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Molecular mechanisms of the pressure-activation of Mrr, a Type IV restriction endonuclease, and induction of SOS response in Escherichia coli / Mécanismes moléculaires de l'activation par pression de Mrr, une enzyme de restriction de Type IV, et de l'induction d'une réponse SOS chez Escherichia coliBourges, Anaïs 28 September 2018 (has links)
La pression rencontrée par les organismes sur Terre varie de la pression atmosphérique à 110 MPa atteinte dans la fosse la plus profonde de l'océan. Même si Escherichia. coli n’est pas naturellement résistante à la pression, elle capable d'acquérir une résistance et même supporter un choc de pression de 2 GPa (~20 000 atm). L'une des réponses intéressantes d’E. coli à un choc sous létal de pression (100 MPa) est l'induction d'une réponse SOS dépendante de RecA due à des lésions double brins de l’ADN. La pression elle-même n'est pas capable de compromettre l'intégrité covalente de l'ADN. Des criblages ont permis d’isoler des souches d’E. coli résistantes à la pression qui révèlent qu'une endonucléase de restriction (ER) de type IV, Mrr, est le seul facteur responsable du clivage de l'ADN. Cette enzyme cible uniquement l'ADN méthylé et l’expression d’une MTase étrangère, M.HhaII, est également capable d'induire une réponse SOS dans des souches de E. coli en présence de Mrr. Ici, nous démontrons en utilisant des techniques de fluctuations d’intensité de fluorescence, in vivo et in vitro que Mrr est un présent sous la forme d’un tétramère dans les cellules non stressées. La pression est capable de dissocier Mrr en dimères actifs qui peuvent lier l'ADN et cliver à certains sites cryptiques. En revanche, la MTase HhaII favorise la forme dimeric de Mrr liée à l’ADN en raison de la méthylation de nombreux sites de haute affinité. Une analyse mutationnelle et un modèle d’homologie 3D de la protéine entière révèle la base structurelle probable du changement entre la forme tétramérique inactive à la forme dimérique active. Nous avons mis en pace un système permettant de faire de la microscopie sous pression (in vitro and in vivo) et nos résultats préliminaires ont confirmé notre modèle d’activation de Mrr. / The pressure encountered by organisms on Earth varies from the atmospheric pressure to 110 MPa as reached in the deepest trench of the ocean. Although Escherichia coli is not naturally resistant to high pressure, it is capable of acquiring pressure resistance and withstanding a pressure shock up to 2 GPa (~20,000 atm). When exposed to a sub-lethal pressure shock (100 MPa) E. coli induces a RecA-dependent SOS response due to DNA double strand breaks. Pressure itself is not capable of compromising the covalent integrity of the DNA. Instead, screens for pressure-resistance E. coli mutants have revealed that a Type IV restriction endonuclease, Mrr is the only factor responsible for DNA cleavage. This enzymes targets only methylated DNA and expression of a foreign methyltransferase, M.HhaII, is also capable of inducing an SOS response in strains harboring Mrr. Here, we demonstrate using fluorescence fluctuation techniques in vivo and in vitro that Mrr is present as a tetramer in unstressed cells and that pressure dissociates Mrr into active dimers that can bind DNA and cleave at some cryptic sites. In contrast, the M.HhaII MTase pulls the Mrr tetramer-dimer equilibrium to the dimer-bound DNA form probably due to the methylation of many high-affinity sites. Mutational analysis associated with a 3D homology model of the full-length protein reveals the probable structural basis for the switch from an inactive tetramer to an active dimer. We set up a system that allows microscopy experiments (in vitro and in vivo) under pressure and preliminary results have confirmed our model of Mrr activation.
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Etude de la mécanotransduction : relation entre les forces de tractions cellulaires et la dynamique des intégrines. / Study of the mechanotransduction : Relation between cellular traction forces and integrin dynamics.De Mets, Richard 05 October 2015 (has links)
L’originalité du sujet de thèse, initié lors du stage de M2R consiste à mesurer les propriétés de mobilité des molécules d’adhérence de cellules mécaniquement contrôlées. Le contrôle des propriétés géométriques et mécaniques du substrat seront fixées grace a l'utilisation d'une lamelle de verre comprenant des motifs de matrice extracellulaire. Nous utiliserons plusieurs techniques de mesures de mobilités, permettant d'accèder à des échelles temporelles d'étude différentes ; La FCS permettant d'accèder au dynamique rapide ; Le FRAP pour accèder au dynamique lente. / The originality of the project, initiated during the M2 internship, consist to measure the mobility of adhesive molecules of cells mechanically controlled.This control will be fixed thanks to a coverslip with adhesive protein pattern. We will next use different technics of mobility measurement to have information about different time scale : FCS for fast dynamics, FRAP for slow dynamics.
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Etude de l’interaction de protéines nucléaire : RevErb alpha / NCor par des techniques de fluorescence (Anisotropie et Microscopie) / Study of interaction between the nuclear proteins : RevErb alpha / N-Cor by fluorescence anisotropy and N&B techniquesVaissiere, Anaïs 11 December 2014 (has links)
Les récepteurs nucléaires sont membres d'une famille de protéines activées par des ligands et qui régulent la transcription de nombreux gènes. Le récepteur nucléaire RevErbα est constitutivement inhibiteur de la transcription de gènes cibles via le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor et Histone DeAcetylase 3). Ce complexe joue un rôle important dans le contrôle de l'horloge circadienne et de la glucogenèse via la régulation de la transcription des gènes codant pour les enzymes G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) et PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase). Ces deux enzymes sont impliquées dans la glucogénèse qui est dérégulée en cas de diabète de type 2. Ce travail est basé sur l'investigation de l'interaction du récepteur nucléaire RevErbα avec deux corépresseurs: son partenaire établit NCor et SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Malgré ce qui est rapporté dans la littérature, c'est à dire que SMRT et RevErbα n'interagissent pas fonctionnellement in vivo, nous avons choisis d'étudier cette interaction à cause de la similarité de séquence entre les deux corépresseurs, mais également parce que les peptides des deux corépresseurs ont été rapportés comme interagissant avec d'autre récepteurs nucléaire. Afin d'étudier ces interactions, nous avons utilisé deux techniques complémentaires basées sur l'émission de fluorescence: Une technique in vitro qui est l'anisotropie de fluorescence et une technique de microscopie de fluorescence in cellulo appelée Number & Brightness. En plus de cette étude de l'interaction entre le récepteur nucléaire et les corépresseurs, nous nous sommes intéressé à déterminer l'effet de plusieurs ligands sur cette interaction. Trois ligands ont été testés: l'hème qui est rapporté comme étant le ligand naturel de RevErbα et deux ligands synthétiques et non naturels de RevErbα (SGN et SD7). Grâce à l'anisotropie de fluorescence (in vitro), nous avons confirmé et quantifié l'interaction entre le domaine de liaison au ligand (LBD) de RevErbα et un peptide NCor contenant le domaine d'interaction majeur (ID1 pour RevErbα et nous avons déterminé l'effet des trois ligands sur cette interaction. Nous avons également quantifié l'interaction entre RevErbα et d'autres peptides provenant de NCor et correspondant aux autres domaines d'interaction (ID2 et ID3) pour sa liaison à RevErbα. Nous avons déterminé que l'hème et le SD7 ont un effet déstabilisateur de la liaison de RevErbα à NCor in vitro, alors que le ligand SGN améliore la stabilité de complexe. Nous avons également confirmé une interaction entre RevErbα et un peptide corépresseur issu de SMRT. Afin d'étudier l'interactions des protéines pleine taille dans un contexte plus fonctionnel, nous avons utilisé le 2 photons-2 couleurs Number & Brightness. C'est une technique de microscopie à fluorescence basée sur la fluctuation de l'intensité de fluorescence pour étudier les interactions spécifiques de RevErbα avec NCor et SMRT pleine taille in cellulo ainsi que l'effet des ligands, précédemment mentionné, sur ces interactions. Dans les conditions choisies pour notre étude, nous avons déterminé que RevErbα interagit fortement avec NCor in cellulo et que cette interaction est améliorée par le ligand SGN. En revanche, l'hème et le SD7 n'ont pas d'effet observable sur ce complexe. Nous avons également montré pour la première fois que RevErbα forme des complexes avec le corépresseur SMRT pleine taille in cellulo. La continuité de ce travail pourrait être ciblée sur l'identification de ligands qui augmenterait le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 sur RevErbα, menant ainsi à la diminution de l'expression des gènes cibles. En définitive, un ligand tel que celui-ci pourrait être d'un grand intérêt dans la recherche de la diminution de glucose dans le sang dans les cas de diabètes de type 2. / Nuclear receptors are members of ligand-inducible factors that regulate the transcription of many genes. Nuclear receptor RevErbα constitutively inhibits the transcription of target genes via the recruitment of the corepressor complex NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor and Histone DeAcetylase 3). This complex plays an important role in controlling the circadian clock and glucogenesis via regulation of the transcription of the G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) and PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase) genes, both coding for proteins involved in glucogenesis, which is central to type 2 diabetes. Here we have investigated the interaction of the nuclear receptor RevErbα with two corepressors: its establish partner, NCor and SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Despite literature reports that SMRT and RevErbα do not interact functionally in vivo, we choose to study this interaction because of sequence similarity between the two corepressors, because peptides of both corepressors were reported to interact with other nuclear receptors. To investigate these interactions, we used two complementary fluorescence techniques: In vitro assays based on fluorescence anisotropy and an in cellulo fluorescence microscopy technique called Number & Brightness. In addition to the interactions between the CoRs and the RN, we were interested in determining the effects of several ligands on these interaction. Three ligands were tested: heme, which is reported to be the natural ligand of RevErbα and two synthetic and non-naturals ligands of RevErbα (SGN and SD7). By fluorescence anisotropy (in vitro) we confirmed and quantitated the interaction between purified RevErbα Ligand Binding Domain (LBD) and an NCoR peptide containing the major interaction domains (ID1) for RevErbα and revealed the effect of the three ligands on this interaction. We quantitated as well, the interaction between RevErbα and other peptides from NCor corresponding to the other interaction domains (ID2 and ID3) for it binding to RevErbα. We found a destabilizing effect of heme and SD7 binding to RevErbα on it interaction with NCor in vitro, whereas the ligand SGN enhanced the complex stability. We also confirmed an interaction between RevErbα and a SMRT peptide corepressor in vitro. In order to examine these interactions in a more functionally relevant context using full length proteins, we used 2 photon 2 colors Cross Number and Brightness (N&B), an fluorescence microscopy technique based on fluorescence intensity fluctuations to study specific interactions of full length RevErbα with NCor and SMRT in cellulo as well as the effect of several ligands above mentioned. Under the conditions of our studies, we find that RevErbα and NCor interact strongly in cellulo, and we observed a slight enhancement of this interaction by the SGN ligand. No effect of heme or SD7 was observed on the complex. We show as well for the first time that RevErbα forms complexes with the full length SMRT corepressor in cellulo. Future extensions of these studies could be aimed at identifying ligands that enhance the recruitment of the corepressor complex NCor/HDAC3 by RevErbα, thus leading to a decrease expression of the target genes. Ultimately such a ligand could be of interest in the quest to decrease blood glucose levels in type 2 diabetes.
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