Dans Escherichia coli la Dam Methyl Transferase (DamMT) est responsable du transfert d’un groupement méthyle sur les adénosines situés au cœur du tétranucléotide GATC; il s’agit donc d’une activité post réplicative. Ainsi, après le passage de la fourche de réplication, le brin d’ADN nouvellement synthétisé est non méthylé – l’ADN est dit hémimethylé. L’ADN reste hémimethylé pendent une brève période - de l’ordre de la minute - avant d’être reméthylé par la DamMT. L’hypothèse de l’implication de la méthylation de l’ADN dans le contrôle général du programme de maintenance de l’ADN repose essentiellement sur cette observation, puisque l’ADN hemimethyle – exception faite de l’origine de réplication et de la région promotrice du gène dnaA – est diagnostique du passage récent de la fourche de réplication. Cette hypothèse, et le criblage phylogénomique qui en a découlé a conduit a l’identification de plusieurs gènes dont les produits sont supposes être impliqués dans la maintenance de l’ADN. yjaG est l’un de ces gènes. Il a été renomme cycC en raison des dérèglements de la progression du cycle cellulaire associés a un mutant nul de ce gène. L’étude effectuée au cours de ma thèse s’attachera à expliquer l’état actuel de nos connaissances sur la protéine CycC et de son implication dans le processus de réplication de l’ADN. Nos résultats montrent que la protéine CycC est impliquée dans la processivité de la réplication lorsqu’il y a un dommage au niveau de l’ADN. CycC spécifie une activité qui conduit à freiner les fourches de réplication, afin de prévenir des avortements des réplisomes. La surexpression de CycC bloque l’initiation de la réplication entre l’ouverture de la molécule d’ADN et le chargement de l’hélicase réplicative. Nous proposons que CycC interagisse avec le complexe réplicative et ralentit les fourches de réplication. Ce ralentissement prévient de nouvelles collisions lorsque les cellules sont dans des conditions de stress-qui cause des arrêts de la réplication. / In Escherichia coli the Dam Methyl Transferase (DamMT) is responsible for the transfer of a methyl group on the adenosine located in tetranucleotide GATC, so this is a post-replicative activity. Thus, after the passage of the replication fork, the newly synthesized DNA strand is unmethylated - DNA is called hemimethylated. DNA remains hemimethylated in a brief period - about a minute - before being reméthylé by DamMT. The hypothesis of the involvement of DNA methylation in the general control of the maintenance program of the DNA is essentially on this observation, since the hemimethylated DNA - except the origin of replication and the region dnaA gene promoter - is diagnostic of the recent passage of the replication fork. This assumption and phylogenomics screening has led to the identification of several genes whose protein are supposed to be involved in the maintenance of DNA. yjaG is one of these genes. It was renamed cycC, the cell cycle progression is deregulated with a null mutant of this gene. The study in my thesis will focus on explaining the current state of our knowledge of the cycC protein and its involvement in the process of DNA replication. Our results show that the CycC protein is involved in the processivity of replication when there is damage into the DNA. CycC specifies an activity that leads to slow replication forks to prevent abortions of replisomes. CycC overexpression blocks the initiation of replication between the open complex of the DNA at oriC and the loading of the replicative helicase. We propose that CycC interacts with the replicative complex and slows replication forks. This slowdown replication prevents new collisions when cells are under stress, causing replication stops.

Dans Escherichia coli la Dam Methyl Transferase (DamMT) est responsable du transfert d'un groupement méthyle sur les adénosines situés au cœur du tétranucléotide GATC; il s'agit donc d'une activité post réplicative. Ainsi, après le passage de la fourche de réplication, le brin d'ADN nouvellement synthétisé est non méthylé - l'ADN est dit hémimethylé. L'ADN reste hémimethylé pendent une brève période - de l'ordre de la minute - avant d'être reméthylé par la DamMT. L'hypothèse de l'implication de la méthylation de l'ADN dans le contrôle général du programme de maintenance de l'ADN repose essentiellement sur cette observation, puisque l'ADN hemimethyle - exception faite de l'origine de réplication et de la région promotrice du gène dnaA - est diagnostique du passage récent de la fourche de réplication. Cette hypothèse, et le criblage phylogénomique qui en a découlé a conduit a l'identification de plusieurs gènes dont les produits sont supposes être impliqués dans la maintenance de l'ADN. yjaG est l'un de ces gènes. Il a été renomme cycC en raison des dérèglements de la progression du cycle cellulaire associés a un mutant nul de ce gène. L'étude effectuée au cours de ma thèse s'attachera à expliquer l'état actuel de nos connaissances sur la protéine CycC et de son implication dans le processus de réplication de l'ADN. Nos résultats montrent que la protéine CycC est impliquée dans la processivité de la réplication lorsqu'il y a un dommage au niveau de l'ADN. CycC spécifie une activité qui conduit à freiner les fourches de réplication, afin de prévenir des avortements des réplisomes. La surexpression de CycC bloque l'initiation de la réplication entre l'ouverture de la molécule d'ADN et le chargement de l'hélicase réplicative. Nous proposons que CycC interagisse avec le complexe réplicative et ralentit les fourches de réplication. Ce ralentissement prévient de nouvelles collisions lorsque les cellules sont dans des conditions de stress-qui cause des arrêts de la réplication.

Les glucane-saccharases (GS) de la famille GH70 sont des enzymes produites par certaines bactéries lactiques. A partir de saccharose, substrat renouvelable et peu coûteux, elles sont capables de catalyser la synthèse d’α-glucanes, homopolysaccharides dont les propriétés diffèrent suivant la spécificité de l’enzyme (taille, type de liaisons α-osidiques, degrés de branchement). Les glucanes contenant une très grande majorité de liaisons α-(1,6), appelés dextranes, présentent de nombreuses applications industrielles qui dépendent principalement de leur taille. Cependant, la synthèse directe de dextranes de taille contrôlée (de 1 à plusieurs millions de kg/mol) avec une faible polydispersité et en utilisant une seule enzyme n’est encore pas envisageable. En effet, les mécanismes moléculaires mis en jeu pour le contrôle de la taille des polymères produits n’ont encore été que peu explorés. Dans ce contexte, deux GSs ont été sélectionnées. La première, DSR-M synthétise uniquement des dextranes de faible masse molaire (MM) (28 kg/mol) exclusivement composés de liaisons α-(1,6). A contrario, le second modèle, DSR-OK produit le plus long dextrane décrit à ce jour (>109 g/mol). La caractérisation biochimique et structurale ainsi que la construction de mutants ont permis l’exploration du mode d’action de ces deux candidats. Plusieurs structures 3D de DSR-M2 (forme tronquée de DSR-M) - sans ou en complexe avec son substrat ou ses produits (isomaltotetraose) - ont été résolues. C’est la première fois que de tels complexes sont décrits et l’une de ces structures présente le domaine V le plus complet décrit à ce jour. L’analyse de ces structures couplée au suivi cinétique de la synthèse du polymère ont montré que la spécificité de DSR-M pour la synthèse de dextranes courts s’explique par un mode d’élongation distributif dû à la faible affinité de deux poches à sucre de son domaine V envers la chaîne en cours de synthèse. Des analyses RMN (15N1H – HSQC) – jamais réalisées auparavant sur une protéine si grosse – ont également étayé l’importance de la présence de résidus aromatiques dans le domaine catalytique pour la synthèse de dextranes supérieurs à 2 kg/mol. En comparaison, la synthèse de dextranes de haute MM par DSR-OK est principalement due au plus grand nombre de poches à sucre de son domaine V, permettant d’assurer une meilleure interaction avec la chaîne en cours d’élongation. L’implication de ces poches dans la détermination de la taille du dextrane a été montrée pour les deux candidats. Leur fonctionnalité est fortement liée à la présence d’un résidu aromatique de stacking, et leur répartition le long du domaine V a aussi une influence. L’ensemble de ces résultats démontre la coopération du domaine V avec le domaine catalytique pour l’élongation des dextranes, tout en offrant de nouvelles perspectives pour approfondir la compréhension de ce mécanisme. Ils offrent également des stratégies prometteuses pour l’ingénierie d’enzyme de la famille des GH70 pour la modulation de la taille des glucanes. / Glucansucrases (GS) from glycoside hydrolase family 70 (GH70) are -transglucosylases produced by lactic acid bacteria. From sucrose, an economical and abundant agro resource, they catalyze the polymerization of glucosyl residues. Depending on the enzyme specificity, α-glucans vary in terms of size, types of glucosidic bonds and degree of branching and have found multiple industrial applications mainly related to their molar mass (MM). However synthesizing polymers of controlled size with average MM ranging from 1 kg/mol to several millions g/mol and low polydispersity using one single enzyme remains challenging. Indeed, the molecular mechanisms underpinning the control of polymer size have been scarcely explored. To tackle this question, two GSs producing dextran (glucan composed of a majority of α-(1,6) linkages) were selected, and their mode of action explored via biochemical and structural analyses coupled to mutagenesis. The first enzyme selected, called DSR-M synthesizes only low molar mass (LMM) dextran (28 kg/mol) exclusively composed of -(1→6) linkages without any trace of HMM dextran (105 to 108 g/mol). In contrast, DSR-OK (second model), produces the highest MM dextran (>109 g/mol) described to date. Several 3D crystallographic structures of a truncated form of DSR-M (DSR-M2), either free or in complex with its substrate or product (isomaltotetraose) in the domain V or in the active site were solved. Such complexes were never obtained before. Noteworthy, one structure encompassed the most complete domain V reported to date. Analyses of these structures coupled to dextran synthesis monitoring, showed that the LMM dextran specificity of DSR-M2 is explained by a distributive elongation mode due to the weak affinity of its two sugar binding pockets in the domain V which interact with the growing dextran chains and allow the synthesis of dextran longer than 16 kg/mol. 15N1H NMR analyses (HSQC), for the first time performed with such a big protein, further revealed the crucial role of aromatic residues in the catalytic domain for the production of dextran from 2 to 16 kg/mol. In comparison, synthesis of HMM dextran by DSR-OK was shown to be mainly due to the sugar binding pockets of its domain V, ensuring much stronger interactions with growing dextran chains. The role of these pockets was evidenced for both enzymes, their functionality proposed to be linked to the presence of one aromatic stacking residue. Their positioning along domain V relatively to the active site is also important to promote efficient binding. All these findings highlight the cooperation between domain V and the catalytic domain for dextran elongation, offer new perspectives to acquire a deeper knowledge on this interplay and open promising strategies for GH70 enzyme engineering aiming at modulating glucan size.

L'exercice de forces est indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus cellulaires. Chez les eucaryotes, une majorité de ces phénomènes motiles est assurée par la polymérisation et la dépolymérisation spatialement et temporellement contrôlée du cytosquelette d'actine. Le cytosquelette est composé de microfilaments d'actine qui s'associent en structures complexes aux propriétés mécaniques particulières. Au cours des dix dernières années, beaucoup d'efforts ont été menés pour comprendre la dynamique des réseaux branchés de filaments d'actine initiés par le complexe Arp2/3. En revanche, peu de choses sont connues à propos de la dynamique de formation et de désassemblage des câbles de filaments d'actine. Récemment, il fut montré que les formines représentent une famille de protéines essentielles à l'initiation de ces structures.<br />Cette thèse résume dans un premier temps le travail accompli pour comprendre le mécanisme d'action des formines à l'échelle moléculaire. La plupart des formines sont des nucléateurs processifs, c'est-à-dire qu'ils permettent la formation et l'élongation de nouveaux filaments d'actine, tout en restant liées à l'extrémité du filament qui polymérise. Nous avons montré par la technique originale de microscopie à onde évanescente que Arabidopsis Thaliana FORMIN1 représente un nouveau type de formine, qui se déplace sur le côté des filaments d'actine après les avoir formés. Depuis le côté d'un filament préexistant, FORMIN1 est capable de nucléer un autre filament, initiant la formation de câbles de filaments d'actine. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse au mécanisme moléculaire mis en jeu par l'ADF/cofiline pour accélérer la dynamique d'assemblage/désassemblage des filaments d'actine, et traite pour la première fois de la dynamique de l'actine en temps réel à l'échelle du filament individuel ou à l'intérieur de structures organisées de filaments d'actine.

UPF1 (Up-Frameshift 1) est une hélicase multifonctionnelle conservée chez tous les eucaryotes. Elle est essentielle à la voie de surveillance du NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay), qui dégrade des ARNm portant un codon stop prématuré. UPF1 est l’archétype d’une famille d’hélicases qui partagent des corps similaires mais sont impliquées dans des voies cellulaires variées. Cependant, les relations structure-fonction et les caractéristiques biophysiques intrinsèques de ces moteurs moléculaires restent à ce jour peu connues. In vitro, le coeur hélicase d’UPF1 est hautement processif, il traverse des milliers de bases sur l’ARN ou l’ADN et déroule des doubles brins. Dans ce travail, nous avons cherché les facteurs clés régissant cette remarquable processivité en combinant des techniques de biochimie et de biophysique. En particulier, nous avons utilisé des pinces magnétiques pour étudier en temps réel des hélicases à l’échelle de la molécule unique. Contrairement à UPF1, l’hélicase IGHMBP2 de la famille UPF1-like n’est pas processive ; la processivité n’est donc pas un trait conservé au sein de la famille. Grâce à une étude fine de la structure 3D des deux hélicases, nous avons conçu divers mutants que nous avons utilisés pour identifier les éléments structuraux qui modulent la processivité. Notre approche révèle qu’UPF1 a une prise très ferme sur les acides nucléiques, garantissant de longs temps de résidence et d’action qui dictent sa haute processivité. Grâce à la variété de comportements des mutants, nous avons construit un modèle mécanistique expliquant le lien entre énergie d’interaction et processivité. Nous démontrons aussi que la processivité d’UPF1 est requise pour un processus de NMD efficace in vivo. Nous avons utilisé les mêmes outils biochimiques et biophysiques pour étudier une isoforme naturelle d’UPF1 humaine se déplaçant plus vite que l’isoforme majeure, et pour comparer la régulation d’UPF1 humaine et de levure par leurs domaines flanquants. Nous avons également caractérisé l'interaction d’UPF1 de levure avec de nouveaux partenaires. Nos travaux montrent comment la combinaison d'outils biochimiques, biophysiques, structuraux etin vivo offre des aperçus inattendus quant au mode de fonctionnement des moteurs moléculaires. / UPF1 (Up-Frameshift 1) is a multifunctional helicase that unwinds nucleic acids and is conserved throughout the eukaryote kingdom. UPF1 is required for the Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) surveillance pathway, which degrades mRNAs carrying premature termination codons, among other substrates. UPF1 is the archetype of a family of 11 helicases sharing similar cores but involved in various cellular pathways. However, the structure-function relationship and intrinsic biophysical properties of these molecular engines remain poorly described. In vitro, the UPF1 helicase core is highly processive, it travels along thousands of RNA or DNA bases and unwinds double-strands. In this work, we looked for key factors governing this remarkable processivity. We combined biochemical and biophysical techniques. In particular, we used magnetic tweezers to study helicases in real time at a single molecule scale. In contrast to UPF1, the related IGHMBP2 is not processive, thus processivity is not a shared family trait. Based on the 3D structures of both proteins, we designed various mutants and used them to identify structural elements that modulate processivity. Our approach reveals that UPF1 has a very firm grip on nucleic acids, guaranteeing long binding lifetimes and action times that dictate its high processivity. Thanks to the variety in mutant behaviors, we built a novel mechanistic model linking binding energy to processivity. Furthermore, we show that UPF1 processivity is required for an efficient NMD in vivo. In addition, we used the same biochemical and biophysical tools to investigate a natural human UPF1 isoform moving faster than the major isoform, and to compare the regulation of human andyeast UPF1 by their flanking domains. We also characterized the interaction of yeast UPF1 with new NMD partners. Our work shows how a combination of biochemical, biophysical, structural and in vivo tools can offer unexpected insights into the operating mode of molecular motors.

Cette thèse est consacrée à la mise au point d'une machine moléculaire artificielle sous la forme d'un [1]rotaxane, capable de synthétiser différents polymères de façon autonome. Au cours de cette étude, nous avons réalisé la première synthèse hautement diastéréosélective de [1]rotaxanes par la méthode de reconnaissance active catalysée au cuivre(I). Nous avons montré qu'un frein moléculaire est nécessaire pour assurer la stabilité de l'architecture entrelacée. De plus, l'utilisation d'un macrocycle avec une chaine latérale courte est indispensable pour favoriser la synthèse de lassos moléculaires. Enfin, le centre asymétrique du frein moléculaire guide la stéréosélectivité de la réaction. Ceci permet de faire la synthèse stéréodivergente de [1]rotaxanes à partir de macrocycles énantiomériquement purs. La seconde partie du projet concerne et de la processivité potentielle de ce type d'architecture moléculaire. Dans ce cadre, nous avons construit un [2]rotaxane présentant un stoppeur labile et une fonction thiol protégée sur la chaine latérale du macrocycle. La libération contrôlée du thiol induit la formation d'un [1]rotaxane piégé in situ par un nucléophile indiquant le potentiel de cette approche pour la conception de machines moléculaires fonctionnant de façon itérative. / This thesis is devoted to the development of an artificial molecular machine in the form of [1]rotaxane, designed to synthesize different kind of polymers autonomously. During this study, we accomplished the first highly diastereoselective synthesis of [1]rotaxanes by the copper(I)-catalysed active template method. We showed that a molecular brake was necessary to ensure the stability of the interlocked architecture. Moreover, the use of a short lateral chain of the macrocycle is essential to promote the synthesis of molecular lassos. Finally, the asymmetric center of the molecular brake induces the stereoselectivity of the reaction. This allows us to accomplish the stereodivergent synthesis of [1]rotaxanes from enantiomerically pure macrocycles. The second part of this project concerns the study of the potential processivity of this kind of molecular architecture. In this context, we built a [2]rotaxane which has a labile stopper and a protected thiol moiety on the lateral chain of the macrocycle. The controlled release of the thiol leads to the formation of a [1]rotaxane trapped in situ by a nucleophile, showing the potential of this approach for the design of molecular machines working processively.