Le rampement est un mode de locomotion fondamental de nombreuses cellules eucaryotes, engagé dans des mécanismes aussi importants que embryogenèse, la réponse immunitaire et la cicatrisation. Son dérèglement provoque de graves maladies, en particulier des cancers. La compréhension mécanique de ce mode de locomotion présente également un grand intérêt pour la confection de robots opérant à l'échelle cellulaire. Le schéma classique du rampement cellulaire met en jeu la polymérisation du réseau d'actine dans la partie frontale de la cellule couplée avec l'activation des points d'adhésion focaux liant la cellule à son substrat, alors que la partie postérieure de la cellule se détache du substrat sous l'effet de la contraction engendrée par les molécules de myosine. De manière simplifiée, on peut voir la partie motrice d'une cellule eucaryote comme un gel actif dont les fonctions sont contrôlées par des processus chimiques et mécaniques. En particulier, les mouvements coordonnés de ce gel engendrant le rampement impliquent une auto organisation spatiale et temporelle du cytosquelette et demandent un apport continu d'énergie. Si les bases biochimiques de la motilité cellulaire sont connues, la compréhension qualitative des interactions mécaniques entre les différents acteurs rentrant en jeu dans le rampement n'est que très limitée, et ce malgré les récents efforts visant à construire des modèles complets et exhaustifs du phénomène. Cette thèse présente l'analyse d'un modèle simple et unidimensionnel expliquant le rampement cellulaire. La première partie de la thèse est dédiée à l'analyse inverse du problème d'optimisation en vitesse et en efficacité mécanique du rampement. Notre analyse montre que les distributions optimales de contraintes contractiles et de friction avec le substrat sont en bonnes accord avec les distributions observées. Dans une seconde partie, nous proposons un mécanisme de motilité cellulaire spontanée centré sur la contraction et ignorant la polymérisation et la dépolymérisation de l'actine. A l'origine de la polarisation, l'anti-diffusion auto amplifiée des moteurs pilotant la contraction déstabilise la configuration initialement symétrique de la cellule. L'apparition de cette instabilité morphologique est pilotée par le ratio entre la diffusion et la contractilité des moteurs générant un flot convergent qui, lui-même, transporte les moteurs. Par l'étude unidimensionnelle du phénomène, nous montrons que le flot ainsi produit peut générer un mouvement de translation de la cellule qui reproduit des observations concernant la motilité spontanée des fragments de keratocytes. La troisième partie de la thèse concerne la motilité cellulaire basée sur les propriétés de polymérisation et de dépolymérisation active de l'actine qui permettent non seulement l'autopropulsion de la cellule mais aussi le mécanisme de poussée (d'obstacles) et de tirée (de noyau cellulaire par exemple) de charges données . Nous utilisons un modèle minimaliste pour montrer que la relation force-vitesse dans le cas de la poussée est essentiellement réminiscente du mécanisme de protrusion piloté par la polymérisation alors que la relation force-vitesse du tirage d'une charge ne repose sur le mécanisme de protrusion que pour des charges faibles, le mécanisme de contraction prenant le relais pour des charges plus grandes.

Les processus morphogénétiques sont les processus qui sous-tendent l'émergence de la forme. Leur étude consiste à décrire, comprendre et expliquer comment les formes apparaissent et évoluent. Pour cela, une approche computationnelle basée sur la simulation numérique, c'est à dire sur la réalisation d'expérience in silico a été utilisée et appliquée à deux cas morphogénétiques en particulier. Le premier cas a concerné la motilité cellulaire, c'est à dire l'étude des mécanismes à l'origine des mouvements et de la forme de la cellule. Une plateforme de modélisation hybride a pour cela été développée. Elle couple un modèle continu des déformations membranaires qui résultent de la dynamique spatio-temporelle de l'actine à un modèle discret de type automate cellulaire pour rendre compte de la nature discrète des adhésions et des fibres du cytosquelette de la cellule. Plusieurs situations expérimentales ont été considérées de la migration de la cellule aux formes cellulaires observées sur des substrats patternés (c'est à dire qui présentent des motifs adhésifs contrôlés) et ont permis de développer progressivement les différents éléments de la plateforme. Le second cas morphogénétique considéré a concerné la croissance vasculaire à travers différentes approches. Une approche expérimentale a eu pour but de mettre en évidence l'impact de la rigidité du substrat sur la formation de cordons vasculaires in vitro. La seconde approche a porté sur le développement d'un modèle computationnel hybride pour rendre compte de la croissance vasculaire dans le contexte de l'angiogenèse tumorale. Le modèle hybride couple une formulation continue pour d écrire les processus de diffusion des différentes espèces moléculaires impliquées (tels que les facteurs de croissance ou l'oxygène) à une formulation discrète pour d écrire la migration individuelle des cellules endothéliales formant les vaisseaux. La structure modulaire du modèle computationnel a de plus permis d'int égrer les mécanismes d'adaptation du diamètre des vaisseaux qui résultent des contraintes hémodynamiques c'est à dire liées au flux sanguin. La plateforme computationnelle a été développée par la suite pour intégrer un module de croissance tumorale et un module sur les moyens d'actions thérapeutiques, dans le cadre du projet CATS pour Computer-Assisted Therapeutic Strategy. L'ambition de ce projet en cours de développement, est de mettre au point une tumeur virtuelle destinée à tester et à optimiser de nouveaux protocoles thérapeutiques.

The goal of this thesis is the development of a tracking algorithm for populations of unmarked cancer cells that migrate in 3D in vitro gels. The tracking algorithm is intended to be a tool for analysing the motility of large population (i.e. hundreds) of cells in the context of the anti-migratory drug development and more specifically drug screening. In oncology, cancer cell migration plays pivotal roles in the spread of cancer cells from a primary tumor site to neighboring and secondary sites, i.e. the processes of tissue invasion and metastasis. Preventing such processes represents an important therapeutic approach to cancer treatment. Providing tools able to test potential anti-migratory drugs thus constitutes currently a real need in oncology therapy. The goal of drug screening in this context aims to rapidly and efficiently test the anti-migratory effects of many experimental conditions on cancer cell populations.<p>The focus in this thesis lies in two specific aspects that are important in anti-migratory drug screening: tracking cells inside an in vitro 3D environment and doing so using unmarked cells. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La bactérie Myxococcus xanthus forme des structures multicellulaires appelées corps fructifères pour résister à des conditions de carence nutritive. La formation de ces structures implique un système chimiotactique particulier, le système Frz, qui régule le changement de direction des cellules, provoqué par la relocalisation simultanée des deux appareils de motilité (A) et (S) d’un pôle à l’autre de la cellule. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur la connexion entre le système chimiotactique Frz et ses protéines cibles MglAB dans le contrôle de l’inversion de la polarité. L’axe de polarité des cellules est établi par MglA, une petite protéine G de la famille Ras, qui constitue un embranchement vers la régulation des deux appareils de motilité au pôle avant, et son inhibiteur MglB localisé au pôle arrière. Nous avons montré qu’en interagissant directement et spécifiquement avec le cytosquelette, MglA contrôle l’assemblage et le désassemblage de la machinerie de motilité A. Par une approche évolutive, nous avons élucidé l’architecture modulaire du système Frz et l’implication de quatre domaines régulateurs pour connecter le système Frz aux protéines MglAB, filtrer et amplifier le signal. Nous proposons un mécanisme d’inversion de la polarité dans lequel l’action indépendante de deux RRs à chaque pôle de la cellule perturbe les interactions entre une petite protéine G et son inhibiteur apparenté pour convertir un axe de polarité stable en un oscillateur biochimique. La régulation de la direction de mouvement chez M. xanthus pourrait donc constituer un cas émergent de couplage entre des régulateurs de type procaryotes et eucaryotes. / The bacterium Myxococcus xanthus forms multicellular structures called fruiting bodies to resist to starvation conditions. Fruiting body formation implies a chemosensory-like system, the Frz system which regulates directional changes through the simultaneous pole-to-pole relocalization of two motility systems, (A) and (S). During my PhD, I have worked on the connection between the Frz chemosensory-like system and the downstream regulators MglA and MglB in the control of polarity inversion. The cell polarity axis is established by (i) a Ras-like small G protein, MglA, which constitutes a branch node in the regulation of A and S motility systems at the leading cell pole, and (ii) its cognate inhibitor MglB that localizes at the lagging cell pole. We showed that MglA interacts directly and specifically with the cytoskeleton to promote assembly and disassembly of the A-motility machinery. Using an evolutionary approach, we elucidated the modular architecture of the Frz system and the implication of four regulatory domains to (i) connect the Frz system to the MglAB proteins, (ii) filter and (iii) amplify the signal. We now propose a mechanism for polarity inversion in which the independent action of two response regulators at each cell pole perturbs the interactions between a small-G-protein and its cognate inhibitor to trigger the conversion of a stable polarity axis into a biochemical oscillator. The regulation of directional movement in M. xanthus is an interesting emergent coupling between prokaryotes and eukaryotes regulators.

Acanthamoeba castellanii est une amibe libre ubiquiste de l'environnement. Elle se nourrit principalement de micro-organismes par phagocytose. Seulement, certains micro-organismes ont développé des mécanismes de résistances qui leur permettent d'échapper à la digestion et même de se multiplier à l'intérieur des amibes. C'est le cas de Legionella pneumophila, bactérie responsable de la légionellose. Legionella pneumophila, à travers son système de sécrétion Dot/Icm, injecte plusieurs effecteurs à l'intérieur de son hôte. Ces effecteurs interagissent avec les protéines de l'hôte, et induisent une modification de la physiologie de son hôte, à son avantage. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés aux effets de Legionella pneumophila, sur la prolifération de son hôte amibien. Nous avons montré que Legionella pneumophila arrête la prolifération d'Acanthamoeba castellanii. Ce phénotype était associé une modification de la forme, à une perte d'adhérence et à une baisse de motilité de l'amibe. Sur le plan moléculaire, Legionella pneumophila induit une baisse dans l'expression du gène cdc2b, qui présente des similarités avec le gène cdk1 (cyclin dépendant kinase), codant pour la CDK essentielle au déroulement du cycle cellulaire chez les mammifères. L'arrêt de la prolifération d'Acanthamoeba castellanii, qui passe par une réduction d'expression de cdc2b, est certainement induit par un ou plusieurs effecteur(s) de Legionella pneumophila, car le mutant ΔdotA de L. pneumophila, défectueux au niveau de l'appareil de sécrétion Dot/Icm, n'induit pas l'arrêt de la prolifération d'Acanthamoeba castellanii. / Acanthamoeba castellanii is an ubiquitous free-living amoeba of the environment. This amoeba feeds mainly on micro-organisms by phagocytosis. However, some micro-organisms have acquired resistances that allow them to escape digestion and even multiply inside amoebae. This is the case of Legionella pneumophila, the bacterium responsible for legionellosis. Legionella pneumophila, through its Dot/Icm secretion system, injects several effectors into its host. These effectors interact with the proteins of the host, and induce a modification of the physiology of its host, to its advantage. During my phD, we were interested in the effects of Legionella pneumophila infection on the proliferation of its amoebic host. We showed that Legionella pneumophila prevents the proliferation of Acanthamoeba castellanii. This phenotype was associated with a modification of the shape, a loss of adhesion and a decrease in motility of the amoeba. On the molecular level, Legionella pneumophila induces a decrease in the expression of the cdc2b gene, which share similarities with the cdk1 (cyclin dependent kinase) gene, coding for the major CDK of the mammalian cells cycle. The arrest of proliferation of Acanthamoeba castellanii, which involves a reduction in expression of cdc2b, is certainly induced by one or more effector(s) of Legionella pneumophila, because the mutant ΔdotA of L. pneumophila, defective in the Dot/Icm secretion apparatus, does not induce proliferation arrest of Acanthamoeba castellanii.

Cette thèse a pour objectif l’étude d’un lien effectif potentiel entre la motilité cellulaire, la mécanique cellulaire, et l’activité biochimique de ces mêmes cellules. Ce couplage a été étudié dans divers systèmes biologiques, et aussi bien dans des cultures de cellules qu’à l’intérieur de tissus plus complexes. Notamment, nous avons particulièrement cherché à détecter un couplage électromécanique dans des neurones qui pourrait être impliqué dans la propagation du message nerveux.Pour ce faire, nous avons dû développer deux microscopes optiques à la sensibilité extrême. Ces microscopes se composent de deux parties principales. La première sert à détecter des mouvements axiaux plus petits que la longueur d’onde optique, soit en dessous de 100 nanomètres. La deuxième partie permet la détection d’un signal de fluorescence, offrant la possibilité de suivre l’évolution biochimique de la cellule. Avec ces deux microscopes multimodaux, il est donc possible de suivre de manière simultanée un contraste de motilité, un contraste mécanique, un contraste structurel et un contraste biochimique. Si l’un de ces systèmes est basé sur la tomographie de cohérence optique plein champ et permet de faire de telles mesures en 3-D et en profondeur dans les tissus biologiques, le second ne permet que des mesures dans des cultures de cellules, mais est bien plus robuste au bruit mécanique. Dans ce manuscrit, nous allons essentiellement décrire le développement de ces deux appareils, et préciser les contrastes auxquels ils sont sensibles spécifiquement.Nous développerons également deux des applications principales de ces microscopes que nous avons étudié dans le détail au cours de cette thèse. La première application développe l’intérêt d’un de nos microscopes pour la détection sans marquage des principaux composants cellulaires et structuraux de la cornée et de la rétine. La seconde application tend à détecter et à suivre des ondes électromécaniques dans des neurones de mammifères / This PhD project aims to explore the relationship that might exist between the dynamic motility and mechanical behavior of different biological systems and their biochemical activity. In particular,we were interested in detecting the electromechanical coupling that may happen in active neurons, and may assist in the propagation of the action potential. With this goal in mind, we have developed two highly sensitive optical microscopes that combine one modality that detects sub-wavelength axial displacements using optical phase imaging and another modality that uses a fluorescence path. Therefore, these multimodal microscopes can combine a motility, a mechanical,a structural and a biochemical contrast at the same time. One of this system is based ona multimodal combination of full-field optical coherence tomography (FF-OCT) and allows the observation of such contrast inside thick and scattering biological tissues. The other setup provides a higher displacement sensitivity, but is limited to measurements in cell cultures. In this manuscript, we mainly discuss the development of both systems and describe the various contrastst hey can reveal. Finally, we have largely used our systems to investigate diverse functions of the eye and to look for electromechanical waves in cell cultures. The thorough description of both biological applications is also provided in the manuscript

Les protéines d’adhésions homophiles N-cadhérine jouent un rôle majeur dans le développement du cerveau, notamment en agissant sur la croissance et la plasticité synaptique. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle de la N-cadhérine dans ces deux processus en utilisant des neurones issus de cultures primaires déposés sur des substrats micropatternés. Ces substrats sont recouverts de N-cadhérine purifiée afin d’induire des adhésions N-cadhérines sélectives au niveau de micro-motifs régulièrement espacés. Mes deux premières études sont basées sur le modèle d’embrayage moléculaire, décrivant le processus par lequel la motilité du cytosquelette d’actine se couple aux adhésions au niveau de la membrane cellulaire afin de générer des forces de traction aux zones de contact avec le substrat, permettant ainsi l’avancée cellulaire (Giannone et al., 2009). Plusieurs études ont mis en avant l’existence d’un tel modèle (Mitchison et Kirschner, 1988 ; Suter et Forscher, 1998), cependant le mécanisme exact permettant d’expliquer ce couplage mécanique de l’actine aux protéines d’adhésions reste mal connu. Via des techniques de pinces optiques, des travaux précédemment menés dans l’équipe ont prouvé l’existence d’un couplage entre le flux d’actine et les adhésions N-cadhérine permettant la migration du cône de croissance (Bard et al., 2008). Cette technique n’a cependant pas permis la visualisation directe de l’engagement d’un tel mécanisme. Nous avons donc couplé l’utilisation des substrats micro-patternés à la microscopie haute résolution sptPALM/TIRF afin de visualiser directement la dynamique des protéines impliquées dans l’embrayage moléculaire. Dans le premier article, j’ai montré pour la première fois l’existence d’interactions transitoires entre le flux d’actine et les adhésions N-cadhérines au niveau du cône de croissance, reflétant un embrayage glissant à l’échelle de la molécule unique (Garcia et al., en préparation). Dans le second article, en travaillant sur des neurones plus matures, nous avons pu montrer l’engagement d’un embrayage moléculaire trans-synaptique entre adhésions N-cadhérines et flux d’actine permettant la stabilisation du filopode dendritique et ainsi sa transition en épine mature (Chazeau/Garcia et al., en préparation). J’ai également participé à une troisième étude dans laquelle j’ai observé l’effet des substrats micropatternés recouverts de N-cadhérine, sur la synaptogenèse. J’ai ainsi pu prouver que la N-cadhérine déposée sur les micro-motifs, stimule la croissance dendritique et axonale et joue un rôle prépondérant dans la maturation morphologique des neurones. Cependant, la N-cadhérine est incapable d’induire la formation de synapses contrairement aux protéines d’adhésion neurexine/neuroligine ou SynCam (Czöndör et al., 2013). / The homophilic adhesion molecule N-cadherin plays major roles in brain development, notably affecting axon outgrowth and synaptic plasticity. During my PhD work, I addressed the role of N-cadherin in these two processes, using primary neurons cultured on micro-patterned substrates. These substrates are coated with purified N-cadherin to trigger selective N-cadherin adhesions in a spatially controled manner. My two first studies are based on the “molecular clutch” paradigm, by which the actin motile machinery is coupled to adhesion at the cell membrane to generate forces on the substrate and allow cells to move forward (Giannone et al., 2009). Many publications have provided evidence for such a mechanism (Mitchison et Kirschner, 1988 ; Suter et Forscher, 1998), but the exact mechanisms underlying the molecular coupling between the actin retrograde flow and adhesion proteins remain elusive. The team previously inferred, using optical tweezers, that a molecular clutch between the actin flow and N-cadherin adhesions drives growth cone migration (Bard et al., 2008), but could not achieve a direct visualization of the engagement process with this technique. Here, we combined the use of micropattern substrates with high resolution microscopy sptPALM/TIRF to visualize directly the dynamics of the main proteins involved in the molecular clutch. In my first paper, I reveal for the first time transient interactions between the actin flow and N-cadherin adhesions in growth cones, reflecting a slipping clutch process at the individual molecular level (Garcia et al., in preparation). In a second study, working with more mature neurons, we revealed that engagement of a molecular clutch between trans-synaptic N-cadherin adhesions and the actin flow underlies the stabilization of dendritic filopodia into mature spines (Chazeau/Garcia et al., in preparation). I also participated to a third study, where I observed the effect of N-cadherin coated substrates on synaptogenesis. I showed that, although N-cadherin on micro-patterned substrates stimulated axonal and dendritic elongation and played a major role in morphological maturation, it was not able to induce synapse formation like neurexin/neuroligin or SynCAM adhesions (Czöndör et al., 2013).

La sclérose en plaques (SP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC) affectant plus de 2,5 millions de personnes dans le monde. Bien que son étiologie soit inconnue, de nombreuses données supportent la contribution des réponses immunitaires à la maladie. La présence de leucocytes au sein des lésions de démyélinisation est un marqueur neuropathologique de la SP. Les traitements actuels diminuent les exacerbations de la SP mais échouent à arrêter sa progression. Ainsi, il est essentiel d’identifier des nouvelles voies contribuant à la pathologie de la SP. NKG2D est un récepteur co-activateur de cellules effectrices qui participent à la surveillance immunitaire. Cependant, cette voie peut contribuer à l’inflammation et aux lésions tissulaires. Le blocage ou l’élimination du NKG2D réduit la gravité de la maladie dans des modèles animaux de SP. Dans la pathologie humaine, des lymphocytes T CD4+ et CD8+ NKG2D+ sont présents dans les lésions et élevés dans le sang périphérique des patients atteints de la forme cyclique de SP durant une poussée. Au moins un ligand du NKG2D (NKG2DL) est exprimé par des oligodendrocytes dans des lésions et les lymphocytes T CD8+ causent la mort in vitro des oligodendrocytes humains de façon NKG2D dépendante. On ignore encore si d’autres cellules neurales expriment des NKG2DL et sont susceptibles à la reconnaissance par le NKG2D. Dans cette thèse, nous avons investigué la contribution de la voie NKG2D à la pathologie de la SP. La première partie présente la caractérisation de l’expression des NKG2DL au sein du SNC. Nous avons trouvé des niveaux élevés de ULBP4, mais aucun autre ligand, dans les lésions et la matière blanche d’apparence normale chez des patients SP. Nous avons identifié des déclencheurs potentiels de l’expression de ULBP4 par les astrocytes. ULBP4 soluble est détecté dans le liquide céphalo-rachidien, et des essais fonctionnels ont démontré sa capacité à renforcer la sécrétion de cytokines inflammatoires par les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde partie, nous avons caractérisé les lymphocytes T exprimant NKG2D dans le sang de patients atteints des formes cycliques et progressives de la SP ainsi que chez des sujets témoins. Bien que nous ayons trouvé des proportions similaires, les lymphocytes T NKG2D+CD4+ de patients SP avaient un phénotype mémoire activé associé aux profils Th1 et Th1/Th17. Les lymphocytes T NKG2D+CD8+ étaient diminués chez les patients atteints de la forme cyclique. Cette population affichait une expression prédominante du granzyme B et manifestait des capacités de dégranulation envers les astrocytes exprimant ULBP4. Finalement, les analyses d’imagerie en temps réel ont révélé un rôle pour NKG2D et son ligand ULBP4 dans les interactions durables entre les astrocytes et les lymphocytes T CD8+ humains. Nos travaux identifient un nouveau mécanisme dans le dialogue entre ces types cellulaires. Globalement, ce projet de thèse présente une caractérisation en profondeur de la voie NKG2D dans la SP. De plus, il fournit de nouvelles preuves quant à l’implication de ULBP4 dans la pathophysiologie de la SP. De nouvelles investigations contribueront à élucider la validité de ULBP4 en tant que cible thérapeutique. / Multiple sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease of the central nervous system (CNS) that affects more than 2.5 million people worldwide. Despite its unknown etiology, numerous evidences point to aberrant immune responses that contribute to the typical tissue damage. Indeed, the presence of infiltrating immune cells within the characteristic focal demyelinating lesions is a pathological hallmark of MS. Current treatments, which target the immune system, generally control disease exacerbations, but have failed to stop progression. Therefore, it is essential to identify common immune pathways that contribute to MS pathology. NKG2D is a co-activating receptor of immune cells that plays a critical role in immune surveillance. Nevertheless, aberrant NKG2D-mediated responses can contribute to inflammation and tissue damage. Various studies have implicated the NKG2D pathway in MS. NKG2D blocking or depletion reduced disease severity in various EAE models, a commonly used animal model of MS. In the human pathology, NKG2D+CD4+ and CD8+ T lymphocytes have been found in MS lesions and are upregulated in the peripheral blood of RRMS patients under relapse. Moreover, at least one NKG2DL has been observed in oligodendrocytes from MS lesions, which were found near CD8+ T lymphocytes. Furthermore, in vitro studies have demonstrated NKG2D-dependent killing of human oligodendrocytes by CD8+ T lymphocytes. Whether other neural cells express NKG2DL and can thus be susceptible to NKG2D-mediated recognition was still unknown. In this thesis, we investigated further the contribution of the NKG2D pathway to the pathobiology of MS. The first part of this project consisted in the evaluation of NKG2DL expression within the CNS. We found upregulated levels of ULBP4, and no other NKG2DL, in MS lesions and normal appearing white matter from MS patients. Moreover, we identified potential triggers observed in MS lesions that could impact on ULBP4 expression. Soluble ULBP4 was also found in the cerebrospinal fluid, and functional assays demonstrated its capacity to boost inflammatory cytokines secretion by CD8+ T lymphocytes. In the second part, we performed a deep characterization of CD4+ and CD8+ T lymphocytes expressing NKG2D in blood samples from relapsing-remitting and progressive forms of MS as well as age and sex matched healthy controls. Despite finding similar proportions, NKG2D+CD4+ T lymphocytes from MS patients exhibited an activated memory phenotype associated with Th1 and Th1/Th17 responses. In contrast, NKG2D+CD8+ T lymphocytes were reduced in RRMS patients. This subset displayed a predominant granzyme B expression irrespective of the donors’ group, and exhibited degranulating capacities toward ULBP4-expressing astrocytes. Finally, live imaging analysis revealed a role for NKG2D and its ligand ULBP4 in the establishment of long-lasting interaction between astrocytes and CD8+ T lymphocytes. This provides a new mechanism involved in the dialogue between these cell types. Overall, this thesis project provides a deep characterization of the NKG2D pathway in relapsing-remitting and progressive MS patients. Moreover, it provides new evidence for the involvement of ULBP4, a specific NKG2DL, in the pathophysiology of MS. Further investigations will contribute to elucidate the validity of ULBP4 as a therapeutic target in MS.

La microscopie optique chez les animaux vivants est un outil de recherche prometteur pour l’avancement de la neurobiologie. L’imagerie intravitale offre un aperçu en direct de la réponse des cellules individuelles aux dommages affectant le système nerveux. Combinée à la vaste gamme de souris transgéniques disponibles commercialement et compatibles avec différents modèles animaux de maladies neurodégénératives, la microscopie in vivo favorise la compréhension du déroulement des pathologies et du fonctionnement des thérapies. Il est capital de travailler à l’émergence de cet outil, qui se présente comme une stratégie dotée d’un énorme potentiel. Le projet de doctorat décrit dans cette thèse porte donc sur le développement et l’utilisation d’une plateforme de microscopie quantitative, multimodale et non linéaire pour l’imagerie de la moelle épinière chez les animaux vivants. Premièrement, nous avons enrayé la dépendance en polarisation de l’intensité du signal de diffusion Raman cohérente (CARS, « coherent anti-Stokes Raman scattering »), de façon à adapter les images à l’interprétation histologique. Nous avons appliqué cette technique afin d’étudier l’histologie de la myéline de la moelle épinière du rat. En second lieu, nous avons proposé une nouvelle procédure d’analyse d’images compatible avec l’imagerie d’animaux vivants, dans le but de faire de l’histologie des axones myélinisés. Nous avons alors quantifié, dans un modèle de blessure par écrasement d’un nerf, la démyélinisation proximale et la remyélinisation distale au site de lésion ex vivo et in vivo respectivement. Troisièmement, nous montrons que l’imagerie de CARS de la moelle épinière de souris vivantes peut être réalisée avec un microendoscope, et ce tout en conservant sa compatibilité avec le signal de fluorescence par excitation à deux photons. Finalement, nous discutons d’une stratégie de traitement numérique d’images pour réduire les artefacts reliés au mouvement de l’animal. Cette technique permet l’étude histologique de la myéline et la quantification de la motilité des cellules microgliales dans leur environnement natif. En définitive, cette thèse démontre que la microscopie de CARS in vivo progresse peu à peu vers un outil grand public en neurobiologie. / Optical microscopy in living animals is a promising research tool for the evolution of neurobiology. Intravital imaging offers a live preview of how individual cells respond to the nervous system damages. Applying in vivo microscopy to a panoply of transgenic mice used with different animal models of neurodegenerative diseases promotes the understanding of the progress of pathologies and the comprehension of how therapies work. It is thus essential to promote the emergence of optical microscopy technologies in living animals because it is a strategy with great potential. Therefore, the project described in this doctoral thesis focuses on the development and use of a microscopy platform for quantitative, multimodal and nonlinear imaging of the spinal cord in living animals. First, we alleviated the polarization dependence of the coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) signal intensity. This strategy makes images more amenable to histological interpretation. With this technique, we studied the histology of myelin in the rat spinal cord. Secondly, we proposed a new image analysis procedure compatible with live animals imaging in order to achieve the histology of myelinated axons. We quantified the demyelination proximal, and remyelination distal to the crush site ex vivo and in vivo respectively. Third, we showed that CARS imaging of the spinal cord in living mice can be achieved with a microendoscope, and this while maintaining compatibility with the two-photon excitation fluorescence signal. Finally, we discuss a digital image processing strategy that reduces imaging artifacts related to movement of the animal. This technique allows the histological study of myelin and the quantification of the motility of microglial cells in their native environment. Ultimately, this thesis demonstrates that in vivo CARS microscopy progresses gradually towards a robust tool for research in neurobiology.

Les maladies à expansion de polyglutamine sont un ensemble de troubles neurodégénératives héréditaires se développant lorsqu’il y a répétitions de trinucléotides CAG dans les gènes causatifs au-delà d’un certain seuil. L’expansion des répétitions de trinucléotides CAG entraîne des désordres neurologiques héréditaires précoces, dont de multiples formes d’ataxie spinocérébelleuse (SCA). Parmi celles-ci, le type le plus commun et dominant est l’ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3), aussi connue sous le nom de la maladie de Machado-Joseph (MMJ). Ce dernier est un désordre neurologique progressif autosomique dominant. Le gène causatif de MMJ est ATXN3 (ATAXINE-3). Plusieurs études récentes suggèrent une association entre ce gène et la modulation du stress du réticulum endoplasmique (RE). Lors de ce travail de maîtrise, des souches transgéniques de C. elegans exprimant les formes sauvage et mutante du gène ATXN3 humain ont été générées. Les résultats suggèrent des phénotypes importants chez la souche transgénique mutante associés à la pathologie humaine: défaut de motilité, longévité réduite et profil neurodégénératif considérable. Ceci dit, ces résultats nous ont poussé à vouloir déterminer si l’utilisation des composés chimiques, connus en tant que modulateurs du stress du RE et possédant des rôles neuroprotecteurs, sont capables de restaurer les phénotypes notés. Les composés utilisés, c’est-à-dire le Bleu de Méthylène, le Salubrinal et le Guanabenz, ont démontré une capacité de corriger les phénotypes rapportés dans la souche transgénique mutante. De plus, ces composés ont aussi été en mesure de prévenir une augmentation du niveau du stress oxydatif et de la réponse au stress du RE exhibé chez les vers mutants. Par le développement de nouveaux modèles C. elegans pour la MMJ, où il y a expression du gène ATXN3 complet dans les motoneurones, il a été possible de trouver qu’une modulation chimique du stress du RE peut réduire considérablement la neurodégénérescence et par conséquent, être une possible nouvelle approche thérapeutique pour traiter cette pathologie. / Polyglutamine expansion diseases are a class of dominantly inherited neurodegenerative disorders that develop when a CAG repeat in the causative genes is unstably expanded above a certain threshold. The expansion of trinucleotide CAG repeats causes hereditary adult-onset neurodegenerative disorders such as multiple forms of spinocerebellar ataxia (SCA). The most common dominantly inherited spinocerebellar ataxia is the type 3 (SCA3) also known as Machado-Joseph disease (MJD), an autosomal dominant, progressive neurological disorder. The gene causing MJD is ATXN3 (ATAXIN-3): MJD is caused by an abnormal CAG trinucleotide repeat expansion in the ATXN3 gene. Several recent studies have shown that this gene is associated with endoplasmic reticulum (ER) stress. In this study, we generated transgenic C. elegans strains expressing wild type or mutant human ATXN3 genes and tested them for recovery of locomotor phenotype, lifespan and neurodegeneration phenotypes upon treatment with compounds known to modulate ER stress and having neuroprotective roles. We observed differences between both transgenic lines and found that the motility defects, the reduced lifespan and the neurodegeneration can be rescued by methylene blue, guanabenz and salubrinal. These compounds were also able to prevent the oxidative stress and the ER stress response induced by mutant transgenic worms. We introduce novel C. elegans models for MJD based on the expression of full-length ATXN3 in GABAergic motor neurons. Using these models we discovered that chemical modulation of the ER unfolded protein response reduced neurodegeneration and could be a new therapeutic approach for the treatment of MJD.