis der endometrial synthetisierten Proteine..................................................................................................................... 64 4.4.2.1 Aktive Endometrose................................................................................................. 64 4.4.2.2 Inaktive Endometrose............................................................................................... 66 4.4.2.3 Gemischte Endometrose........................................................................................... 67 4.4.2.4 Aktive destruierende Endometrose .......................................................................... 69 4.4.2.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................ 70 4.4.2.6 Gemischte destruierende Endometrose .................................................................... 71 VI 4.5 Gruppenspezifischer Vergleich der immunhistologischen Ergebnisse zwischen Stuten mit einer Endometrose und Stuten mit einer Endometrose und Endometritis ... 73 4.6 Vergleichende Zusammenfassung der histopathologischen und immunhistologischen Befunde unter Berücksichtigung der anamnestischen Daten ........................ 78 5 DISKUSSION ........................................................................................................ 82 5.1 Ziele der Arbeit................................................................................................................. 82 5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials und der Untersuchungsmethoden ........................................................................................................................... 82 5.3 Die equine Endometrose .................................................................................................. 83 5.3.1 Allgemeine Betrachtungen zur Endometrose.............................................................. 83 5.3.2 Morphologie der Endometrose.................................................................................... 84 5.3.3 Einflussfaktoren auf die Endometrose ........................................................................ 87 5.3.4 Kategorisierung ........................................................................................................... 88 5.3.5 Veränderungen im sekretorischen Proteinmuster im Rahmen der Endometrose........ 90 5.3.6 Mögliche Konsequenzen eines defizienten Proteinmusters auf die Fertilität ............. 94 6 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................ 97 7 SUMMARY............................................................................................................ 99 8 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................101 9 ANHANG..............................................................................................................112 9.1 Charakterisierung des Tiergutes mit einer Endometrose .......................................... 112 9.2 Für die Immunhistologie verwendete Antikörper, Seren und Positivkontrollen..... 115 9.3 Verfahrensschritte der immunhistologischen Untersuchungen ................................ 118 9.3.1 Vorbehandlung .......................................................................................................... 118 VII 9.3.2 Besondere Verfahren................................................................................................. 118 9.3.3 Antigennachweis mittels monoklonaler AK nach der PAP-Methode....................... 119 9.3.4 Antigennachweis mittels polyklonaler AK nach der PAP-Methode......................... 119 9.3.5 Standard zur Nachbehandlung .................................................................................. 120 9.3.6 Lösungen und Puffer ................................................................................................. 120 9.4 Bilddokumentation

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, 1. die Einflüsse von Alter bzw. Parität auf Prävalenz und Entwicklung endometrialer Alterationen beim Rind zu untersuchen, 2. einen repräsentativen Überblick über die mittels Endometriumbiopsie erfassbaren Erkrankungen bei klinisch gesunden Kühen zu schaffen 3. die Entwicklung der histopathologischen Befunde nach einer weiteren Trächtigkeit zu dokumentieren. Grundlage dieser Arbeit sind sechs Endometriumbioptate von klinisch (inklusive rektaler Untersuchung) gesunden Färsen (Gruppe A), 165 Bioptate von klinisch gesunden Kühen (Gruppe B) sowie Bioptat-Paare (Gruppe C) von 46 Tieren, die im Abstand einer Trächtigkeit entnommen wurden. Die Proben der Gruppe A dienten als Kontrollgruppe, wobei die Gefäße als Grundlage für die Normalstruktur vor der ersten Trächtigkeit herangezogen wurden. Innerhalb der Endometriumbioptate der Färsen (Gruppe A) waren keine pathologischen Veränderungen (Endometritis, Endometrose, Angiosklerose) und keine Lymphfollikel nachweisbar. Bezüglich der Endometritis-Prävalenz, die bei 23,6 % lag, ließ sich in Gruppe B keine Abhängigkeit von der Parität oder dem Entnahmezeitpunkt nachweisen. Eine Endometrose trat überwiegend bei Erstkalbinnen (24,4 %) und Tieren mit fünf Abkalbungen (41,6 %) auf. Eine Korrelation mit dem Alter lag nicht vor. Auffällig war die signifikant höhere Endometrose-Prävalenz innerhalb der ersten acht Wochen p.p. (20,1 %), im Vergleich zu später entnommenen Proben (3,2 %). Für das Auftreten von Lymphfollikel, die im Mittel bei 53,3 % der Kühe auftraten, konnten keine Korrelationen mit der Parität oder dem Zeitpunkt der Bioptatentnahme ermittelt werden. Auch scheint weder das Vorliegen einer Endometritis die Entwicklung von Lymphfollikeln zu begünstigen, noch schützen Lymphfollikel im Endometrium vor einer Entzündung des Uterus. Mit steigender Parität war eine Zunahme der Angiosklerose-Prävalenz zu verzeichnen, allerdings konnte keine statistisch signifikante Korrelation zum Grad der Gefäßveränderungen (anhand der H.E.-Färbung) nachgewiesen werden. Innerhalb der Karunkel lagen signifikant höhergradige Veränderungen vor als in interkarunkulären Gefäßen. Da das Alter der Tiere eng mit der Anzahl der Abkalbungen korreliert, war eine gesonderte Betrachtung der altersassoziierten Einflüsse anhand des untersuchten Materials nicht möglich. Mittels der durchgeführten Untersuchungen ließ sich kein negativer Einfluss der vorwiegend geringgradigen histopathologischen Veränderungen im Endometrium (Endometritis, Endometrose, Angiosklerose, Lymphfollikel) auf die Fertilität (Erstbesamungserfolg, Rastzeit, Güstzeit, Gesamtträchtigkeitsrate) nachweisen. Innerhalb der Gruppe C konnte nach einer weiteren Trächtigkeit ein signifikanter Anstieg der Endometrose-Prävalenz von 7,0 % auf 25,6 % nachgewiesen werden, während der Anteil der Tiere mit einer Endometritis bzw. Angioskerose nahezu unverändert blieb. Bei einigen Tieren wurde allerdings in der ersten Probe, jedoch nicht im Folgebioptat, eine Endometrose diagnostiziert. Bei einer Kuh lag dabei sogar zuerst eine mittelgradige periglanduläre Fibrose vor, die im zweiten Bioptat nicht mehr nachweisbar war. Im Hinblick auf die Entwicklung vaskulärer Alterationen konnte nach einer weiteren Trächtigkeit eine signifikante Zunahme der Faserzubildungen (Pikrosiriusrot-Färbung) in der Tunica media interkarunkulärer arterieller Gefäße und karunkulärer Arterien sowie in der Tunica adventitia von interkarunkulären Arteriolen nachgewiesen werden. Weiterhin wurden im Zweitbioptat anhand der Pikrosiriusrot-Färbung signifikant höhergradigere Veränderungen (Gesamtschädigung) der karunkulären Arterien und Arteriolen diagnostiziert. Für alle übrigen Gefäßtypen lag zwar eine Zunahme der Gesamtschädigung im zweiten Bioptat vor, diese war jedoch nicht statistisch signifikant. Zu beiden Untersuchungszeitpunkten konnten innerhalb des untersuchten Materials vor allem Elastosen und Elastofibrosen nachgewiesen werden. Dabei lagen bezüglich der Art der zugebildeten Fasern keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Proben vor. Insgesamt konnten anhand des untersuchten Materials von klinisch gesunden Kühen zahlreiche pathologische Befunde im Endometrium diagnostiziert werden. Allerdings ist die Interpretation der Befunde bislang schwierig, da keine Einflüsse auf die Fertilität nachweisbar waren. Jedoch lagen besonders im Hinblick auf die Endometritis und Endometrose meist nur geringgradige Veränderungen vor, so dass sich diese vermutlich nicht negativ auf die Fruchtbarkeit auswirken. Weiterhin ist anhand der vorliegenden Ergebnisse fraglich, ob eine Endometrose beim Rind als irreversible Erkrankung angesehen werden muss. Hierzu sind weitere Studien erforderlich.