Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire unicellulaire qui se développe à l’intérieur d’une cellule hôte. Chez les parasites Apicomplexa, peu de chose sont connues sur la N-glycosylation. Nous avons mis en évidence la présence de N-glycannes parasitaires totaux et démontré que ces N-glycannes sont de type riche en mannose. En utilisant une lectine, nous avons purifié de nombreuses N-glycoprotéines parasitaires intervenant majoritairement dans les mécanismes de motilité, d’invasion et de trafic intracellulaire. Nous avons démontré qu’un traitement par une drogue inhibant la synthèse des N-glycannes perturbe plusieurs processus biologiques. Nous avons étudié les fonctions biologiques des N-glycannes de TgGAP50 qui appartient au glidéosome, un moteur impliqué dans la motilité du parasite. Nous avons déterminé que TgGAP50 porte des N-glycannes hétérogènes riches en mannoses. Nous avons montré que la N-glycosylation de TgGAP50 est impliquée dans le trafic de la protéine et dans l’interaction avec les partenaires du glidéosome. Nos travaux démontrent que T. gondii est capable de synthétiser des N-glycoprotéines et que les N-glycannes sont potentiellement impliqués dans le trafic des protéines et dans les interactions moléculaires importantes pour la motilité et l’invasion des cellules hôtes par le parasite. / The apicomplexan parasite Toxoplasma gondii penetrates virtually any kind of mammalian cell using proteins released from late secretory organelles and a unique form of gliding motility. How T. gondii glycosylated proteins mediate host-parasite interactions remains elusive. Here, we report comprehensive proteomics and glycomics analyses showing that several key components required for interactions between T. gondii and host cells are N-glycosylated. Detailed structural characterization confirmed that N-glycans from T. gondii total protein extracts consist of oligomannosidic and paucimannosidic sugars, which are rarely present on mature eukaryotic glycoproteins. In situ fluorescence using concanavalin A and Pisum sativum agglutinin predominantly stained the entire parasite body. Visualization of Toxoplasma glycoproteins purified by affinity chromatography identified components involved in gliding motility, moving junction, and other additional functions. Importantly, tunicamycin-treated parasites were considerably reduced in motility, host cell invasion, and growth. In addition, we show that all three potential N-glycosylated sites of GAP50 are occupied by unusual N-glycan structures with terminal glucoses. Using site-directed mutagenesis, we demonstrate that N-glycosylation is a prerequisite for GAP50 transport into the inner membrane complex. Assembly of key partners into gliding complex by unglycosylated GAP50 and parasite motility are severely impaired. Collectively, these results provide the first molecular description of T. gondii N-glycosylation functions that are vital for parasite motility and host cell entry.

Cette thèse vise à comprendre comment les citoyens issus de l’immigration s’engagent auprès d’un parti politique de leur société d’accueil. À partir de l’approche des parcours de vie, cette étude se penche sur les récits de 25 militants originaires d’Afrique du Nord et du Moyen-Orient qui militent bénévolement au sein d’une formation politique québécoise. Ces incursions en profondeur dans les parcours individuels permettent de mieux comprendre cette pratique sociale qu’est le militantisme partisan, en parallèle avec les trajectoires migratoires de ces militants. Trois axes sont plus particulièrement analysés, soit un angle processuel, qui se penche sur les événements qui mènent à entamer une action militante auprès d’un parti ; un angle relationnel, qui s’intéresse aux relations qui s’établissent entre ces militants et les institutions que sont les partis politiques ; et un angle décisionnel et relationnel, qui évalue l’influence des relations sociales dans les différentes sphères de vie sur l’engagement militant. L’une des conclusions majeures de cette thèse est que le militantisme partisan apparaît, au Québec du moins, comme étant réservé à une certaine catégorie de personnes, tout particulièrement celles qui, par leur parcours, ont été en mesure d’acquérir de la « motilité », soit la capacité à mobiliser la mobilité (Kaufmann, 2002). En plus d’explorer cette notion de « motilité », cette thèse propose aussi deux autres notions qui émergent de l’analyse par théorisation ancrée des données, soit le concept de « projets migratoires », inhérent aux trajectoires de mobilité des participants et qui semble structurer leur incursion en politique militante active au Québec, et l’idée de se sentir « chez-soi » au Québec, différente des concepts d’intégration et d’identification que l’on retrouve habituellement en sociologie de l’immigration, mais dont la présence récurrente chez les participants témoigne de son importance dans leur cheminement migratoire.

Les kinésines sont des protéines moteur liées au cytosquelette de microtubules. Elles convertissent l’énergie provenant de l’hydrolyse de l’ATP en un travail mécanique. Leur fonction typique est de se déplacer le long du microtubule pour véhiculer des charges. La plupart des kinésines sont des dimères. Elles comprennent un domaine moteur, qui porte à la fois les sites de liaison du nucléotide et du microtubule, un domaine intermédiaire de dimérisation et une partie dite « queue » qui confère la spécificité des charges à transporter. Mon objectif est d’établir le mécanisme moléculaire à la base de la motilité, avec un intérêt particulier pour la détermination des variations structurales du domaine moteur de la kinésine le long de son cycle mécano-chimique. Au cours de ma thèse, mon objet d’étude principal a été la kinésine-1 humaine, encore appelée kinésine conventionnelle.J’ai étudié plus particulièrement deux aspects du cycle mécano-chimique de la kinésine-1, en combinant des approches de biologie structurale et l’étude de mutants. Les deux aspects concernent l’étude de la fixation de la kinésine-ADP au microtubule, conduisant à l’éjection du nucléotide et à une liaison forte de la kinésine au microtubule. Dans un premier temps, j’ai déterminé la structure du domaine moteur de la kinésine-1, dépourvue de nucléotide, et sous forme d’un complexe avec la tubuline. La tubuline est la protéine constitutive des microtubules. Cette structure était la donnée principale qui nous manquait dans le cycle structural de la kinésine. En comparant cette structure avec celle de la kinésine dans un état ATP, on peut rendre compte des changements de conformation de la kinésine selon le mouvement de trois sous-domaines du domaine moteur. Cette analyse explique notamment le lien entre la fixation de l’ATP et l’ouverture d’une poche hydrophobe distante de 28 Å du site du nucléotide. Cette cavité va accommoder le premier résidu du neck linker, conduisant à la stabilisation de ce peptide situé en partie C-terminale du domaine moteur. En s’ordonnant, le neck linker va faire avancer la charge ainsi que l’autre domaine moteur de la kinésine dimérique. Il lie ainsi la fixation de l’ATP au mouvement. L’étude de l’effet de mutations du neck linker montre aussi comment, réciproquement, le neck linker bloque la kinésine dans la conformation active pour l’hydrolyse de l’ATP. Ceci diminue la probabilité que l’ATP soit hydrolysé avant que l’étape mécanique se soit produite; cet aspect est essentiel pour rendre compte de la processivité de la kinésine-1.Ces données structurales suggèrent également comment la fixation de la kinésine-ADP au microtubule accélère l’éjection de l’ADP. Pour étudier cet aspect plus en détail, j’ai étudié l’effet de mutations sur la vitesse de largage de l’ADP. L’idée était de mimer à l’aide de mutations la fixation au microtubule. J’ai identifié ainsi deux séries de mutants qui présentent une vitesse accélérée de largage spontané de l’ADP, ce qui suggère deux voies pour interférer avec la fixation du nucléotide. J’ai ensuite déterminé la structure de deux de ces mutants dépourvus de nucléotide, ainsi que celle de la kinésine de départ également dans une forme apo, obtenue par digestion de l’ADP. En absence de microtubule, la kinésine dépourvue de nucléotide adopte une conformation soit à l’image de celle de la kinésine-ADP, ou proche de celle de la kinésine-apo liée à la tubuline. Dans un contexte naturel, seule la deuxième conformation est compatible avec la fixation au microtubule. L’ensemble de ces résultats suggère que le microtubule accélère l’éjection du nucléotide par un double mécanisme : en interférant avec la liaison du magnésium et en déstabilisant le motif P-loop de liaison du nucléotide. / Kinesins are a family of microtubule-interacting motor proteins that convert the chemical energy from ATP hydrolysis into mechanical work. Many kinesins are motile, walking along microtubules to fulfill different functions. Most kinesins are dimers, the monomer comprising a motor domain, a dimerizing stalk domain, and a tail domain. The motor domain contains both the nucleotide-binding site and the microtubule-binding site. I am interested in the molecular mechanism of kinesin's motility. In particular I want to establish the structural variations of the kinesin motor domain along with the mechanochemical cycle of this motor protein. During my thesis, I have focused my work on the human kinesin-1, also named conventional kinesin, which is the best characterized kinesin.I have studied two aspects of the kinesin mechanochemical cycle, by combining structural and mutational approaches. Both aspects rely on the binding of ADP-kinesin to a microtubule, which leads to the release of the nucleotide and to a tight kinesin-microtubule association. First I determined the crystal structure of nucleotide-free kinesin-1 motor domain in complex with a tubulin heterodimer, which is the building block of microtubule. This structure represented the main missing piece of the structural cycle of kinesin. Three subdomains in the kinesin motor domain can be identified through the comparison of my structure with ATP-analog kinesin-1-tubulin structure. The relative movements of these subdomains explain how ATP binding to apo-kinesin bound to microtubule triggers the opening of a hydrophobic cavity, 28 Å distant from the nucleotide-binding site. This cavity accommodates the first residue of the “neck linker”, a short peptide that is C-terminal to the motor domain, allowing the neck linker to dock on the motor domain. The docking of the neck linker is proposed to trigger the mechanical step, i.e. the displacement of the cargo and the stepping of the dimeric kinesin. By studying mutants of the neck linker, I have shown that, reciprocally, this peptide locks kinesin in the ATP state, which is also the conformation efficient for ATP hydrolysis. Doing so, it prevents the motor domain from switching back to the apo-state. It prevents also an untimely hydrolysis of ATP, before the mechanical step has occurred. These features are required for movement and processivity.Second, these structural data also suggest how the binding of ADP-kinesin to tubulin enhances nucleotide release from kinesin. To further study this step of the kinesin cycle, I studied the effect of kinesin-1 mutations. These mutations were designed in isolated kinesin to mimic the state when kinesin is bound to a microtubule. I identified two groups of mutations leading to a high spontaneous ADP dissociation rate, suggesting that there are two ways to interfere with ADP binding. Then I determined the crystal structures of the apo form of two mutants as well as that of the nucleotide-depleted wild type kinesin. It showed that apo-kinesin adopts either and ADP-like conformation or a tubulin-bound apo-like one. In the natural context, the second one is stabilized upon microtubule binding. Overall, the mutational and structural data suggest that microtubules accelerate ADP dissociation in kinesin by two main paths, by interfering with magnesium binding and by destabilizing the nucleotide-binding P-loop motif.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Trypanosoma brucei est un parasite africain unicellulaire, responsable chez l’homme de la maladie du sommeil et chez les bovins de la Nagana. Il passe par différents stades lors de son cycle de vie, les deux principaux étant la forme sanguicole qui prolifère dans le sang des mammifères infectés, et la forme procyclique qui colonise le tube digestif du vecteur, la mouche glossine. Les trypanosomes sont extracellulaires, ils possèdent un flagelle qui leur permet de se mouvoir dans les différents milieux qu’ils infestent. La structure de celui-ci contient des éléments conservés au cours de l’évolution. Il constitue donc un excellent modèle de base pour en étudier l’architecture. D’autre part, le flagelle du parasite contient des structures propres à certains kinétoplastides, offrant ainsi une cible thérapeutique aux traitements anti-trypanosomiaux. Le flagelle est véritablement un organite plurifonctionnel nécessaire à la survie du parasite au sein des divers environnements qu’il rencontre lors de son cycle de développement. Outre son rôle moteur, il permet à la cellule d’échapper au système immunitaire de son hôte mammifère et de s’attacher à l’épithélium des glandes salivaires de l’insecte. Il est également requis pour le bon positionnement des organites, la morphogenèse et la division cellulaire. Enfin, il serait impliqué dans l’activité sensorielle du trypanosome. A ce jour, on ne connait quasiment rien des potentielles voies de « sensing ». Elles doivent pourtant exister, permettant l’appréhension de l’environnement, l’interaction avec les hôtes et la réception de signaux induisant la différenciation. Cet intérêt pour les voies de signalisation du parasite a abouti à l’étude des composantes de la voie TOR. TOR-Target of Rapamycin est un contrôleur central de la croissance cellulaire qu’il régule en fonction de différents stimuli externes. Il a été démontré depuis que chez T.brucei aussi, TOR régulerait la croissance temporelle et spatiale de la cellule. La kinase TOR est inhibée par sa liaison avec le complexe rapamycine-FKBP12. Nous avons identifié cette peptidyl-prolyl cis-trans isomérase chez le parasite : TbFKBP12. Elle y serait localisée au niveau du cytosquelette/flagelle. Contrairement à ce qui est observé chez la levure S.cerevisiae, l’isomérase est essentielle chez le trypanosome. Son invalidation par RNAi bloque la cytocinèse des parasites sanguicoles et provoque l’apparition d’axes de clivage internes à la cellule. Chez les formes procycliques par contre, la disparition de la protéine entraîne un défaut sévère de motilité du flagelle qui se traduit par une immobilisation partielle du parasite. TbFKBP12 est donc impliquée dans l’homéostasie du flagelle chez le trypanosome africain, organite nécessaire à la motilité et à la division cellulaire.

L'angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de capillaires préexistants, est un processus essentiel au développement et à la croissance des tumeurs. Bon nombre de protéines ont été étudiées afin d'élucider les voies de signalisation impliquées dans l'angiogenèse, dont la métalloprotéase membranaire de type 1 (MT1-MMP). Cette protéine est reconnue pour jouer un rôle crucial dans la migration cellulaire, détruisant la matrice extracellulaire pour permettre aux cellules de migrer et ce, dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes impliqués dans le contrôle de son activité demeurent incompris. Dans la présente étude, nous avons observé, en utilisant des procédures d'immunoprécipitation et de microscopie confocale, que la stimulation des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines (HUVECs) avec la sphingosine-1-phosphate (S1P), un lipide qui induit la migration des cellules endothéliales (CEs), provoque le transfert de la MT1-MMP à la périphérie cellulaire et son association avec p130Cas (Crk-associated substrate). p130Cas est une protéine d'arrimage impliquée dans les voies de signalisation de la motilité cellulaire et est également reconnue pour se relocaliser dans des replis membranaires suite à une stimulation à la S1P. Ces résultats suggèrent fortement que l'identification du complexe MT1-MMP/p130Cas au front principal des CEs migrantes pourrait être un mécanisme efficace par lequel la protéolyse péricellulaire est reliée à l'activation des voies de signalisation, permettant la migration coordonnée des CEs au cours de l'angiogenèse. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Angiogenèse, MT1-MMP, p130Cas, Migration, Sphingosine 1-phosphate.

Les métalloprotéinases matricielles (MMPs) jouent un rôle crucial dans le développement malin des tumeurs. Elles dégradent la matrice extracellulaire (MEC) permettant ainsi la migration des cellules cancéreuses vers d'autres foyers. Ce processus d'invasion tumorale est appelé "processus métastasique". La MMP-9, appelée aussi gélatinase B, est fortement exprimée lors de ce processus. Son expression peut être régulée à différents niveaux via des voies de signalisation intracellulaires, notamment au niveau de l'expression du gène, mais aussi lors de la transcription, la stabilité de son ARNm, la traduction ou la sécrétion de la protéine. Des agents anti-tumoraux sont en cours de développement ciblant les différentes étapes du développement cancéreux. Le PCK3145, un peptide synthétique, dérivé de la PSP94, dirigé contre le cancer de la prostate avancé et métastasé est au stade d'essais cliniques en phase II. Ce peptide réduit chez la souris immunodéficiente la croissance des xénogreffes de tumeurs prostatiques humaines en diminuant les concentrations plasmatiques de la MMP-9. Nos travaux visent à élucider in vitro les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation des fonctions de la MMP-9 via l'effet anti-métastasique du PCK3145. Dans un premier temps, nous avons étudié l'interaction de la MMP-9 avec la surface de la cellule cancéreuse. Nous démontrons que le PCK3145 inhibe la sécrétion de la MMP-9 et déclenche le processus de clivage de CD44 de la surface cellulaire via une cascade de signalisation intracellulaire impliquant la GTPase RhoA. Dans un second lieu, nous avons étudié le mécanisme d'action du PCK3145 menant à l'inhibition de la sécrétion de la MMP-9. Nous démontrons que cette inhibition requiert le récepteur de la laminine à 67 kDa et est dépendante de l'activation de la voie des MAPKinases. Le PCK3145 entraine la diminution de la sécrétion de la MMP-9 via HuR, une protéine intracytoplasmique qui stabilise l'ARNm de la MMP-9 en se liant à sa séquence riche en AU. Les propriétés anti-métastasiques du PCK3145 peuvent être dirigées contre d'autres types de tumeurs, autres que le cancer de la prostate, liés à l'augmentation de la MMP-9 et à la dégradation de la MEC lors d'un processus métastasique. Par ailleurs, l'identification du mode d'action du PCK3145 via le récepteur de la laminine à 67 kDa permet de cibler des cancers dont le taux de ce récepteur est particulièrement élevé telle que la leucémie. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cancer de la prostate, Métastase, Migration, Adhésion, MMP-9, HuR, ERK1/2, RhoA, CD44.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Durant mon travail de thèse, j'ai étudié le rôle central de l'ADF/cofiline, une protéine qui se lie au cytosquelette d'actine, décore spécifiquement les parties 'âgées' des filaments d'actine, diminue localement par un facteur 5 la rigidité du filament et provoque la fragmentation du filament à l'interface entre les sections nues et décorées. Dans ma première étude (Suarez et al., Current Biology, 2011), j'ai utilisé la microscopie à onde évanescente et une ADF/cofiline fluorescente pour démontrer que l'ADF/cofiline est un marqueur de l'état nucléotidique (ATP, ADP-Pi ou ADP) des sous-unités d'un filament d'actine en cours de polymérisation. De plus, l'ADF/cofiline, en accélérant la dissociation du phosphate inorganique (Pi), limite la taille du cap ATP/ADP-Pi du filament d'actine, sans toutefois le réduire à une taille zéro. Des analyses statistiques sur filaments isolés établissent une corrélation parfaite entre la densité de fixation de l'ADF/cofiline et son efficacité de fragmentation. Paradoxalement, l'efficacité de fragmentation est maximale pour une densité d'ADF/cofiline de 0.5. Ceci est confirmé par des analyses supplémentaires qui montrent que les sites de fragmentation du filament coïncident avec la position des frontières entre zones décorées et zones nues. Les conséquences de ce dernier résultat paradoxal sont l'objet de ma seconde étude (McCullough et al., 2011, Biophysical Journal). En combinant différentes sources d'ADF/cofilines (vertébré et levure) et d'actines (vertébré et levure), nous montrons, sur les quatre couples actine-ADF/cofiline possibles, qu'il existe une très forte corrélation entre (1) l'efficacité de fragmentation (qui dépend de la combinaison entre actine et ADF/cofiline) et (2) la déformation du filament, mesurée à la frontière entre zone décorée et zone nue. Au cours de ma troisième étude (Reymann et al., Molecular Biology of the Cell, 2011), nous montrons que le mécanisme de fragmentation ADF/cofiline-dépendant, établi à l'échelle d'un filament isolé, peut s'appliquer aussi à l'échelle d'une comète d'actine qui comporte un réseau complexe de filaments. Mon travail de thèse a montré que le mode d'action de l'ADF/cofiline se situe à l'intersection entre mécanismes microscopiques et macroscopiques, d'une part, et entre chimie et physique, d'autre part. Les caractéristiques microscopiques des interactions de cette protéine avec un filament d'actine isolé sont fondamentales pour expliquer des évènements macroscopiques, comme la fragmentation de filaments ou de structures complexes. D'autre part, nous avons montré comment les propriétés chimiques de l'ADF/cofiline modifient les propriétés physiques locales du filament et conduisent à la fragmentation. L'ADF/cofiline a un rôle central pour l'intégration de mécanismes physico-chimiques, à l'échelle microscopique, afin d'assurer un comportement cohérent à l'échelle de la cellule.