La microscopie multiphoton est une technique d'imagerie optique dont une des caractéristiques les plus remarquables est de fournir une information micrométrique en profondeur dans les tissus intacts. Un autre intérêt est la possibilité de visualiser la structure d'une cellule ou d'un tissu en utilisant des sources de contraste endogènes qui permettent une imagerie très peu invasive. De plus, divers modes de contrastes tels que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF), la génération de seconde harmonique (SHG) ou la génération de troisième harmonique (THG) sont facilement combinables, et les applications de la microscopie multiphoton sont ainsi nombreuses et variées, dans des domaines comme les neurosciences, la cancérologie, l'embryologie,... Cependant, des progrès sont encore nécessaires dans la compréhension des contrastes optiques non-linéaires endogènes observés dans les tissus. Dans ce contexte, la génération de seconde harmonique par le collagène fibrillaire soulevait différentes questions au début de ce travail, notamment sur la spécificité de la SHG en fonction du type de collagène et sur le rôle de sa structure chirale en triple hélice dans la forte amplitude des signaux observés. L'étude du collagène est particulièrement intéressante car il représente 30 % du contenu total du corps humain en protéines. Constituant principal de la matrice extracellulaire d'une grande variété de tissus et d'organes, le collagène est impliqué dans tout remodelage de la matrice extracellulaire et dans de nombreuses pathologies, mais on manque actuellement d'outils performants pour visualiser son architecture tridimensionnelle à l'échelle micrométrique. Dans ce contexte, la microscopie SHG est un outil prometteur pour visualiser la distribution du collagène dans les tissus. Ce travail de thèse a débuté avec des expériences de génération de seconde harmonique en surface résolue en polarisation sur des films minces de molécules de collagène de type I et IV, qui nous ont permis de démontrer que la microscopie SHG est une sonde de l'organisation macromoléculaire du collagène et non pas du type de collagène. Nous avons appliqué ensuite ces résultats à l'étude de la fibrose collagénique pulmonaire et rénale dans des modèles murins, une accumulation pathologique de collagène fibrillaire qui peut conduire à une insuffisance rénale terminale ou à une insuffisance respiratoire souvent létale à terme. Nous avons démontré que la microscopie multiphoton permet de visualiser la morphologie de ces tissus, de mettre en évidence toutes les caractéristiques de ces pathologies et d'évaluer quantitativement le remodelage de la matrice extracellulaire au cours de l'évolution de la fibrose. Finalement, nous avons proposé des scores de fibrose basés sur des densités volumiques de pixels SHG qui nous ont permis d'apprécier le rôle de certains facteurs (cellules/enzymes d'assemblage) responsables de la fibrose. Ce travail devrait ainsi permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces pathologies fibrosantes.

Bien que le Tacrolimus soit un immunosuppresseur largement prescrit en transplantation rénale, ses effets néphrotoxiques limitent son utilisation. En effet, le Tacrolimus contribue au développement de lésions de fibrose interstitielle rénale et d’atrophie tubulaire à plus ou moins brève échéance. Parmi les mécanismes qui interviennent dans le processus de fibrogenèse, la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) a été évoquée. Dans ce processus, une cellule épithéliale polarisée perd l’expression de certains de ses marqueurs épithéliaux (E-cadhérine, cytokératine, β-caténine membranaire...) au profit d’un phénotype mésenchymateux (expression de marqueurs mésenchymateux tels que vimentine ou translocation nucléaire de la β-caténine, sécrétion de composants de la matrice extracellulaire). Ainsi, afin d’identifier des déterminants moléculaires de la néphrotoxicité induite par le Tacrolimus et d’évaluer la contribution du processus de TEM, plusieurs approches in vitro et in vivo ont été combinées.Tout d’abord, un modèle de culture primaire de cellules tubulaires proximales rénales (CTP), cibles privilégiées des xénobiotiques au niveau rénal a été développé à partir de pièces opératoires. Ce modèle a été caractérisé : analyse de la stabilité sur 5 passages, de l’expression de marqueurs épithéliaux proximaux et mésenchymateux, et de la résistance trans-épithéliale... De plus, la comparaison de la capacité métabolique des échantillons de tissu rénal sain à différents modèles cellulaires (HEK293, HK-2, CTP) nous a permis de montrer que les CTP est le modèle le plus pertinent. De plus, l’exposition de cellules rénales au Tacrolimus induit une modification du phénotype des cellules.De plus, le développement d’un modèle murin de néphrotoxicité induite par le Tacrolimus a été réalisé (exposition durant 28 jours à une dose de 1 mg/kg/j de Tacrolimus par implantation sous-cutanée de pompes Alzet® ou par injection intra-péritonéale). Les données histologiques et d’expression génique montrent que les reins de souris traitées par Tacrolimus présentent des zones localisées d’expression des marqueurs mésenchymateux (vimentine) et de fibrose (collagène, α-SMA, miR-21). Par ailleurs, la variabilité interindividuelle des effets néphrotoxiques du Tacrolimus étant potentiellement associée à la présence de polymorphismes génétiques (SNP), les ADN de patients transplantés rénaux et de leur greffon ont été génotypés pour des SNP (i) affectant les CYP3A5 et ABCB1, intervenant dans la prise en charge du Tacrolimus, (ii) affectant la cavéoline-1, impliquée dans le processus de fibrose. Nos résultats montrent que deux SNP affectant le donneur (CYP3A5 6986A>G et ABCB1 3435C>T) sont significativement associés à une plus faible expression des marqueurs de TEM (expression de novo de la vimentine et translocation nucléaire de la β-caténine) et à un nombre moins important de lésions de fibrose rénale sur les biopsies de greffons à 3 mois post-greffe. Enfin, les patients porteurs d’un greffon de génotype CAV1 rs4730751AA ont une perte de fonction rénale plus rapide. Ces patients semblent développer plus fréquemment des lésions de fibrose. Dans le cadre de la transplantation rénale, ces résultats suggèrent que certains SNP du donneur influencent la néphrotoxicité du Tacrolimus et que son métabolisme in situ est un élément clé dans la compréhension de la fibrogenèse du greffon.Au total, les résultats obtenus nous ont permis d’identifier des facteurs individuels de vulnérabilité à la toxicité du Tacrolimus. De telles données, utilisées comme outil prédictif d’une néphrotoxicité plus ou moins importante, aideraient à un meilleur choix de traitement immunosuppresseur. A terme, sur le plan médico-économique, notre étude pourrait permettre d’améliorer la prise en charge de la néphrotoxicité des immunosuppresseurs, et ainsi réduire les coûts de traitement liés aux pertes de greffons induites par la toxicité du Tacrolimus. / Although widely prescribed in kidney transplantation, Tacrolimus use is limited by its nephrotoxic effects. Indeed, Tacrolimus contributes to the development of renal interstitial fibrosis lesions and tubular atrophy with a large variability between patients. Among the mechanisms involved in fibrogenesis, the epithelial-mesenchymal transition (EMT) has been proposed. EMT is a dynamic process by which a polarized epithelial cell loses its epithelial markers (E-cadherin, cytokeratin, membrane β-catenin...) and acquires a mesenchymal phenotype (de novo expression of vimentin or nuclear translocation of β-catenin, secretion of extracellular matrix components). Thus, to identify molecular determinants of Tacrolimus-induced nephrotoxicity and to evaluate the contribution of EMT, several in vitro and in vivo approaches were combined.First, a model of primary culture of renal proximal tubular cells (PT cells), the main target of xenobiotics in kidney, has been developed and characterized: phenotypic stability, functional properties, expression of proximal and mesenchymal markers and transepithelial resistance. In addition, the comparison of the metabolic capacity of the healthy renal tissue samples to different cell models (HEK293, HK-2 CTP) has revealed that PT cells is the most appropriate model. Furthermore, renal cells exposure to Tacrolimus induced a modification of the cell phenotype.Moreover, the development of a murine model of Tacrolimus-induced nephrotoxicity has been performed (28 days-exposure at 1 mg/kg/day by subcutaneous implantation of Alzet® pumps or by intra-peritoneal injection). Histological and gene expression data indicated that kidney of Tacrolimus-treated mice exhibited localized expression of mesenchymal markers (vimentin) and fibrosis areas (collagen, α-SMA, miR-21).Furthermore, as the interindividual variability of Tacrolimus nephrotoxic effects is potentially associated with genetic polymorphisms (SNPs), renal transplant recipients and their corresponding graft were genotyped for (i) CYP3A5 and ABCB1 SNPs, involved in Tacrolimus cellular processing, (ii) caveolin-1 SNP, involved in fibrosis. Our results showed that two SNPs affecting the donor (CYP3A5 6986A> G and ABCB1 3435C> T) were significantly associated with a lower expression of EMT markers (vimentine de novo expression and nuclear translocation of β-catenin) together with less fibrosis lesions evaluated on renal graft biopsies performed at 3 months post-transplant. Finally, patients with a CAV1 rs4730751AA graft displayed a more severe renal function decrease. These patients also developed more frequently fibrotic lesions. In the context of renal transplantation, these results suggest that some donor SNPs modulate Tacrolimus-induced nephrotoxicity and that its in situ metabolism is a key element in the graft fibrogenesis understanding.Overall, these data allowed us to identify some molecular determinants of Tacrolimus-induced nephrotoxicity. Early identification of patients at high risk of Tacrolimus renal toxicity represents one of the most important and future challenges in kidney transplantation to tailor treatment before the development of irreversible lesions. Although preliminary, our data suggest that the genetic make-up of donors as well as the early detection of nephrotoxicity markers such as mesenchymal markers, may improve to the medical management of renal transplant patients.

La maturation des collagènes fibrillaires est régulée par la libération protéolytique des propeptides qui conduit à la formation spontanée de fibres, à partir des molécules de collagène mature. Les fibres de collagène ainsi formées confèrent résistance et solidité aux tissus. Les métalloprotéases Tolloïdes sont les principales enzymes responsables de la maturation C-terminale des procollagènes. Ces protéases possèdent de nombreux autres substrats et se distinguent par un mode de régulation original, l’utilisation de régulateurs « substrats-spécifiques », qui leur permet de moduler leur activité vis-à-vis de ces différents substrats. Parmi ces régulateurs, les Procollagen C-Proteinase Enhancers (PCPE-1 et 2) semblent jouer un rôle important car ils augmentent l’activité de clivage du C-propeptide des procollagènes jusqu’à 20 fois. Même si PCPE-1 a été découvert en 1985, son mode d’action n’est toujours pas compris. Le principal objectif de cette thèse était donc de mieux comprendre le mécanisme de l’activation. Nous avons commencé par identifier la région minimale de PCPE-1 capable d’activer les Tolloïdes et démontré une très forte coopérativité entre les domaines de cette région. Par ailleurs, nous avons mis en évidence, pour la première fois, un nouveau rôle physiologique pour le domaine C-terminal de PCPE-1 (NTR). Concernant les autres partenaires du complexe de maturation, nous avons observé une interaction d’affinité modérée entre PCPE-1 et la protéase Tolloïde appelée BMP-1 et montré que PCPE-1 se fixe uniquement sur la partie C-terminale du procollagène. Enfin, nous avons mis en évidence que d’autres métalloprotéases, les Méprines, pourraient également jouer un rôle dans la maturation de collagènes fibrillaires en étant régulées négativement par les PCPEs. L’ensemble de ces résultats nous a permis de proposer un nouveau schéma d’interaction pour les PCPEs et de faire de nouvelles hypothèses concernant leur mécanisme d’action / The maturation of fibrillar collagens is a tightly regulated process controlled by two proteolytic cleavages that remove the propeptide regions from procollagen precursors leading to spontaneous assembly of mature collagen molecules into fibrils. These fibrils provide tensile strength and toughness to connective tissues and consequently to the organism itself. The group of extracellular metalloproteinases mostly responsible for procollagen processing are the tolloids. As these enzymes have several functions other than procollagen processing, their activities on different substrates are controlled by a growing number of substrate-specific regulators. The most prominent of these regulators are the procollagen C-proteinase enhancers (PCPEs), of which PCPE-1 is a 55 kDa glycoprotein composed of two CUB and a C-terminal NTR domain, which is capable of enhancing the proteolytic activity of tolloids up to 20-fold. Even though PCPE-1 has been known since 1985 the molecular mechanism of enhancement is still unclear. The aim of this thesis was to understand and characterize this mechanism with the aid of biochemical and biophysical methods. We have identified the minimal unit responsible for enhancing activity. In addition, we propose a mechanism for how the subdomains responsible for enhancement cooperatively bind to procollagen substrates. Furthermore, we have for the first time been able to identify a possible physiological function of the NTR domain. Also, we have identified meprins as new players involved in procollagen processing and this has given valuable insights in the mechanism of action of PCPEs. Finally, we have been able to demonstrate that the interaction of PCPE-1 with procollagen is mostly limited to the C-propeptide region. Based on these findings we propose a new hypothetical interaction mechanism for PCPE-1