L'hypercholestérolémie et la forme pathologique qui en résulte, l'athérosclérose, sont fréquemment impliquées dans les accidents cardiovasculaires, actuellement première cause de mortalité dans les pays développés. L'hypercholestérolémie se caractérise par un taux anormalement élevé de cholestérol dans le sang. Le taux de cholestérol sanguin dépend principalement de l'équilibre entre les lipoprotéines de faible densité, les LDL et les lipoprotéines de hautes densités, les HDL. Les apolipoprotéines A-I, B et E (apoA-I, apoB et apoE respectivement) sont les éléments essentiels de la structure des lipoprotéines. Des altérations du métabolisme des apolipoprotéines sont associées à l'hypercholestérolémie et au développement de l'athérosclérose chez l'adulte. Cependant, plusieurs études ont montré que l'athérosclérose pouvait se développer à un âge plus précoce, pendant la période de vie foetale. Il est alors légitime de penser que le métabolisme des apolipoprotéines pendant la grossesse pourrait être impliqué dans le développement de l'athérosclérose au niveau foetal. Les macromolécules comme les lipoprotéines ne peuvent traverser le placenta librement. La synthèse d'apolipoprotéines par le placenta est donc indispensable pour fournir le cholestérol au foetus. Comme la grossesse est caractérisée par une élévation du cholestérol maternel, l'étude de l'expression des apolipoprotéines placentaires suivant le taux de cholestérol maternel est indispensable pour déterminer leur implication dans l'athérosclérose au niveau foetal. Pour réaliser ce projet, à partir de placentas humains prélevés à l'accouchement:, l'expression génétique de l'apoA-I, l'apoB et de l'apoE a été évaluée dans le tissu par la technique de polymérisation en chaîne en temps réel. Puis, la concentration tissulaire en protéine a été déterminée par dosage immuno-enzymatique. Nos résultats ont montré que les mères ayant un taux de cholestérol élevé avaient également une augmentation de cholestérol associé aux LDL et d'apoB dans leur circulation. Dans le placenta, l'hypercholestérolémie maternelle n'affecte ni la transcription des gènes ni les concentrations tissulaires de l'apoA-I et de l'apoE. L'absence de régulation de l'apoA-I et de l'apoE placentaires par le cholestérol maternel est surprenante, cependant, l'exacerbation du système endocrinien pendant la grossesse, notamment des hormones stéroïdiennes, pourrait avoir une influence sur l'expression des apolipoprotéines dans le placenta. Par contre, l'apoB est régulée à la hausse dans le placenta des mères hypercholestérolémiques. Un des mécanismes probable de cette régulation pourrait être l'augmentation, par le cholestérol, de l'activité de la protéine microsomale de transfert des triglycérides. Cette protéine est un élément essentiel dans la régulation de l'expression de l'apoB. De plus, l'augmentation de l'apoB est corrélée au cholestérol total maternel et à la concentration d'apoB dans la circulation maternelle et foetale. Ces résultats suggèrent que l'excès de cholestérol maternel est incorporé majoritairement dans les LDL sans affecter le métabolisme des HDL. Cette étude suggère un rôle potentiel de l'apoB placentaire dans le développement de l'athérosclérose au niveau foetal. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Placenta, Grossesse, Apolipoprotéines, Lipides, Profil lipidique.

La prééclampsie (PE), principale cause de décès maternel, est une pathologie gravidique touchant ≈8% des grossesses. Bien que l'étiologie de cette maladie soit inconnue, certaines études cliniques ont suggéré une altération du métabolisme de calcium (Ca2+) en présence de PE. Suivant l'hypothèse que les échanges de Ca2+ par les syncytiotrophoblastes sont perturbés lors de grossesses PE, notre objectif est d'approfondir les mécanismes de transport du Ca2+ dans les placentas PE en comparant, avec des placentas normaux, l'expression de différentes protéines impliquées dans l'homéostasie calcique. À partir de tissus placentaires totaux, nous avons étudié l'expression de ces protéines ainsi que l'influence des variations d'expression observés sur le transport de Ca2+ dans des cultures primaires de syncytiotrophoblastes. Les niveaux d'ARNm et de protéine ont été examinés par PCR en temps réel et par Western Blot, respectivement, chez un groupe normal (n=16) et un groupe PE (n=8). Notre étude a démontré une diminution significative du transport de Ca2+ par les syncytiotrophoblastes primaires PE ainsi qu'une diminution de l'expression protéique et d'ARNm de plusieurs gènes impliqués dans le transfert de Ca2+ dans les placentas PE, accompagné d'une augmentation de l'expression d'un marqueur de stress oxydatif (hOGG1) ainsi qu'une diminution d'une enzyme synthétisant l'ATP (ATP synthétase). Aussi, la mitochondrie et le réticulum endoplasmique semblent augmenter leurs réserves de Ca2+ lors de PE. De plus, comme plusieurs hormones sont impliquées dans la régulation de l'homéostasie du Ca2+, nous avons voulu approfondir nos recherches à ce sujet. Nous avons observé que l'expression de plusieurs récepteurs impliqués dans cette régulation était diminuée dans les placentas PE, notamment le récepteur de la progestérone, de l'œstradiol, de la vitamine D et de la PHTrP. Nous concluons donc que l'homéostasie du Ca2+ et son transport à travers le placenta sont compromis lors de grossesses prééclamptiques et cela semble être affecté par un manque d'ATP et un excès de stress oxydatif. Des recherches futures seront nécessaires afin de mieux comprendre l'implication de la régulation hormonale sur le transfert de Ca2+ lors de PE. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Prééclampsie, calcium, placenta, trophoblaste, syncytiotrophoblaste, stress oxydatif.

Il existe de nombreuses similarités entre le développement du foetus et celui des cellules tumorales. En effet, dans les deux cas ils requièrent une division cellulaire intense, une invasion des tissues de l’hôte ainsi qu’une vascularisation soutenue. De plus, malgré le fait que le foetus et les cellules tumorales expriment à la fois des antigènes étrangers (les antigènes paternels pour le foetus et les antigènes du soi modifiés au niveau des cellules tumorales) ils ne sont pas rejetés par le système immunitaire. Parmi plusieurs populations cellulaires impliquées dans ce phénomène de non rejet ou de tolérance, les cellules T régulatrices (Tregs) jouent un rôle primordial dans les deux processus. En effet, notre laboratoire a démontré que l’émergence des cellules tumorales ainsi que l’implantation fœtale s’accompagnent d’une activation forte et rapide des Tregs. Cette observation prend tout son sens quand l’élimination de ces Tregs a conduit à un rejet immunitaire de la tumeur ou du foetus. Afin de valider ces observations, nous avons mis au point une étude transcriptomique comparative entre le microenvironnement tumoral et l’interface foeto-maternelle. Cela a révélé une forte similarité et une importante diminution des voies de signalisation immunologiques associées à la présentation antigénique et à l’activation des cellules T. De plus, des analyses non supervisées ont mis en évidence une coévolution des signatures immunitaires inhibées et cela dés les premiers jours suivant l’implantation des tumeurs ou du foetus. Par ailleurs, l’élimination des Tregs (qui a conduit un rejet de la tumeur ou du foetus) a permis de faire basculer les mêmes signatures immunitaires d’un état d’inhibition à un état d’activation. En définitive, nous pensons que les mécanismes déployés au cours de l’évolution pour protéger les foetus du rejet immunitaire sont détournés afin de favoriser le développement des cellules tumorales. / There are striking similarities between fetus and tumor development. They both require intense cell division, invasion of host tissues and sustained vascularization. Moreover, despite that fetus and tumor express foreign antigens - paternal allo-antigens for fetuses and modified auto-antigens for tumors, they are not rejected by the immune system. Among others, regulatory T cells (Tregs), which are key players in tolerance, appear to play a significant role in both processes. We showed that tumor emergence as well as embryo implantation elicit a strikingly similar brisk Treg response, which functional relevance is supported by the fact that and Treg depletion leads to fetus or tumor immune rejection. Comparison of fetal and tumor microenvironments through transcriptomics revealed strikingly similar and dramatic decrease in expression of multiple immune-related pathways, including antigen presentation and T cell response. Unsupervised analyses highlighted the co-evolution in time of downregulated immune signatures, from the very first days after tumor or embryo implantation. Treg depletion, which leads to fetus or tumor rejection, converted the very same down-modulated immune signatures to up-regulated ones. We propose that means selected during evolution to protect mammalian fetuses are hijacked to license tumor development.

Le placenta assure les échanges materno-fœtaux et possède une fonction endocrine autonome. Les hormones placentaire lactogène (hPL) et chorionique gonadotrope (hCG) sont synthétisées par le syncytiotrophoblaste. A ce jour, les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion de ces deux hormones ne sont pas connus. In vitro, l’influx d’ions Ca2+ entraîne une augmentation immédiate et soutenue de la libération d’hPL et d’hCG à partir d’explants de placentas à terme. En outre, l’élévation de la concentration extracellulaire en albumine, principale protéine maternelle circulante en contact direct avec le trophoblaste, stimule de manière immédiate et transitoire la libération d’hPL et d’hCG.<p><p>L’objectif de nos travaux a été de vérifier la spécificité de l’activité sécrétagogue de l’albumine au niveau du placenta, de caractériser les messagers cellulaires potentiellement impliqués dans la libération d’hPL et d’hCG, et de définir l’interaction entre l’albumine et le trophoblaste, en utilisant des explants provenant de placentas humains à terme.<p> <p>Nos travaux démontrent que la riposte sécrétoire à l’albumine (5%, m/v) est largement mimée par d’autres agents colloïdaux (dextran et polygéline). Cette stimulation colloïdale de la libération d’hPL et d’hCG impliquerait une mobilisation de Ca2+ à partir de réserves intracellulaires. L’intervention de 3 messagers cellulaires a été envisagée: les IPs/DAG, l’AMPc, et le GMPc. Le fluorure de sodium, la forskoline, ou le nitroprussiate sodique, activateurs connus de la production respective des IPs, de l’AMPc, et du GMPc, augmentent de manière significative les taux placentaires de chacun de ces messagers, sans toutefois affecter la libération d’hPL ou d’hCG. De plus, l’élévation de la concentration extracellulaire en albumine (5%, m/v) ne modifie pas les taux des IPs, de l’AMPc et du GMPc dans les explants placentaires, tandis qu’elle stimule la sécrétion hormonale. Ces systèmes de signalisation, bien que fonctionnels au niveau du trophoblaste, ne joueraient donc pas un rôle majeur dans la régulation de la libération d’hPL et d’hCG. <p><p>Nos résultats mettent en évidence une internalisation rapide d’albumine marquée, avec de l’125I ou de la fluorescéïne, dans le syncytiotrophoblaste. Une large fraction de cette albumine est recyclée, intacte, vers la circulation maternelle selon un processus sensible à l’abaissement de la température et indépendant du cytosquelette. L’albumine marquée restant dans les explants placentaires est partiellement dégradée. Trois mécanismes ont été envisagés pour expliquer ces mouvements d’entrée et de sortie de l’albumine au sein du placenta humain: l’endocytose médiée par l’albondine via les caveolae, le système des coated pits clathrine-dépendant, et l’endocytose médiée par la mégaline. Par immunohistochimie, nous avons montré que, dans le tissu placentaire, la caveoline-1, protéine caractéristique des caveolae, est localisée uniquement dans l’endothelium des capillaires fœtaux. La clathrine, au niveau des coated pits, et la mégaline se trouvent au contraire dans le syncytiotrophoblaste. La méthyl-b-cyclodextrine et l’hydrochlorure de chlorpromazine, inhibiteurs d’une endocytose dépendant de la clathrine, réduisent significativement l’internalisation placentaire de l’albumine marquée. Par contre, le DIDS ou le NPPB, susceptibles de perturber l’endocytose médiée par la mégaline, n’affectent pas la captation d’albumine marquée par les explants placentaires. L’albumine pénétrerait donc dans le syncytiotrophoblaste principalement par un processus clathrine-dépendant. La mégaline ne jouerait ici qu’un rôle mineur dans l’entrée de la protéine. Un tel processus de recyclage de l’albumine pourrait être similaire à celui décrit pour les immunoglobulines G au niveau du syncytiotrophoblaste.<p><p>Ces mouvement d’entrée et de sortie de l’albumine ne semblent pas associés à la stimulation de la libération d’hPL et d’hCG par l’albumine. Ils pourraient par contre participer significativement, étant donné leur ampleur, à la nutrition fœtale. L’albumine est en effet un transporteur notoire d’ions et d’acides gras, molécules qui pourraient être acheminées au fœtus via le phénomène de recyclage placentaire de l’albumine mis en évidence par ce travail. /<p><p>The human placenta is the site of all maternal-fetal exchanges, and is also an active endocrine organ. Placental lactogen (hPL) and chorionic gonadotrophin (hCG) hormones are synthesized by the syncytiotrophoblast. So far, the mechanisms involved in the regulation of both hormones secretion remain elusive. In vitro, calcium inflow causes an immediate and sustained rise in the hPL and hCG releases from human term placenta explants. Moreover, increasing the extracellular concentration of albumin, the major maternal plasma protein in direct contact with the human trophoblast, stimulates the hPL and hCG releases in an immediate and transient way.<p><p>Our study have aimed to check the specificity of this secretory effect of albumin, to investigate the potential cellular messengers involved in the hPL and hCG releases, and to define the interaction between albumin and the throphoblast layer, using human term placenta explants.<p><p>Our results indicate that the triggering effect of albumin (5%, w/v) is largely mimicked by two other colloidal agents (dextran and polygelin). This “colloidal” stimulation of the hPL and hCG releases would involve the mobilization of calcium from intracellular pools. Three cellular messengers have been considered to mediate this process: the IPs/DAG, the cAMP, and the cGMP. Sodium fluoride, forskolin, or sodium nitroprusside, known activators of respectively the IPs, cAMP, and cGMP production, significantly increase the placental content of each of those messengers, without modifying the hPL and hCG releases. In addition, raising the extracellular concentration of albumin does not cause any change in the placental level of IPs, cAMP, and cGMP, while stimulating the hormonal release. These three signaling pathways are thus functional in human term trophoblast but do not appear to significantly modulate the hPL and hCG secretions. <p><p>Our findings show that albumin, labeled with 125I or with fluorescein, is rapidly internalized into the syncytiotrophoblast. Thereafter, the intact protein is largely recycled to the maternal circulation, through a temperature-sensitive and cytoskeleton-independent process. The labeled albumin remaining in placental explants is partially degraded. Three different mechanisms could participate to the albumin entry into the human placenta: the albondin-mediated endocytosis via the caveolae, the clathrin-dependent coated pits system, and the megalin-mediated endocytosis. Using immunohistochemistry, caveolin-1, marker of the caveolae, is localized in the endothelium of the fetal capillaries and not in the syncytiotrophoblast. By contrast, clathrin and megalin are observed only in the syncytiotrophoblast. Methyl-b-cyclodextrin, and chlorpromazine hydrochloride, known inhibitors of the clathrin-dependent endocytotic process, significantly reduce the placental uptake of labeled albumin. On the other hand, DIDS or NPPB, able to perturb the megalin-mediated endocytosis, do not affect the labeled albumin uptake. Thus, albumin seems to be internalized into the syncytiotrophoblast mainly through a clathrin-dependent mechanism. Megalin would only play a minor role in this process. Such movements of albumin in the human placenta may be similar to the recycling process reported for IgG at that site.<p><p>The placental apical recycling of albumin is not associated to the albumin triggering effect on the hPL and hCG releases. This quantitatively significant internalization process may participate to the fetus’ nutrition. Indeed, Albumin carries ions and fatty acid, which could be brought to the fetus via the protein recycling evidenced by our study.<p><p><p> <p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Trypanosoma cruzi est un parasite protozoaire à multiplication intracellulaire, agent de la maladie de Chagas, infectant 16 à 18 millions de personnes en Amérique latine. Il peut être transmis de la mère infectée au fœtus dans 2 à 10 % des cas, mais ses autres effets sur la gestation ont été peu étudiés. Par ailleurs, les cytokines ont des effets sur la gestation. Certaines d’entre elles, comme l’interleukine-1, l’IL-4, l’IL-5, l’IL-10, le GM-CSF et le TGF-b2, sont bénéfiques pour la gestation, tandis que d’autres, comme l’IL-2, l’IL-12, l’IFN-g et le TNF-a ont des effets nocifs sur celle-ci. L’impact de l’infection à T. cruzi, stimulant la production de TNF-a et d’IFN-g, sur l'implantation et la croissance fœtale n’a pas été étudié.<p><p>Le but de notre travail était d’étudier les effets de l’infection aiguë à T. cruzi sur la capacité de reproduction de la souris. Nous avons ainsi évalué les effets de cette infection sur la fertilité, le développement et la viabilité des fœtus de souris et le rôle de l’IFN-g et du TNF produits au cours de l’infection sur le développement de la gestation. <p><p>Nous avons montré que l’infection aiguë à T. cruzi :i) diminue la capacité de reproduction de la souris ;ii) provoque une mortalité fœtale massive précoce (résorptions), tardive et néonatale associée à un retard de croissance intra-utérin, et ce, iii) en dehors de toute transmission congénitale du parasite. <p>Par ailleurs nos travaux montrent que la mortalité fœtale/néonatale est associée à une invasion parasitaire massive du placenta qui présente d’importantes lésions à type d’infiltrats inflammatoires, de nécrose ischémique, de dépôts de fibrine et de thromboses vasculaires. Nous avons noté qu’il existe une relation inverse entre la charge parasitaire des unités utéro-placentaires et la viabilité du conceptus, suggérant que ces lésions placentaires contribuent à la mortalité fœtale en limitant les échanges materno-fœtaux. <p>Enfin, nous avons également étudié le rôle de cytokines abortogènes comme le TNF et l’IFN-g, produites abondamment pendant l’infection aiguë de la souris par T. cruzi. Les taux sanguins maternels d’IFN-g étaient augmentés au 9ième mais pas aux 17ième et 19ième jours de gestation, alors que les taux de TNF sanguin et la production placentaire de cette cytokine augmentaient aux 17ième et 19ième jours de gestation. Afin d’évaluer le rôle de ces deux cytokines dans la mortalité fœtale, des souris ont été traitées par la pentoxifylline, pour inhiber la transcription du gène de TNF-a et diminuer la production d’IFN-g. Ces souris montraient une réduction de la mortalité fœtale à mi-gestation, associée à une diminution de la production du TNF placentaire, sans modifications des taux systémiques et sans effets sur l’IFN-g, suggérant la contribution du TNF dans la mortalité fœtale associée à l’infection aiguë par T. cruzi. <p><p>En conclusion, notre travail montre que l’infection aiguë à Trypanosoma cruzi exerce un effet particulièrement néfaste sur la capacité de reproduction et le développement de la gestation chez la souris et que les lésions placentaires liées à l’infection et la production de TNF par le placenta infecté contribuent à cet effet.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’activation des lymphocytes T nécessite un double signal. Le premier est antigénique et permet la reconnaissance d’un peptide spécifique présenté à la surface de cellules présentatrices d’antigène (APC). Le second signal est co-stimulateur et implique l’interaction avec des molécules activatrices exprimées par les APC et la présence de cytokines proinflammatoires. Les cellules dendritiques (DC) sont les uniques APC capables de délivrer ce double signal et d'activer les lymphocytes T naïfs, initiant ainsi les réponses immunes primaires. L’immaturité du système immunitaire du nouveau-né est responsable d’une plus grande susceptibilité aux maladies infectieuses ainsi qu’une faible réponse vaccinale. Des déficiences tant au niveau de l’immunité innée que de l’immunité acquise participe à une faible défense face aux agressions. A la naissance, les DC expriment des niveaux faibles de molécules co stimulatrices et présentent un défaut majeur de synthèse d'IL 12, cytokine cruciale pour l’établissement de réponses de type Th1. Le but de ce travail est d’évaluer la capacité des DC du nouveau-né humain à activer les lymphocytes T CD8+.<p>Dans une première approche, nous avons utilisé un modèle unique d’induction de réponse primaire in vitro qui permet d'étudier l'activation de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène Melan-A, une protéine du soi exprimée par les mélanocytes. Ces lymphocytes existent à des fréquences particulièrement élevées chez les individus sains HLA-A2 et présentent les caractéristiques de lymphocytes T naïfs. Dans ce modèle, nous avons d’abord analysé les capacités immunostimulatrices de différentes populations de DC différenciées in vitro. Nous avons observé que les DC différenciées par la culture de monocytes purifiés en présence d'IL-3 et d’IFN-beta sont capables d’initier une réponse fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, analogue à celle induite par les DC différenciées en présence de GM-CSF et d’IL-4. Ce même modèle nous a permis de démontrer que, en dépit de leur défaut de production d’IL 12, les DC du nouveau-né sont capables d'induire efficacement une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique.<p><p>Afin dévaluer la relevance in vivo de nos observations, nous avons étudié le phénotype et la fonction des DC circulantes chez des nouveau-nés infectés par le cytomégalovirus (CMV). L’infection par le CMV au cours de la vie fœtale représente une situation clinique où le nouveau-né développe une réponse mature et fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, alors que celle des lymphocytes T CD4+ est déficiente. Ces expériences ont montré que le phénotype, la fonction et la réponse à différents stimuli des APC présentes en périphérie ne sont pas affectés par l’infection congénitale par le CMV. Ces résultats suggèrent que l’observation des DC circulantes des nouveau-nés infectés par le CMV ne permet pas d’analyser l’influence du virus sur la fonction des DC néonatales. Dans ce but, nous avons reproduit un modèle d’infection in vitro de DC par une souche primaire du CMV. L’utilisation de micropuces à ADN nous a permis de comparer l’expression de gènes différentiellement induits par l’infection des DC d’adultes et de nouveau-nés. Nous avons ainsi révélé une proportion importante de gènes différentiellement induits, parmi lesquels celui de l’IFN-beta. Nous avons confirmé ce défaut au niveau protéique et mis en évidence une production d’IL 12 déficiente en réponse à l’infection par CMV.<p>L’ensemble de nos résultats indique que malgré leur immaturité, les DC du nouveau-né sont capables, dans certaines circonstances, d’induire une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Cependant, le défaut de production de certaines cytokines co-stimulatrices pourrait être impliqué dans la faible réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection par CMV. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension de l’induction de réponses cytotoxiques au cours d’infections virales et pour l’élaboration de stratégies vaccinales en début de vie.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished