DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM EST UN ORGANISME UNICELLULAIRE SE NOURRISSANT PAR PHAGOCYTOSE DE MICROORGANISMES ET ENDOCYTOSE DE PHASE FLUIDE. ELLE EST CAPABLE DE MIGRATION SUR UN SUBSTRAT, PAR EMISSION DE PROTRUSIONS SUR LE FRONT CELLULAIRE AVANT, ET PAR RETRACTION DU FRONT ARRIERE. LA MOTILITE EST LIEE A L'ADHERENCE DES CELLULES SUR LE SUBSTRAT, SIEGE DE LA TRANSMISSION DES FORCES EXERCEES PAR LA CELLULE. SOUMISE A UNE FORCE DE CISAILLEMENT HYDRODYNAMIQUE, DICTYOSTELIUM SE DEPLACE DANS LE SENS DU FLUX. NOUS AVONS ETUDIE LES MECANISMES BIOCHIMIQUES MIS EN JEU EN REPONSE A LA FORCE OU A L'ETALEMENT. NOUS AVONS ANALYSER LE COMPORTEMENT DE CELLULES SAUVAGES ET DE MUTANTS D'INVALIDATION, A L'ECHELLE DE LA CELLULE ET DU BORD CELLULAIRE. NOUS MONTRONS PLUSIEURS RESULTATS. LE CALCIUM LIBRE EXTRACELLULAIRE AUGMENTE LA VITESSE DE MIGARTION DES CELLULES ET LEUR SENSIBILITE AUX FORCES. CECI EST DU A UNE AUGMENTATION DE LA DYNAMIQUE DES BORDS CELLULAIRES, LES PROTRUSIONS ETANT PLUS GRANDES ET LES RETRACTIONS PLUS EFFICACES. IL Y A DES OSCILLATIONS DES BORDS CELLULAIRES, AVEC DES PERIODES PROPRES DIFFERENTES A L'AVANT ET A L'ARRIERE DE LA CELLULE. CES PERIODES NE DEPENDENT NI DE LA CONCENTRATION NI DU TYPE CELLULAIRE. LE CALCIUM AUGMENTE LA CINETIQUE ET LA REGULARITE DE L'ETALEMENT, EN AGISSANT SUR LA POLYMERISATION D'ACTINE. L'ETALEMENT NE DEPEND QUE DE LA POLYMERISATION D'ACTINE ET DE L'EMISSION DE PROTRUSIONS, TANDIS QUE LES RETRACTIONS NE PEUVENT EXISTER SANS MYOSINE 2. ENFIN, LES PROTEINES G ET LES RECETEURS A L'IP3 SONT IMPLIQUES DANS LA SIGNALISATION CALCIQUE.

Nous étudions dans cette thèse l'influence de la protéine VASP sur la dynamique et les propriétés mécaniques des réseaux d'actine à l'origine de la motilité cellulaire. Dans une première partie, nous utilisons un système biomimétique du mouvement constitué de billes. Incubées dans un mélange minimal de protéines soutenant la polymérisation, ces billes forment un réseau d'actine appelé " comète " les propulsant vers l'avant, semblable à celui qui sous-tend la membrane du front de migration des cellules en mouvement. Grace à des formes mutantes de VASP, nous explorons la contribution à son activité des domaines qui la composent. Dans nos conditions, nous montrons également que VASP agit au travers d'un mécanisme de coopération avec le complexe Arp2/3 qui est à l'origine de la formation des réseaux d'actine. Enfin, nous étudions les modalités de recrutement de VASP par les activateurs de la famille WASP/WAVE en mutant les sites potentiels de recrutement de VASP. Dans une seconde partie, nous nous intéressons, en collaboration avec deux équipes de recherche, au rôle de VASP dans la mécanique des réseaux d'actine. Nous caractérisons en rhéologie couplée à des observations en microcopie confocale les mécanismes moléculaires de VASP dans la réorganisation de l'architecture des réseaux d'actine, en lien avec leurs propriétés mécaniques, puis, nous étudions en AFM par nano indentation l'augmentation de rigidité des réseaux d'actine formés en présence de VASP.

La contribution des cellules souches au développement tumoral est une percée conceptuelle récente dans notre compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la carcinogenèse. En ce sens, il est reconnu depuis quelques années qu'une sous-population de cellules souches mésenchymateuses (MSC) mobilisables en réponse à des facteurs de croissance tumoraux pourrait contribuer au développement tumoral. Les recherches rapportées dans ce mémoire nous ont permis d'étudier certains partenaires clé dans la régulation de la migration et de la survie cellulaire des MSC. L'observation préalable d'une modulation conjointe de l'expression d'une métalloprotéase matricielle de type membranaire (MT1-MMP) et du transporteur microsomal de glucose-6-phosphate (G6PT) nous a permis d'évaluer la contribution respective de ces joueurs dans la signalisation affectant la chimiotaxie des cellules souches ainsi que des cellules tumorales cérébrales. De plus, nous avons évalué l'impact de certains « mannosides » synthétisés en vue de cibler spécifiquement les fonctions de surfaces de MT1-MMP et qui pourraient être à l'origine de nouvelles approches thérapeutiques anticancéreuses affectant le recrutement des cellules souches au foyer tumoral. Finalement, l'importance de l'axe de signalisation MT1-MMP/G6PT dans la mobilisation du calcium intracellulaire en réponse à la sphingosine-1-phosphate, un lipide bioactif synthétisé par des niveaux d'expression élevés de sphingosine-kinase retrouvé au niveau tumoral, permet également de concevoir le ciblage effectif de l'un ou l'autre de ces partenaires dans la progression tumorale. L'ensemble de nos résultats permettra de mieux comprendre les phénomènes régulant la survie et le recrutement des MSC aux sites de foyers tumoraux, en plus de fournir de précieux renseignements sur un nouvel axe original de signalisation liant les fonctions de MT1-MMP à celles, inattendues, de G6PT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cellules souches, Cancer, MT1-MMP, G6PT, Sphingosine-1-phosphate.

Lors de la prospection de bactéries d'intérêt dans le milieu marin, nous avons isolé des colonies aux couleurs brillantes sous illumination directe, ressemblant à l'iridescence de certains papillons. L'iridescence est une couleur physique induite par des structures nanoscopiques périodiques. Ce phénomène est peu détaillé chez les procaryotes. Dans cette thèse nous avons souhaité caractériser le phénomène par des analyses physico-optiques,microbiologiques et écologiques. La souche fut identifiée comme appartenant à l'espèce Cellulophaga lytica.Les premières étapes ont permis d'illustrer le phénomène et de prouver une coloration structurale des colonies par microspectrophotométrie. Une comparaison de diverses souches a démontré l'iridescence singulière de C. lytica,dénommée iridescence " glitter-like ". Nous avons ainsi proposé la première classification des iridescences bactériennes. Certaines souches du même phylum Bacteroidetes exprimaient le phénomène. Un lien entre cette iridescence et la motilité " gliding " fut mis en évidence. De façon intéressante, l'iridescence était conservée en conditions mimant le biotope C. lytica. De plus, diverses souches marines iridescentes ont pu être ré-isolées. Elles étaient particulièrement abondantes sur les macro algues (rouges, brunes), mollusques, cnidaires et dans l'eau de mer. Nous supposons alors que ce phénomène pourrait avoir des rôles bio-écologiques. Grâce à la microscopie électronique à transmission et une modélisation, nous avons pour la première fois élucidé des structures reponsables d'une iridescence bactérienne : une organisation populationnelle de cellules alignées équidistantes.Les bases fondamentales et méthodologiques de l'iridescence bactérienne sont données dans cette thèse. Les applications correspondraient aux domaines des nanotechnologies et de la biomimétique.

Lors de la prospection de bactéries d'intérêt dans le milieu marin, nous avons isolé des colonies aux couleurs brillantes sous illumination directe, ressemblant à l'iridescence de certains papillons. L'iridescence est une couleur physique induite par des structures nanoscopiques périodiques. Ce phénomène est peu détaillé chez les procaryotes. Dans cette thèse nous avons souhaité caractériser le phénomène par des analyses physico-optiques,microbiologiques et écologiques. La souche fut identifiée comme appartenant à l'espèce Cellulophaga lytica.Les premières étapes ont permis d'illustrer le phénomène et de prouver une coloration structurale des colonies par microspectrophotométrie. Une comparaison de diverses souches a démontré l'iridescence singulière de C. lytica,dénommée iridescence " glitter-like ". Nous avons ainsi proposé la première classification des iridescences bactériennes. Certaines souches du même phylum Bacteroidetes exprimaient le phénomène. Un lien entre cette iridescence et la motilité " gliding " fut mis en évidence. De façon intéressante, l'iridescence était conservée en conditions mimant le biotope C. lytica. De plus, diverses souches marines iridescentes ont pu être ré-isolées. Elles étaient particulièrement abondantes sur les macro algues (rouges, brunes), mollusques, cnidaires et dans l'eau de mer. Nous supposons alors que ce phénomène pourrait avoir des rôles bio-écologiques. Grâce à la microscopie électronique à transmission et une modélisation, nous avons pour la première fois élucidé des structures reponsables d'une iridescence bactérienne : une organisation populationnelle de cellules alignées équidistantes.Les bases fondamentales et méthodologiques de l'iridescence bactérienne sont données dans cette thèse. Les applications correspondraient aux domaines des nanotechnologies et de la biomimétique.

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Trypanosoma brucei est un parasite africain unicellulaire, responsable chez l’homme de la maladie du sommeil et chez les bovins de la Nagana. Il passe par différents stades lors de son cycle de vie, les deux principaux étant la forme sanguicole qui prolifère dans le sang des mammifères infectés, et la forme procyclique qui colonise le tube digestif du vecteur, la mouche glossine. <p>Les trypanosomes sont extracellulaires, ils possèdent un flagelle qui leur permet de se mouvoir dans les différents milieux qu’ils infestent. La structure de celui-ci contient des éléments conservés au cours de l’évolution. Il constitue donc un excellent modèle de base pour en étudier l’architecture. D’autre part, le flagelle du parasite contient des structures propres à certains kinétoplastides, offrant ainsi une cible thérapeutique aux traitements anti-trypanosomiaux.<p>Le flagelle est véritablement un organite plurifonctionnel nécessaire à la survie du parasite au sein des divers environnements qu’il rencontre lors de son cycle de développement. Outre son rôle moteur, il permet à la cellule d’échapper au système immunitaire de son hôte mammifère et de s’attacher à l’épithélium des glandes salivaires de l’insecte. Il est également requis pour le bon positionnement des organites, la morphogenèse et la division cellulaire. Enfin, il serait impliqué dans l’activité sensorielle du trypanosome. A ce jour, on ne connait quasiment rien des potentielles voies de « sensing ». Elles doivent pourtant exister, permettant l’appréhension de l’environnement, l’interaction avec les hôtes et la réception de signaux induisant la différenciation.<p><p>Cet intérêt pour les voies de signalisation du parasite a abouti à l’étude des composantes de la voie TOR. TOR-Target of Rapamycin est un contrôleur central de la croissance cellulaire qu’il régule en fonction de différents stimuli externes. Il a été démontré depuis que chez T.brucei aussi, TOR régulerait la croissance temporelle et spatiale de la cellule.<p>La kinase TOR est inhibée par sa liaison avec le complexe rapamycine-FKBP12. Nous avons identifié cette peptidyl-prolyl cis-trans isomérase chez le parasite :TbFKBP12. Elle y serait localisée au niveau du cytosquelette/flagelle. Contrairement à ce qui est observé chez la levure S.cerevisiae, l’isomérase est essentielle chez le trypanosome. Son invalidation par RNAi bloque la cytocinèse des parasites sanguicoles et provoque l’apparition d’axes de clivage internes à la cellule. Chez les formes procycliques par contre, la disparition de la protéine entraîne un défaut sévère de motilité du flagelle qui se traduit par une immobilisation partielle du parasite. <p>TbFKBP12 est donc impliquée dans l’homéostasie du flagelle chez le trypanosome africain, organite nécessaire à la motilité et à la division cellulaire. <p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les bourgeons gustatifs, les organes sensoriels du goût, sont localisés dans la cavité oropharyngéenne et ils sont conservés chez les vertébrés à mâchoire. Selon leur localisation, ils ont une origine épithéliale différente (rostralement, ectodermique et caudalement endodermique). Ils sont composés de trois types cellulaires distincts qui détectent les différentes qualités gustatives. Bien que l'induction et la différenciation cellulaire de ces organes sont bien étudiées, les mécanismes de la formation des organes intactes et fonctionnelles à partir de ces cellules restent inconnus.L'objectif de ce travail est de comprendre comment les cellules épithéliales se comportent in vivo afin de former des organes sensoriels gustatifs fonctionnels chez le poisson zèbre. En premier, une nouvelle lignée transgénique tg(fgf8a.enhancer:GFP) (gfp+) a été caractérisée. Elle est exprimée dans tous les types cellulaires du bourgeon au cours du développement. En deuxième, la vidéomicroscopie in vivo montre que les cellules gfp+ peuvent se différencier à des cellules sérotoninergiques (tph1b/5-HT) et elle se regroupent autour de ces dernières. En troisième, de façon surprenant, les cellules gfp+ sont motiles et elles peuvent se déplacer d'un bourgeon à l'autre. Enfin, l'ablation au laser multi-photon et l'analyse du mutant ascl1a-/- montrent que la cellule 5-HT est nécessaire au maintien des cellules gfp+ dans le bourgeon. Ce travail démontre pour la première fois que la formation des bourgeons gustatifs est un processus dynamique et que les cellules de cet organe sensoriel sont motiles. / Taste buds are the sensory organs of taste, located within the oropharyngeal cavity and conserved in jawed vertebrates. They derive from two epithelia, ectodermal rostrally and endodermal caudally, without showing any major physiological differences. They are multicellular organs, composed of three distinct cell types that detect different taste stimuli. Several signaling pathways, including Wnt/b-catenin, Shh, Bmp, Notch and Fgf are required in the induction and differentiation of taste bud cells. The current work aims at understanding how oropharyngeal epithelial cells that differentiate to taste bud cell types, do behave in vivo to form functional sensory organs. The zebrafish larva is used as model because of its genetics, optical clarity and accessibility of the oropharynx. Firstly, a new transgenic line tg(fgf8a.enhancer:GFP) is characterized with respect to taste bud development. It is expressed in epithelial and all differentiating taste bud cell types. Second, spinning disk timelapse shows that gfp+ cells form groups, one of them differentiates to the 5-HT cell and altogether correspond to a developing taste bud organ. Third, surprisingly, developing taste bud cells are motile between neighbouring taste bud organs. Finally, focal two-photon laser ablation of the 5-HT cell and analysis of ascl1a-/- that is devoid of 5-HT cells show that the 5-HT cell is required for the maintenance of gfp+ cells into the developing taste bud. This is the first evidence that taste bud formation is dynamic, developing cells are motile between taste buds and require one taste bud cell type (5-HT) for their maintenance into the organ.

La formation des métastases est un processus multi étapes à travers lequel les cellules cancéreuses se détachent de la tumeur primaire pour envahir à distance dans un site secondaire. L’acquisition de capacités migratoires et invasives des cellules tumorales est cruciale dans la cascade métastatique. L'activation mutationnelle des protéines Ras favorise l'oncogenèse en perturbant une multitude de molécules et de voies qui sont impliquées dans la régulation de plusieurs processus, y compris l'invasion cellulaire et la motilité. Les petites Rho GTPases (Rac1, Cdc42 et RhoA)jouent un rôle central en contrôlant la migration cellulaire via l'assemblage des fibres d'actine, la contractilité de l'actomyosine et des microtubules.Rac1 stimule la motilité de type mésenchymateuse en favorisant la formation de lamellipodes via la formation du complexe régulateur Wave(WRC), un promoteur clé de la polymérisation de l'actine. Les protéines Ral,une autre famille de petites GTPases agissant en aval de Ras, a récemment été impliquée dans la régulation de la migration cellulaire. En particulier,RalB joue un rôle essentiel dans la motilité cellulaire en mobilisant le complexe Exocyst, son principal effecteur. Durant mon projet de thèse,nous avons investigué les mécanismes moléculaires qui contrôlent la motilité cellulaire et l'invasion en aval de la voie oncogénique Ras via le complexe RalB / Exocyst.Dans la première partie de ce manuscrit, nous avons identifié et caractérisé que le complexe WRC est à la fois un nouveau partenaire et mais aussi acteur du complexe Exocyst. En outre, nous démontrons que le complexe Exocyst dirige le complexe WRC à l’extrémité des cellules4mobiles. Cette hypothèse a été caractérisée dans la deuxième partie du manuscrit. En effet, en utilisant la technique d’optogénétique nous avonsmis en évidence le mécanisme moléculaire impliqué dans l'invasion.L’activation de RalB par Ras via les facteurs d'échange Rgl1 et Rgl2,mobilise le complexe Exocyst qui recrute ainsi le complexe WRC à l’extrémité des cellules. Cette cascade d’activation favorise la formation de protrusions, la migration et l'invasion. De manière surprenante, nous montrons que la GTPase Rac1, considérée comme la GTPase clée dans la formation de protrusions cellulaires, n'est pas impliquée dans ce processus.Enfin, nous avons analysé le niveau des protéines Ral dans une cohorte de patientes atteintes de cancer du sein. Nos résultats montrent pour la première fois une accumulation de la protéine RalB dans les compartemets invasif et métastatique suggérant un rôle potentiel de RalB dans l'invasion et la propagation métastatique des cancers du sein humain. Pour conclure,notre travail met en évidence un rôle crucial de la voie Ral, souvent sousestimée,dans le contexte de l'invasion cancéreuse. / Metastasis is a multistep process by which cancer cells migrate awayfrom the primary neoplastic mass to give rise to secondary tumors at distantsites. Thus, the acquisition of motility and invasive traits by tumor cells is acrucial step for metastasis to occur. Mutational activation of Ras proteinspromotes oncogenesis by disturbing a multitude of molecules andpathways that participate to the regulation of several processes includingalso cell invasion and motility. Among them a central role is played by Rhosmall GTPases (Rac1, Cdc42 and RhoA) which control cell migrationthrough their actions on actin assembly, actomyosin contractility andmicrotubules. Rac1 drives mesenchymal-type motility by promotinglamellipodia formation via the Wave Regulator Complex (WRC), a keypromoter of actin polymerization. Another family of small GTPases that actdownstream Ras, the Ral proteins, has been recently involved in theregulation of cell migration. RalB, through the mobilization of its maineffector the Exocyst complex, was shown to play an essential role in cellmotility. In this work of thesis, we investigated the molecular mechanismsthrough which RalB/Exocyst pathway controls cell motility and invasiondownstream oncogenic Ras.In the first part of this manuscript we describe the identification andcharacterization of the WRC complex as a novel interactor of the Exocyst.Furthermore, we provide evidences for Exocyst to be involved in drivingthe WRC to the leading edge of motile cells. This hypothesis, was finallydemonstrated in the second part of the manuscript. We were able to definethe mechanisms underlying the function of RalB in invasion by exploitingan optogenetic approach. We found that RalB, activated by Ras via the2Rgl1 and Rgl2 exchange factors, mobilizes the Exocyst complex whichrecruits the Wave Regulatory Complex (WRC) at cell edge, promotingprotrusions, migration and invasion. Even more, we show that the Rac1GTPase, usually considered the master of cell protrusions, is not involvedin this process. Finally, we analyzed Ral proteins expression in a cohort ofbreast cancer samples, pointing out for the first time an accumulation ofRalB in the invasive and metastasis compartments, suggesting a role ofRalB in invasiveness and metastatic spread of human breast cancers. Takentogether our work contribute to light up the role of the underestimated Ralpathway in the context of cancer invasion.

Le facteur de motilité autocrine (AMF) est une cytokine sécrétée par les cellules tumorales qui a été détectée dans le sérum et l'urine de patients cancéreux. Cette enzyme stimule la motilité des cellules cancéreuses in vitro et provoque des métastases in vivo. Elle peut être utilisée comme un biomarqueur métastasique.Dans cette étude, un biocapteur électrochimique sensible et spécifique a été conçu pour la détection et la quantification d'une enzyme modèle de l’AMF humain : la PGI de mammifère. Le biocapteur a été construit par liaison de 6-phosphate-D-fructose (F6P) sur une surface d'or d’électrode fonctionnalisée covalemment par des groupements oxyamine.La reconnaissance entre l’enzyme et le biorécepteur a été quantifiée par spectroscopie d'impédance électrochimique et voltammétrie dans une gamme de 10 fM à 100 nM. La limite de détection mesurée est de 6,6 fM. La sélectivité a été prouvée, ainsi que la reproductibilité. Notre biocapteur est une preuve de concept très prometteuse d'un futur dispositif analytique miniaturisé conçu pour la détection rapide, facile et précis de l'AMF. Il pourrait en outre contribuer à valider l'AMF en tant que nouveau biomarqueur du cancer métastatique.Afin d’étudier les interactions mises en jeu dans la reconnaissance entre l’enzyme et le biorécepteur, des études de mécanique moléculaire polarisable via le champ de forces SIBFA ont été réalisées. SIBFA est un champ de forces de seconde génération basé sur les résultats des décompositions ab-initio de l’énergie d’interaction et inclut donc la polarisation mais aussi l’énergie de transfert de charge.Pour cette étude nous avons mis en place deux modèles d’AMF pour SIBFA, une forme entière et une forme réduite, et nous avons construit un mime du biocapteur pour SIBFA. Pour cela, il a fallu concevoir et calibrer chaque fragment nécessaire à l’élaboration du mime. Ensuite différentes minimisations d’énergie ont été réalisées, en prenant en compte ou non la solvatation, puis des études sur les interactions mises en jeu ont été effectuées. / Autocrine motility factor (AMF) is a cytokine secreted by tumor cells that could be detected in the serum and the urine of cancer patients. This enzyme stimulates tumor cells motility in vitro and causes metastasis in vivo. It can be used as a biomarker of metastasis.In this study, a sensitive and specific electrochemical biosensor was designed for the detection and quantitation of a model of the human enzyme AMF: the mammalian PGI. The biosensor was constructed by covalently binding D-fructose 6-phosphate (F6P) on the oxyamine functionalized surface of a gold electrode.Recognition between the enzyme and the bioreceptor was quantified by electrochemical impedance spectroscopy and voltammetry in the range of 10 fM to 100 nM. The measured detection limit was 6.6 fM. Selectivity and reproducibility were also proven. Our biosensor is a promising proof of concept for the design of a future miniaturized analytical device for fast, easy and accurate detection of AMF. It could also help validate the AMF as a new biomarker of metastatic cancer.To study the interactions involved in the recognition process between the enzyme and the bioreceptor, we performed polarizable molecular mechanic studies using the force field SIBFA. SIBFA is a second-generation force field based on the results of ab- initio decomposition energy of interaction and therefore includes not only the polarization but also the charge transfer energy.For this study we have developed two models of AMF for SIBFA, an entire form and a reduced form, and we built a mime of the biosensor for SIBFA. For this, it was necessary to design and calibrate each fragment essential for the development of the mime. Then, different energy minimizations were carried out, some of which taking into account solvation parameters. Studies of interactions between the mime and the AMF model are being carried out.