As coberturas de hidroxiapatita (HAp) são utilizadas para aumentar a osteointegração em implantes de titânio (Ti), devido à sua capacidade de promover a biomineralização para corrigir defeitos esqueléticos e craniofaciais. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a influência dos revestimentos sobre culturas primárias de osteoblastos. Na primeira fase de estudos, desenvolvemos uma nova abordagem de revestimento baseada em filmes Langmuir-Blodgett (LB) de dihexadecilfosfato (DHP) e ácido octadecilfosfônico (OPA) depositados em discos Ti, e crescimento subsequente de cristais de HAp. Analisamos a viabilidade dos osteoblastos, a atividade da fosfatase alcalina (ALP) e a formação da matriz mineralizada por métodos colorimétricos e a morfologia das culturas por microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal. Os resultados revelaram que o revestimento DHP/HAp aumentou a viabilidade dos osteoblastos até 150% em comparação com o controle em todos os dias testados. O revestimento OPA/HAp promoveu a maior viabilidade ao 14 dias (190%). A atividade de ALP foi aumentada apenas pelo revestimento de DHP/HAp ao 14º dia em comparação com o controle e Ti limpo. A microscopia eletrônica de varredura e as microfotografias confocais revelaram diferenças morfológicas entre os osteoblastos cultivados em ambos os revestimentos, aumentando o seu número e o espalhamento. O revestimento de DHP/HAp aumentou a produção de nódulos biomineralizados. O ensaio de biomineralização pela técnica do Vermelho de Alizarina mostrou que o revestimento de OPA/HAp possuía uma concentração de cálcio (Ca2+) 1,88 vezes superior à cobertura de DHP/HAp. Uma vez que a literatura relata que o Ca2+ pode estimular ou inibir a atividade da ALP e, consequentemente, o processo de biomineralização, as diferenças no comportamento desses dois revestimentos podem estar relacionadas às diferenças de concentração de superfície de Ca2+. O bom desempenho do revestimento de DHP/HAp pode estar relacionado às características da composição química, adicionada à técnica de deposição LB. Na segunda fase da pesquisa, as monocamadas de Langmuir de DHP e dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) foram testadas e utilizadas para incorporar o paratormônio 1-34 (PTH 1-34) (DHP/Ca+PTH e DPPC/Ca+PTH, respectivamente). Também foram testadas as ações dos revestimentos DHP/HAp com PTH em solução (DHP/HAp+PTH S) e gotejado (DHP/HAp+PTH G) em culturas de osteoblastos. Um potencial zeta negativo em pH 7,4 foi encontrado (-14,9 mV) para o PTH 1-34. A isoterma de DPPC mostrou um aumento da área mínima ocupada por molécula lipídica após a injeção de PTH na subfase de água (50 ?L de solução 0,5 mg/mL) em 10,97 Å2, o que pode ser devido à inserção de PTH neste filme. A área mínima de DHP foi alterada em 2,3 Å2, o que não é estatisticamente significativo. A análise de QCM mostrou um depósito de 72,5 ng de PTH em filme de DPPC e 29,3 ng de PTH em filme de DHP para cada 25 ?g de PTH injetado na cuba de Langmuir. A viabilidade celular e a formação da matriz mineralizada de culturas de osteoblastos crescidas em DHP/Ca+PTH e revestimentos DPPC/Ca+PTH diminuíram quando comparadas com Ti limpo. Os revestimentos DHP/HAp+PTH S e DHP/HAp+PTH G mostraram ser tão eficientes quanto o Ti DHP/HAp para estimular o processo de biomineralização. Mas a cobertura de DHP/HAp+PTH G aumentou a viabilidade dos osteoblastos e a formação de matriz mineralizada quando comparada com Ti DHP/HAp. Esta é uma cobertura inovadora que abre precedentes para o uso da técnica de gotejamento em HAp para outros hormônios e drogas que agem sobre o tecido ósseo. / Due to their ability to promote biomineralization, Hydroxyapatite (HAp) coatings are used to increase the osteointegration in titanium (Ti) implants, in order to correct skeletal and craniofacial defects. The objective of the research was to evaluate the influence of the coatings on osteoblasts primary cultures. In the first phase of the research we developed a new coating approach based on Langmuir-Blodgett (LB) films of dihexadecyl phosphate (DHP) and octadecylphosphonic acid (OPA) deposited on Ti discs and subsequent growth of HAp crystals. We analyzed the osteoblast viability, alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralized matrix formation by colorimetric methods, and the morphology of the cultures by scanning electron microscopy and confocal micrographies. The results revealed that the DHP/HAp coating increased osteoblast viability up to 150% compared to the control at all days tested. The OPA/HAp coating promoted the highest viability on the 14th day (190%). The ALP activity was enhanced only by the DHP/HAp coating on the 14th day compared to control, and clean Ti. To explore the morphology of the cells, the scanning electron microscopy and confocal micrographies were obtained, and revealed morphological differences between osteoblasts grown on both coated Ti compared to clean Ti. Both coatings increased the number and spreading of osteoblasts, while the DHP/HAp coating enhanced the production of biomineralized nodules. The Alizarin Red assay showed that OPA/HAp coating has 1.88 times higher calcium (Ca2+) concentration than DHP/HAp. The same test confirmed the increase of mineralization only by DHP/HAp coating compared to clean Ti. Since literature reports that Ca2+ can stimulate or inhibit the ALP activity and consequently, the biomineralization process, the differences on the behavior of these two coatings could be related to the Ca2+ surface concentration differences. The good performance of the DHP/HAp coating can be explained due to the characteristics of the chemical composition, added to the LB deposition technique. In the second phase of the research, Langmuir monolayers of DHP and dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) was tested and used to incorporate 1-34 parathyroid hormone (PTH 1-34) (DHP/Ca+PTH, and DPPC/Ca+PTH, respectively). DHP/HAp coatings with PTH in solution (DHP/HAp+PTH S), and dropped (DHP/HAp+PTH G) also were tested on osteoblasts cultures. A negative zeta-potential at pH 7.4 was found (-14.9 mV) to PTH 1-34. The Langmuir isotherm of DPPC showed an increase of the minimum area occupied per lipid molecule after the PTH injection into the water subphase (50 ?L of 0.5 mg/mL solution) by 10.97 Å2, which could be due to the insertion of PTH in this film. The DHP minimum area changed by 2.3 Å2, which is not statistically significant. The QCM analysis showed the deposit of 72.5 ng of PTH on DPPC film, and 29.3 ng of PTH on DHP film for each 25 ?g of PTH injected into the Langmuir trough. The cell viability and matrix mineralization of osteoblasts cultures grown on DHP/Ca+PTH, and DPPC/Ca+PTH coatings decreased when compared to clean Ti. DHP/HAp+PTH S and DHP/HAp+PTH G coatings proved to be as efficient as Ti DHP/HAp to stimulate the biomineralization process. But DHP/HAp+PTH G increased the osteoblast viabilitiy and formation of mineralized matrix when compared to Ti DHP/HAp. This is an innovative coating that sets the precedent for the use of the drip technique on HAp for other hormones and drugs that act on bone tissue.

O ibuprofeno é um antiinflamatório não esteróide, com baixa solubilidade em água, que apresenta diversos efeitos colaterais, incluindo lesão gástrica e intestinal. Esses efeitos podem depender da interação com a membrana celular, o que nos motivou a investigar, na primeira parte deste trabalho, a incorporação do ibuprofeno em monocamadas de Langmuir como modelos de membrana celular. Monocamadas de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC) co-espalhadas com o ibuprofeno ou depositadas sobre subfases contendo o fármaco foram estudadas por meio das isotermas de pressão e potencial de superfície. Foram observados efeitos significativos para monocamadas de DPPC, particularmente na transição de fase líquido-expandida para líquido-condensada, com modificações relevantes na elasticidade da monocamada. Esses efeitos aumentaram com a concentração do ibuprofeno. Para os dois tipos de fosfolipídios, o ibuprofeno pôde penetrar na região hidrofóbica, o que foi confirmado por espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS), indicando assim a presença de interações hidrofóbicas. A análise por microscopia no ângulo de Brewster (BAM) mostrou que o ibuprofeno impede a formação de grandes domínios de DPPC, enquanto que não foram observadas alterações significativas para o DPPG. A interação entre o ibuprofeno e o DPPG também foi confirmada após a imobilização da monocamada mista em filmes LB com alterações na absorção no UV-Vis da molécula de ibuprofeno. No que diz respeito às implicações biológicas, a ação farmacológica que depende diretamente da interação com a membrana deve ocorrer primeiramente em regiões neutras via penetração do ibuprofeno na região hidrofóbica da membrana celular. A segunda parte deste trabalho foi dedicada à interação de capsaicinóides extraídos da pimenta malagueta com monocamadas de Langmuir constituídas de DPPG e DPPC. A capsaicina é um potente analgésico de uso tópico, que pode causar dessensibilização no local de aplicação dependendo da dose e, portanto há interesse na sua incorporação em sistemas de liberação controlada, como os lipossomos. A técnica de Langmuir foi empregada para verificar essa possibilidade. Os capsaicinóides expandiram as monocamadas de DPPG e aumentaram sua elasticidade. As isotermas de potencial de superfície indicaram que os capsaicinóides provocam aumento de 10% no momento de dipolo numa concentração de 30% em mol. Para os filmes mistos de DPPC e capsaicinóides, a área mínima diminuiu e a elasticidade da monocamada aumentou. De acordo com as isotermas de potencial, os momentos de dipolo diminuíram para as monocamadas de DPPC independentemente da concentração de capsaicinóides. Esses resultados sugerem que as moléculas de DPPC são solubilizadas para a subfase na presença do fármaco. A partir destes resultados, conclui-se que os capsaicinóides podem ser incorporados em estruturas lipídicas, constituídas principalmente de DPPG, o que é relevante para uso em sistemas de liberação de fármacos. / Ibuprofen is a nonsteroidal anti-inflammatory drug, with low solubility in water, which exhibits side effects including gastric and intestinal injury, often irreversible. Some of these effects may depend on the interaction with the cell membrane, which motivated us to investigate the incorporation of ibuprofen in Langmuir monolayers as cell membrane models, in the first part of this thesis. Dipalmitoyl phosphatidyl choline (DPPC) or dipalmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG) monolayers co-spread with ibuprofen or deposited on ibuprofen-containing aqueous subphases were studied using surface pressure and surface potential isotherms. Significant effects were observed for DPPC monolayers, particularly at the liquid-expanded to liquid-condensed phase transition, with relevant changes in the elasticity of the monolayer. These effects increased with the ibuprofen concentration. For both types of phospholipids, ibuprofen could penetrate into the hydrophobic part of the monolayer, which was confirmed with polarization-modulated infrared reflection absorption spectroscopy (PM-IRRAS), thus indicating the presence of hydrophobic interactions. BAM images showed that ibuprofen prevents the formation of large domains of DPPC, while no significant changes were observed for DPPG. The interaction between DPPG-ibuprofen was also confirmed for deposited layers in the form of LB films, with changes in the ibuprofen UV-Vis absorption. As for the biological implications, the pharmacological action depending directly on the membrane interaction should occur primarily with zwitterionic regions of the membrane via penetration of ibuprofen in the hydrophobic part of the monolayer. The second part of this thesis is dedicated to the interaction of capsaicinoids, extracted from malagueta pepper, with Langmuir monolayers of DPPC and DPPG. Capsaicin is a powerful analgesic of topical use, which can cause desensitization in the application site depending on the dose, and therefore there is interest in its incorporation in drug delivery systems, such as liposomes. The Langmuir technique was employed to verify this possibility. The capsaicinoids expanded the DPPG monolayer and increased its elasticity. Surface potential isotherms indicated that the capsaicinoids increased the average dipole moment by 10 % for 30 mol % of capsaicinoids. For the mixed films of DPPC and capsaicinoids, the minimum area decreased and the elasticity increased. According to the surface potential isotherms, the dipole moments decreased for DPPC monolayers regardless of the capsaicinoid concentrations. These results suggest that the DPPC molecules are solubilized into the subphase in the presence of the drug. From these results, it is concluded that the capsaicinoids can be incorporated into structures as the liposomes constituted mainly of DPPG, which is relevant for use in drug delivery systems.

Este trabalho visa ao entendimento da interação de capsaicinóides com membranas celulares utilizando sistemas modelo. Dentre os alcalóides derivados de plantas do gênero Capsicum, a capsaicina e a dihidrocapsaicina respondem por 90% dos capsaicinóides, que são usados como analgésicos e antiinflamatórios, devido a sua interação específica com receptores. O mecanismo neurofarmacológico já foi bastante estudado, mas o modo de ação não neural ainda não foi elucidado. Usamos extratos brutos (EBs) de pimenta malagueta e de dedo-de-moça, que têm atividade superficial, e afetaram monocamadas de Langmuir de fosfatidil colina de dipalmitoíla (DPPC) e fosfatidil glicerol de dipalmitoíla (DPPG). Tais efeitos não tiveram dependência expressiva com a carga, pois o EB de dedo-de-moça interagiu mais fortemente com o DPPC do que com o DPPG, ao passo que o contrário se verificou para o EB de malagueta. Também não houve diferença significativa entre os EBs das duas pimentas. Nas monocamadas de Langmuir representativas para a bactéria S. aureus, ambos os EBs tiveram efeito, tanto nas isotermas de pressão quanto nos resultados de espectroscopia de absorção e reflexão no infravermelho com modulação de polarização (PM-IRRAS), sem distinção significativa entre malagueta e dedo-de-moça. No entanto, as medidas de vazamento com lipossomos mostraram maior interação com o EB de dedo-de-moça, o que é consistente com a atividade bactericida para S. aureus. De fato, a concentração inibitória mínima (MIC) foi 0,13 mg mL-1 para o EB da pimenta dedo-de moça e 4,0 mg mL-1 para o EB de malagueta. Para a E. coli, os EBs interagiram com as monocamadas de Langmuir sem diferenças dignas de nota para as duas pimentas, e nas medidas de vazamento o efeito maior foi para a dedo-de-moça. Não houve efeito bactericida para nenhum dos extratos. Isso se explica porque bactérias gram-negativas, como a E. coli, têm uma camada externa protetora de lipossacarídeos (LPS). Das medidas de monocamadas de Langmuir representativas da camada de LPS, observou-se pouca incorporação dos EBs. Conclui-se, assim, que os EBs não conseguem causar rompimento da camada de LPS. Do conjunto dos resultados, infere-se que o mecanismo de ação para a S. aureus envolve solubilização parcial da membrana, e não há relação entre pungência e atividade bactericida, pois a pimenta dedo-de-moça, que é menos pungente, teve maior efeito do que a malagueta. Depreende-se, também, que a ação de extratos de pimenta deve depender da interação com receptores na membrana, o que explica porque o uso de tais extratos tem sido principalmente em aplicações tópicas. / This study is aimed at understanding the interaction of capsaicinoids with cell membranes using model systems. Among the alkaloids derived from plants of the genus Capsicum, capsaicin and dihydrocapsaicin account for 90% of capsaicinoids, which are used as analgesic and anti-inflammatory due to their interaction with specific receptors. The neuropharmacological mechanism has been well studied, but the non-neural mode of action has not been elucidated. Here, we use crude extracts (EBs) of malagueta and dedo-de-moça chilli peppers, which are surface active, and affected Langmuir monolayers of dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG). Such effects did not depend on the charge, since EB from dedo-de-moça interacted more strongly with DPPC than with DPPG, while the opposite applied for malagueta. In addition, there was no significant difference between the two EBs. For Langmuir monolayers representing the bacteria S. aureus, both EBs affected the surface pressure isotherms and the polarizationmodulated infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS) data, without significant distinction between dedo-de-moça and malagueta. However, in the leakage measurements with liposomes the EB from dedo-de-moça was more efficient in rupturing the liposome, which is consistent with the bactericidal activity for S. aureus. In fact, the minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.13 mg mL-1 for dedo-de-moça and 4.0 mg mL-1 for malagueta. For the Langmuir monolayers mimicking the E. coli membrane, the EBs interacted much in the same way, while the EB from dedo-de-moça caused larger leakage in liposomes. There was no bactericidal effect of the EBs. This is explained by the fact that gram-negative bacteria, such as E. coli, have a protective outer layer of liposaccharides (LPS). In monolayers representing LPS, there was little incorporation of EBs, from which one infers that the EBs cannot cause disruption of the LPS layer. Taking all these results together, it appears that the mechanism of action for S. aureus involves partial solubilization of the membrane. Furthermore, there is no relationship between pungency and bactericidal activity because dedo-de-moça, which is less pungent, had greater effect than malagueta. It seems also that the action of pepper extracts must depend on the interaction with membrane receptors, which explains why the use of such extracts has been essentially in topical applications.

O ibuprofeno é um antiinflamatório não esteróide, com baixa solubilidade em água, que apresenta diversos efeitos colaterais, incluindo lesão gástrica e intestinal. Esses efeitos podem depender da interação com a membrana celular, o que nos motivou a investigar, na primeira parte deste trabalho, a incorporação do ibuprofeno em monocamadas de Langmuir como modelos de membrana celular. Monocamadas de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC) co-espalhadas com o ibuprofeno ou depositadas sobre subfases contendo o fármaco foram estudadas por meio das isotermas de pressão e potencial de superfície. Foram observados efeitos significativos para monocamadas de DPPC, particularmente na transição de fase líquido-expandida para líquido-condensada, com modificações relevantes na elasticidade da monocamada. Esses efeitos aumentaram com a concentração do ibuprofeno. Para os dois tipos de fosfolipídios, o ibuprofeno pôde penetrar na região hidrofóbica, o que foi confirmado por espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS), indicando assim a presença de interações hidrofóbicas. A análise por microscopia no ângulo de Brewster (BAM) mostrou que o ibuprofeno impede a formação de grandes domínios de DPPC, enquanto que não foram observadas alterações significativas para o DPPG. A interação entre o ibuprofeno e o DPPG também foi confirmada após a imobilização da monocamada mista em filmes LB com alterações na absorção no UV-Vis da molécula de ibuprofeno. No que diz respeito às implicações biológicas, a ação farmacológica que depende diretamente da interação com a membrana deve ocorrer primeiramente em regiões neutras via penetração do ibuprofeno na região hidrofóbica da membrana celular. A segunda parte deste trabalho foi dedicada à interação de capsaicinóides extraídos da pimenta malagueta com monocamadas de Langmuir constituídas de DPPG e DPPC. A capsaicina é um potente analgésico de uso tópico, que pode causar dessensibilização no local de aplicação dependendo da dose e, portanto há interesse na sua incorporação em sistemas de liberação controlada, como os lipossomos. A técnica de Langmuir foi empregada para verificar essa possibilidade. Os capsaicinóides expandiram as monocamadas de DPPG e aumentaram sua elasticidade. As isotermas de potencial de superfície indicaram que os capsaicinóides provocam aumento de 10% no momento de dipolo numa concentração de 30% em mol. Para os filmes mistos de DPPC e capsaicinóides, a área mínima diminuiu e a elasticidade da monocamada aumentou. De acordo com as isotermas de potencial, os momentos de dipolo diminuíram para as monocamadas de DPPC independentemente da concentração de capsaicinóides. Esses resultados sugerem que as moléculas de DPPC são solubilizadas para a subfase na presença do fármaco. A partir destes resultados, conclui-se que os capsaicinóides podem ser incorporados em estruturas lipídicas, constituídas principalmente de DPPG, o que é relevante para uso em sistemas de liberação de fármacos. / Ibuprofen is a nonsteroidal anti-inflammatory drug, with low solubility in water, which exhibits side effects including gastric and intestinal injury, often irreversible. Some of these effects may depend on the interaction with the cell membrane, which motivated us to investigate the incorporation of ibuprofen in Langmuir monolayers as cell membrane models, in the first part of this thesis. Dipalmitoyl phosphatidyl choline (DPPC) or dipalmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG) monolayers co-spread with ibuprofen or deposited on ibuprofen-containing aqueous subphases were studied using surface pressure and surface potential isotherms. Significant effects were observed for DPPC monolayers, particularly at the liquid-expanded to liquid-condensed phase transition, with relevant changes in the elasticity of the monolayer. These effects increased with the ibuprofen concentration. For both types of phospholipids, ibuprofen could penetrate into the hydrophobic part of the monolayer, which was confirmed with polarization-modulated infrared reflection absorption spectroscopy (PM-IRRAS), thus indicating the presence of hydrophobic interactions. BAM images showed that ibuprofen prevents the formation of large domains of DPPC, while no significant changes were observed for DPPG. The interaction between DPPG-ibuprofen was also confirmed for deposited layers in the form of LB films, with changes in the ibuprofen UV-Vis absorption. As for the biological implications, the pharmacological action depending directly on the membrane interaction should occur primarily with zwitterionic regions of the membrane via penetration of ibuprofen in the hydrophobic part of the monolayer. The second part of this thesis is dedicated to the interaction of capsaicinoids, extracted from malagueta pepper, with Langmuir monolayers of DPPC and DPPG. Capsaicin is a powerful analgesic of topical use, which can cause desensitization in the application site depending on the dose, and therefore there is interest in its incorporation in drug delivery systems, such as liposomes. The Langmuir technique was employed to verify this possibility. The capsaicinoids expanded the DPPG monolayer and increased its elasticity. Surface potential isotherms indicated that the capsaicinoids increased the average dipole moment by 10 % for 30 mol % of capsaicinoids. For the mixed films of DPPC and capsaicinoids, the minimum area decreased and the elasticity increased. According to the surface potential isotherms, the dipole moments decreased for DPPC monolayers regardless of the capsaicinoid concentrations. These results suggest that the DPPC molecules are solubilized into the subphase in the presence of the drug. From these results, it is concluded that the capsaicinoids can be incorporated into structures as the liposomes constituted mainly of DPPG, which is relevant for use in drug delivery systems.

O estudo da interação de moléculas orgânicas com a água é de grande importância para diversas áreas das ciências, como por exemplo, na compreensão de sistemas biológicos. Uma elevada diversidade de estudos nesta área já foram realizados, no entanto, alguns aspectos do estudo de filmes finos de aminas anfifílicas não foram satisfatoriamente esclarecidos. Este trabalho aborda filmes de Langmuir de octadecilamina em função do pH e da força iônica de subfases aquosas, investigando a estrutura da monocamada orgânica e sua interação com a água, em diversos graus de ionização. Foi utilizada a Espectroscopia Vibracional por Geração de Soma de Frequências (Sum Frequency Generation - SFG), uma técnica que utiliza o princípio da óptica não-linear para estudar superfícies e interfaces, com o objetivo de investigar a conformação molecular dos filmes de Langmuir de aminas anfifílicas de cadeias longas, seu grau de ionização e a estrutura da água interagindo com a monocamada orgânica. Pôde-se acompanhar a ionização da monocamada em função do pH da subfase pela intensidade do modo de estiramento do grupo NH3+, e verificou-se que ela depende do pH local da interface, que por sua vez é alterado pela ionização da monocamada e é sensível à força iônica da subfase. A água interage com a monocamada via ligações de H com os grupos NH2/NH3+ e forma uma camada com alto grau de orientação perpendicular à superfície, mas relativamente desordenada do ponto de vista da rede de ligações de H (como na água líquida). A conformação das cadeias alquila depende da ionização do filme de Langmuir, sendo bastante compacta e ordenada a altos pHs (filme neutro) e mais expandida e desordenada a baixos pHs. Além disso, foram fabricados filmes de Langmuir-Blodgett (LB) de octadecilamina para comparar a estrutura dos filmes na superfície da água e em substratos sólidos. / The study of the interaction of organic molecules with water is of great importance for many areas of science, such as the understanding of biological systems. A large diversity of studies in this area have been performed, however some aspects of the study of thin films of amphiphilic amines have not been satisfactorily clarified. This dissertation focuses on Langmuir films of Octadecylamine as a function of pH and ionic strength of the aqueous subphase, investigating the structure of the organic monolayer and its interaction with water at various degrees of ionization. Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy (SFG spectroscopy), a non-linear optical technique to study surfaces and interfaces, was used in order to investigate the molecular conformation of the Langmuir films, its degree of ionization and the structure of water interacting with the organic monolayer. The monolayer ionization could be monitored by the intensity of the NH3+ group stretch mode, and it was found that it depends on the local pH at the interface, which in turn is changed by the monolayer ionization and is sensitive to the subphase ionic strength. Water interacts with the monolayer by H bonds with NH2/NH3+ groups, forming a layer with a high degree of orientational order along the surface normal, but relatively disordered regarding the H-bonding network (like in the bulk liquid). The conformation of the alkyl chains depends on the monolayer ionization, being compact and all-trans at high pHs, but more expanded and disordered at low pHs. In addition, Langmuir-Blodgett (LB) films of Octadecylamine were fabricated to compare their structure on the solid substrate to those on the water surface

As coberturas de hidroxiapatita (HAp) são utilizadas para aumentar a osteointegração em implantes de titânio (Ti), devido à sua capacidade de promover a biomineralização para corrigir defeitos esqueléticos e craniofaciais. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a influência dos revestimentos sobre culturas primárias de osteoblastos. Na primeira fase de estudos, desenvolvemos uma nova abordagem de revestimento baseada em filmes Langmuir-Blodgett (LB) de dihexadecilfosfato (DHP) e ácido octadecilfosfônico (OPA) depositados em discos Ti, e crescimento subsequente de cristais de HAp. Analisamos a viabilidade dos osteoblastos, a atividade da fosfatase alcalina (ALP) e a formação da matriz mineralizada por métodos colorimétricos e a morfologia das culturas por microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal. Os resultados revelaram que o revestimento DHP/HAp aumentou a viabilidade dos osteoblastos até 150% em comparação com o controle em todos os dias testados. O revestimento OPA/HAp promoveu a maior viabilidade ao 14 dias (190%). A atividade de ALP foi aumentada apenas pelo revestimento de DHP/HAp ao 14º dia em comparação com o controle e Ti limpo. A microscopia eletrônica de varredura e as microfotografias confocais revelaram diferenças morfológicas entre os osteoblastos cultivados em ambos os revestimentos, aumentando o seu número e o espalhamento. O revestimento de DHP/HAp aumentou a produção de nódulos biomineralizados. O ensaio de biomineralização pela técnica do Vermelho de Alizarina mostrou que o revestimento de OPA/HAp possuía uma concentração de cálcio (Ca2+) 1,88 vezes superior à cobertura de DHP/HAp. Uma vez que a literatura relata que o Ca2+ pode estimular ou inibir a atividade da ALP e, consequentemente, o processo de biomineralização, as diferenças no comportamento desses dois revestimentos podem estar relacionadas às diferenças de concentração de superfície de Ca2+. O bom desempenho do revestimento de DHP/HAp pode estar relacionado às características da composição química, adicionada à técnica de deposição LB. Na segunda fase da pesquisa, as monocamadas de Langmuir de DHP e dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) foram testadas e utilizadas para incorporar o paratormônio 1-34 (PTH 1-34) (DHP/Ca+PTH e DPPC/Ca+PTH, respectivamente). Também foram testadas as ações dos revestimentos DHP/HAp com PTH em solução (DHP/HAp+PTH S) e gotejado (DHP/HAp+PTH G) em culturas de osteoblastos. Um potencial zeta negativo em pH 7,4 foi encontrado (-14,9 mV) para o PTH 1-34. A isoterma de DPPC mostrou um aumento da área mínima ocupada por molécula lipídica após a injeção de PTH na subfase de água (50 ?L de solução 0,5 mg/mL) em 10,97 Å2, o que pode ser devido à inserção de PTH neste filme. A área mínima de DHP foi alterada em 2,3 Å2, o que não é estatisticamente significativo. A análise de QCM mostrou um depósito de 72,5 ng de PTH em filme de DPPC e 29,3 ng de PTH em filme de DHP para cada 25 ?g de PTH injetado na cuba de Langmuir. A viabilidade celular e a formação da matriz mineralizada de culturas de osteoblastos crescidas em DHP/Ca+PTH e revestimentos DPPC/Ca+PTH diminuíram quando comparadas com Ti limpo. Os revestimentos DHP/HAp+PTH S e DHP/HAp+PTH G mostraram ser tão eficientes quanto o Ti DHP/HAp para estimular o processo de biomineralização. Mas a cobertura de DHP/HAp+PTH G aumentou a viabilidade dos osteoblastos e a formação de matriz mineralizada quando comparada com Ti DHP/HAp. Esta é uma cobertura inovadora que abre precedentes para o uso da técnica de gotejamento em HAp para outros hormônios e drogas que agem sobre o tecido ósseo. / Due to their ability to promote biomineralization, Hydroxyapatite (HAp) coatings are used to increase the osteointegration in titanium (Ti) implants, in order to correct skeletal and craniofacial defects. The objective of the research was to evaluate the influence of the coatings on osteoblasts primary cultures. In the first phase of the research we developed a new coating approach based on Langmuir-Blodgett (LB) films of dihexadecyl phosphate (DHP) and octadecylphosphonic acid (OPA) deposited on Ti discs and subsequent growth of HAp crystals. We analyzed the osteoblast viability, alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralized matrix formation by colorimetric methods, and the morphology of the cultures by scanning electron microscopy and confocal micrographies. The results revealed that the DHP/HAp coating increased osteoblast viability up to 150% compared to the control at all days tested. The OPA/HAp coating promoted the highest viability on the 14th day (190%). The ALP activity was enhanced only by the DHP/HAp coating on the 14th day compared to control, and clean Ti. To explore the morphology of the cells, the scanning electron microscopy and confocal micrographies were obtained, and revealed morphological differences between osteoblasts grown on both coated Ti compared to clean Ti. Both coatings increased the number and spreading of osteoblasts, while the DHP/HAp coating enhanced the production of biomineralized nodules. The Alizarin Red assay showed that OPA/HAp coating has 1.88 times higher calcium (Ca2+) concentration than DHP/HAp. The same test confirmed the increase of mineralization only by DHP/HAp coating compared to clean Ti. Since literature reports that Ca2+ can stimulate or inhibit the ALP activity and consequently, the biomineralization process, the differences on the behavior of these two coatings could be related to the Ca2+ surface concentration differences. The good performance of the DHP/HAp coating can be explained due to the characteristics of the chemical composition, added to the LB deposition technique. In the second phase of the research, Langmuir monolayers of DHP and dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) was tested and used to incorporate 1-34 parathyroid hormone (PTH 1-34) (DHP/Ca+PTH, and DPPC/Ca+PTH, respectively). DHP/HAp coatings with PTH in solution (DHP/HAp+PTH S), and dropped (DHP/HAp+PTH G) also were tested on osteoblasts cultures. A negative zeta-potential at pH 7.4 was found (-14.9 mV) to PTH 1-34. The Langmuir isotherm of DPPC showed an increase of the minimum area occupied per lipid molecule after the PTH injection into the water subphase (50 ?L of 0.5 mg/mL solution) by 10.97 Å2, which could be due to the insertion of PTH in this film. The DHP minimum area changed by 2.3 Å2, which is not statistically significant. The QCM analysis showed the deposit of 72.5 ng of PTH on DPPC film, and 29.3 ng of PTH on DHP film for each 25 ?g of PTH injected into the Langmuir trough. The cell viability and matrix mineralization of osteoblasts cultures grown on DHP/Ca+PTH, and DPPC/Ca+PTH coatings decreased when compared to clean Ti. DHP/HAp+PTH S and DHP/HAp+PTH G coatings proved to be as efficient as Ti DHP/HAp to stimulate the biomineralization process. But DHP/HAp+PTH G increased the osteoblast viabilitiy and formation of mineralized matrix when compared to Ti DHP/HAp. This is an innovative coating that sets the precedent for the use of the drip technique on HAp for other hormones and drugs that act on bone tissue.

Estudos em interfaces são importantes para o completo entendimento de muitos processos em química, física e biologia. Esses sistemas são governados principalmente pelas propriedades interfaciais dos materiais. Nas duas últimas décadas, o desenvolvimento de novos métodos experimentais melhorou o nosso entendimento das propriedades interfaciais. O advento de uma série de técnicas de espectroscopia a laser baseadas em óptica não linear e o desenvolvimento das técnicas de microscopia por ponta de prova, possibilitaram estudos antes inimagináveis em superfícies e interfaces. Entre as técnicas de espectroscopia não linear, destacamos a espectroscopia por Geração de Soma de Frequências (espectroscopia SFG). Essa técnica foi desenvolvida por Shen et al. em 1987 e, desde então, é aplicada a muitos estudos em superfícies e interfaces. A espectroscopia SFG pode fornecer informações sobre a natureza química por meio do espectro vibracional e sobre o ordenamento médio das moléculas em uma única monocamada. O sinal SFG só pode ser gerado em meios não centrossimétricos, isso inclui superfícies ou interfaces entre meios centrossimétricos, onde há quebra da simetria de inversão. A combinação da espectroscopia SFG com a microscopia óptica tem sido proposta como uma nova técnica experimental para obter imagens em interfaces com sensibilidade química pelo espectro vibracional e contraste pela orientação e ordenamento das moléculas. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento, construção e caracterização de um Microscópio SFG (MSFG). Esse MSFG foi especialmente projetado para estudos em superfícies ou interfaces tanto líquidas quanto sólidas. Testes iniciais de desempenho do MSFG foram realizados na interface líquido/ar da solução binária água/acetonitrila (H2O⁄CH3CN). Foram obtidas imagens do sinal SFG ressonante com o estiramento simétrico do grupo metil (CH3) da acetonitrila na interface líquido⁄ar da solução binária. Variando a fração molar da acetonitrila na solução entre 4% e 20% observamos a dependência da intensidade do sinal SFG na interface em função da fração molar de acetonitrila no volume do líquido. Testes também foram feitos em filmes Langmuir-Blodgett multicamada de ácido esteárico (CH3(CH2)16COOH). Obtivemos a espectromicroscopia SFG na ressonância dos grupos CH2 e CH3 do ácido graxo. Pelas diferenças entre os espectros SFG das regiões ordenadas e desordenadas, a espectromicroscopia revelou distribuições microscópicas do ordenamento das cadeias alquila que formam o filme. A sensibilidade da detecção do sinal SFG foi caracterizada e revelou a possibilidade de obter imagens na superfície da água em menos de um minuto. A caracterização óptica e os testes nas interfaces líquido⁄ar e sólido⁄ar demonstraram a completa capacidade do MSFG como ferramenta para investigar qualquer superfície ou interface, seja essa líquida ou sólida. / Interface studies are important for the complete understanding of many processes in chemistry, physics and biology. These systems are mainly governed by the interfacial properties of the materials. In the last two decades, the development of new experimental methods improved our understanding of interfacial properties. The advent of a host of laser spectroscopy techniques based on nonlinear optics and the development of the scanning probe microscopy techniques, opened up unimaginable possibilities of studies at surfaces and interfaces. Among these nonlinear spectroscopies we turned our attention to Sum Frequency Generation spectroscopy (SFG spectroscopy). This technique was developed by Shen et al. in 1987 and, since then, it has been applied to many studies of surfaces and interfaces. SFG spectroscopy can provide information about the chemical nature by the vibrational spectra and about the average of molecular ordering in a single monolayer. The SFG signal only can be generated in a noncentrossymetric media, this includes surfaces or interfaces between centrossymetric media, where there is a broken in the inversion symmetry. The combination of SFG spectroscopy with optical microscopy has been proposed as a novel experimental technique to obtain images at interfaces with chemical sensitivity by the vibrational spectra as well as contrast by the ordering and orientation of the molecules. In this work we present the development, construction and characterization of an SFG Microscope (SFGM). This SFGM was specially designed to perform studies on surfaces or interfaces of liquids and solids. Initial SFGM performance tests were performed at the liquid/air interface of the water/acetonitrile (H2O/CH3CN) binary solution. The images of the SFG signal were acquired on the resonance of the methyl group (CH3) of acetonitrile present at the liquid⁄air interface of the binary solution. By varying the molar fraction of acetonitrile in the solution between 4% and 20% we observed the dependency of the SFG signal intensity as a function the acetonitrile bulk mole fraction. We also performed tests in multi-layered Langmuir-Blodgett films of stearic acid (CH3(CH2)16COOH). We obtained the SFG spectromicroscopy in the resonance of CH2 and CH3 groups of the fatty acid. By the differences between the SFG spectra of ordered and disordered regions, the spectromicroscopy revealed microscopic distribution of the conformational ordering in the alkyl chains that composes the film. The sensitivity of the SFG microscope was characterized and it was shown that images could be acquired at the water surface in less than one minute. The optical characterization and the performed tests at the liquid/air and solid/air interfaces demonstrated the full capabilities of the SFGM as a tool for investigations in any liquid or solid interface.