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The role of the diaphanous-related formins DRF1, DRF2 and DRF3 in ErbB2-dependent cell motility and microtubule dynamicsAbou Serhal Daou, Pascale 16 September 2013 (has links)
Les formines de la famille des DRF sont des puissants nucleateurs d'actine. Précédemment, nous avons montré que DRF1 participe à la capture des microtubules (MTs) au niveau du cortex cellulaire, en aval du récepteur ErbB2. Ceci impliquait le recrutement d'APC et ACF7. Dans cette étude, nous avons examiné la contribution de DRF1, DRF2 et DRF3 à la capture des MT corticaux et à la migration cellulaire ErbB2- dépendante. La déplétion individuelle de DRF1/2 ou 3 à l'aide de siRNA perturbe fortement la migration chimiotactique ErbB2-dépendante. Les DRF sont toutes trois requises pour la capture des MT au niveau du cortex cellulaire. Des mutants de DRF1 déficients pour leur association avec l'actine sont toujours actifs pour la capture des MT. Nous avons aussi pu montrer qu'une construction limitée au domaine FH2 des DRF était parfaitement fonctionnelle. Nous avons alors procéder à une recherche systématique des protéines se liant au domaine FH2, par purification d'affinité et spectrométrie de masse. Nous avons observé que les domaines FH2 de DRF1, DRF2 et DRF3 se lient à des groupes de partenaires distincts. Ainsi, seul le domaine FH2 de DRF1 lie la protéine Rab6-Interacting Protein 2 (RB6IP2). De plus, DRF1 contrôle le recrutement de RB6IP2 au cortex cellulaire et la déplétion concomitante de RB6IP2 et d'IQGAP1 perturbe fortement la capture des MT. Ces résultats démontrent l'implication de l'interaction entre DRF1 et RB6IP2 dans la capture des MT dans les cellules en migration. / Diaphanous-related formins (DRF) nucleate single linear filaments, binding to and protecting from capping their growing barbed ends. We have previously found that DRF1 participated to the tethering of microtubules (MTs) to the cell cortex, downstream of the ErbB2 receptor tyrosine kinase. This involved the recruitment of APC and ACF7. We have now further investigated the contribution of DRF1, and of the closely related DRF2 and DRF3, to the capture of cortical MTs and ErbB2-dependent breast carcinoma cell migration.Using siRNA to knock down individual DRFs, we found that depletion of DRF1/2 or3 strongly disturbed ErbB2-dependent chemotaxis. All three DRFs were required for the formation of cortical MTs, in a non-redundant manner. DRF1 mutant proteins defective for actin binding were still active for MT capture. We also found that, upon truncation of the Formin Homology (FH) 1 domain, the FH2 domain remained fully functional. In a systematic search for proteins binding to the FH2 domains via affinity purification and mass spectrometry analysis, we observed that the FH2 domains of DRF1, DRF2 and DRF3 engaged with distinct sets of proteins. For instance, only FH2 domain of DRF1 pulled down Rab6-Interacting Protein 2 (RB6IP2). Interestingly, DRF1 controlled the cortical localization of RB6IP2 and concomitant depletion of RB6IP2 and IQGAP1 strongly disturbed capture of cortical MTs, showing the involvement of the DRF1/IQGAP1/RB6IP2 interaction in MT tethering at the cell leading edge.
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Dynamique des filaments d'actine: de la molécule individuelle à la formation de structures organiséesMichelot, Alphée Tristan 06 July 2007 (has links) (PDF)
L'exercice de forces est indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus cellulaires. Chez les eucaryotes, une majorité de ces phénomènes motiles est assurée par la polymérisation et la dépolymérisation spatialement et temporellement contrôlée du cytosquelette d'actine. Le cytosquelette est composé de microfilaments d'actine qui s'associent en structures complexes aux propriétés mécaniques particulières. Au cours des dix dernières années, beaucoup d'efforts ont été menés pour comprendre la dynamique des réseaux branchés de filaments d'actine initiés par le complexe Arp2/3. En revanche, peu de choses sont connues à propos de la dynamique de formation et de désassemblage des câbles de filaments d'actine. Récemment, il fut montré que les formines représentent une famille de protéines essentielles à l'initiation de ces structures.<br />Cette thèse résume dans un premier temps le travail accompli pour comprendre le mécanisme d'action des formines à l'échelle moléculaire. La plupart des formines sont des nucléateurs processifs, c'est-à-dire qu'ils permettent la formation et l'élongation de nouveaux filaments d'actine, tout en restant liées à l'extrémité du filament qui polymérise. Nous avons montré par la technique originale de microscopie à onde évanescente que Arabidopsis Thaliana FORMIN1 représente un nouveau type de formine, qui se déplace sur le côté des filaments d'actine après les avoir formés. Depuis le côté d'un filament préexistant, FORMIN1 est capable de nucléer un autre filament, initiant la formation de câbles de filaments d'actine. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse au mécanisme moléculaire mis en jeu par l'ADF/cofiline pour accélérer la dynamique d'assemblage/désassemblage des filaments d'actine, et traite pour la première fois de la dynamique de l'actine en temps réel à l'échelle du filament individuel ou à l'intérieur de structures organisées de filaments d'actine.
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Caractérisation fonctionnelle des protéines ypt/rabgap, Gyp5p et Gyl1p et de leur interaction avec une protéine à domaine N-BAR, Rvs167p chez Saccharomyces cerevisiae / Functional characterization of Ypt/RabGAP proteins, Gyp5p and Gyl1p and of their interaction with a N-BAR domain protein, Rvs167p in Saccharomyces cerevisiae.Prigent-Cossard, Magali 22 September 2011 (has links)
Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, la croissance est orientée et nécessite l’apport de membranes et d’enzymes pour la synthèse de la paroi cellulaire. La régulation du transport des vésicules permettant cet apport est assuré par les GTPases de la famille Ypt/Rab. Sec4p, une Ypt/Rab GTPase, est impliquée dans l’exocytose en assurant la spécificité de l’ancrage des vésicules post-golgiennes envoyées aux sites de croissance. La régulation de son activité GTPase est essentielle pour sa fonction.Nous nous intéressons aux protéines Gyp5p et Gyl1p, deux membres de la famille des protéines activatrices des GTPases Ypt/Rab chez S. cerevisiae. Le laboratoire a montré l’implication du complexe Gyp5p-Gyl1p dans l’exocytose polarisée vraisemblablement par la régulation de Sec4p. Notre étude a montré une interaction directe in vitro de ces deux protéines, ainsi qu’une interdépendance pour une bonne localisation du complexe aux sites de croissance polarisée, c'est-à-dire au sommet du bourgeon durant la croissance apicale et au cou du bourgeon durant la cytocinèse. Cette localisation dépend de deux formines, d’éléments du polarisome et des câbles d’actine. De plus, nous avons montré par des expériences d’immunofluorescence et de microscopie électronique en collaboration avec J.-M. Verbavatz (iBiTec-S, CEA), que ces protéines sont transportées sur des vésicules de sécrétion jusqu’aux sites de croissance polarisée.Notre étude de l’interaction du complexe Gyp5p-Gyl1p avec Rvs167p, une protéine à domaine BAR (Bin1-Amphiphysin-Rvs167p) a montré que Gyp5p et Gyl1p sont nécessaires pour la bonne localisation de Rvs167p au sommet du petit bourgeon et que ces complexes se forment principalement dans des fractions enrichies en membrane plasmique. Pour mieux caractériser ces interactions, nous avons réalisé une mutation de la proline 473 dans le domaine SH3 de Rvs167p et des délétions des séquences riches en proline de Gyp5p et Gyl1p. Ces mutations entraînent un défaut d’interaction de Rvs167p avec Gyp5p et Gyl1p et la perte de la localisation de Rvs167p au sommet du petit bourgeon. Afin de comprendre la fonction de ces interactions, nous avons réalisé des expériences de microscopie électronique et des tests de sécrétion de l’endo-β-1,3-glucanase, Bgl2p dans une souche Δrvs167. Nous avons mis en évidence une accumulation de vésicules de sécrétion au niveau du petit bourgeon et un défaut de sécrétion de Bgl2p à 13°C dans cette souche. De plus, nous avons également observé une accumulation de vésicules de sécrétion dans une souche exprimant Rvs167p mutée pour la proline 473 et un défaut de sécrétion de Bgl2p dans une souche exprimant Gyp5p et Gyl1p dépourvues de leurs séquences riches en proline. Ces résultats montrent que Rvs167p joue un rôle dans l’exocytose polarisée au stade du petit bourgeon et que cette fonction dépend de son recrutement par Gyp5p et Gyl1p au sommet du petit bourgeon. / In Saccharomyces cerevisiae, growth is oriented and requires the contribution of membranes and enzymes for the synthesis of the cell wall. Regulation of vesicles transport allowing this contribution is provided by the Ypt/Rab GTPases family. Sec4p, a Ypt/Rab GTPase, is involved in exocytosis by controlling the tethering of post-Golgi vesicles at sites of growth. Regulation of Sec4p GTPase activity by is essential for its function.We studied the proteins Gyp5p and Gyl1p, two members of the Ypt/Rab GTPases activiting proteins (RabGAP) family in S. cerevisiae. Gyp5p and Gyl1p interact with Sec4p and are involved in the control of exocytosis at the small-bud stage. Our study showed that Gyp5p and Gyl1p interact directly in vitro and are interdependent for their correct localization to the sites of polarized growth, e.g. the bud tip during apical growth and the bud neck during cytokinesis. We showed that the localization of Gyp5p and Gyl1p to the sites of polarized growth depends on the formins Bni1 and Bnr1, but also on polarisome components and actin cables. Moreover, we showed by immunofluorescence and electron microscopy (in collaboration with J.-M. Verbavatz), that Gyp5p and Gyl1p are transported onto secretory vesicles to access the sites of polarized growth.We studied the interaction of Gyp5p and Gyl1p with Rvs167p, a BAR domain (Bin1-Amphiphysin-Rvs167p) protein and showed that Gyp5p and Gyl1p are necessary for the recruitment of Rvs167p to the small-bud tip. Both the mutation of the proline 473 in the SH3 domain of Rvs167p and the deletion of the proline-rich regions of Gyp5p and Gyl1p disrupt the interaction of Rvs167p with Gyp5p and Gyl1p and impair the localization of Rvs167p to the tips of small buds. Electron microscopy experiments unraveled an accumulation of secretory vesicles in small buds of rvs167Δcells and β-1,3-endoglucanase Bgl2p secretion assays showed Bgl2p secretion defects in cultures enriched in small buds at 13°C. In addition, an accumulation of secretory vesicles was observed in Rvs167pP473L strain, and Bgl2p secretion defect were found in strains expressing Gyp5p and Gyl1p deleted of their proline-rich sequences. These results show that Rvs167p plays a role in polarized exocytosis at the small bud stage and that its function in exocytosis depends on its recruitment to the tip of small buds by the RabGAP proteins Gyp5p and Gyl1p.
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