Lorsqu'une tumeur grossit, elle exerce une pression sur les tissus environnants et est comprimée en retour. Des expériences sur un modèle de tumeur in vitro, appelé sphéroïde, ont montré que cette pression influence largement le devenir du tissu cancéreux, notamment en freinant sa croissance, mais aussi en le rendant plus invasif. Pour mieux comprendre ce dernier effet, nous avons cherché à étudier le comportement migratoire des cellules à l'intérieur d'un sphéroïde sous pression. Observer l'intérieur d'un sphéroïde pose cependant un problème technique car les méthodes usuelles d'imagerie ne sont pas utilisables dans des tissus épais (> 100 μm). L'imagerie classique étant limitée en profondeur à cause de la diffusion de la lumière, nous nous sommes tournés vers une méthode qui utilise justement celle-ci : la diffusion dynamique de lumière ou DLS (Dynamic Light Scattering). Nous avons développé son application à la migration cellulaire, afin d'obtenir la distribution des déplacements relatifs des cellules au cours du temps. Cette mesure est faite sans utiliser de marqueurs spécifiques et est applicable à des sphéroïdes allant jusqu'à 400 μm de diamètre. Nous avons ainsi mis en évidence une organisation radiale du sphéroïde en termes de mobilité, avec des cellules rapides en surface et plus lentes au centre. Nous avons aussi montré qu'en appliquant une contrainte au sphéroïde, la vitesse moyenne diminue jusqu'à être réduite de moitié pour des pressions supérieures à 15kPa. Une autre équipe a mesuré par ailleurs une augmentation de la vitesse des cellules en surface suite à une compression, ce qui indique que l'organisation radiale se retrouve dans la réponse à la pression. Nous avons montré que cette sensibilité à la pression est une propriété qui émerge de l'organisation 3D du tissu, dans laquelle la matrice extracellulaire joue un rôle primordial. Enfin, pour explorer les possibilités qu'offre notre technique, nous l'avons appliquée à une autre question : comment la migration des macrophages est-elle affectée par les signaux provenant de cellules apoptotiques ? Les résultats ont montré que les cellules apoptotiques précoces augmentent la vitesse des macrophages tandis que les cellules apoptotiques tardives la réduisent. D'un cas à l'autre, la longueur de persistance du mouvement est conservée. / As a tumor grows, it exerts a mechanical pressure on its surrounding tissue and is compressed back as a reaction. Recent experiments on an in vitro tumor model, called spheroid, have shown that this pressure is crucial for the fate of the cancerous tissue. In particular, the pressure slows down its growth, but makes it more invasive. To further understand the latter effect, we decided to study the migration of cells inside spheroids under pressure. However, imaging the inside of a spheroid is technically challenging as usual microscopy methods do not work on thick tissues (> 100 μm). Standard imaging methods are limited in terms of depth penetration because of light scattering. For this reason, we decided to take advantage of this scattered light with a method called Dynamic Light Scattering (DLS). We developed its application to cell migration in order to measure the distribution of cells displacements over time. The measurement is label-free and works with spheroids as thick as 400 μm in diameter. By this means, we revealed a radial organization inside the spheroid in terms of mobility, with fast cells at the surface and slower cells in the core. We also showed that applying a pressure onto spheroids decreases the average cell speed by a factor up to two for pressure greater than 15 kPa. Another team reported an increase in the speed of cells located at the surface of a compressed spheroid, which implies that the radial organization is also true for the impact of pressure. We demonstrated that this sensitivity to an external pressure is a 3D emergent property, in which the extracellular matrix plays an essential role. Finally, we explored the potential of our technique by addressing another question: how do apoptotic cells signals affect the migration of macrophages? We found that early apoptotic cells increase the speed of macrophages whereas late apoptotic cells decrease it. In both cases, the persistence length of the motion is the same.

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (ADKP) est l’une des tumeurs solides avec le pronostic le plus sombre. Le stroma de ces tumeurs, très abondant, est composé de matrice extra cellulaire ainsi que de cellules stromales (incluant des fibroblastes activés associés au cancer ou des cellules immunitaires). Les fibres nerveuses infiltrant ce stroma tumoral sont considérées comme une caractéristique des ADKP, impliquées dans le phénomène de remodelage nerveux, qui participent aux douleurs neuropathiques, à la dissémination des cellules tumorales, ainsi qu’à la rechute de la maladie après chirurgie. Le remodelage nerveux associé aux ADKP est régulé par un réseau fonctionnel, impliquant des interactions physiques et moléculaires entre cellules tumorales, cellules nerveuses dont les cellules de Schwann et les autres cellules stromales. Dans cette étude, nous avons démontré que les cellules de Schwann (cellules gliales, soutient des neurones périphériques) stimulent l’agressivité (migration, invasion, tumorigénicité) des cellules pancréatiques tumorales de façon dépendante du TGFβ (Transforming Growth Factor beta). En effet, nous révélons que le milieu conditionné des cellules de Schwann est enrichi en nombreuses molécules de signalisation, incluant de grandes quantités de TGFβ capable d’activer sa voie de signalisation dépendante des protéines SMAD, au sein des cellules cancéreuses. Des analyses de spectrométrie de masse des sécrétomes des cellules de Schwann et des cellules tumorales pancréatiques, cultivées seules ou ensemble, soulignent le rôle central du TGFβ dans les interactions neuro-épithéliales, comme illustré par la signature protéomique relative aux mécanismes d’adhésion et de motilité cellulaires. Ainsi, ces résultats démontrent que les cellules de Schwann sont une source de TGFβ dans les ADKP, et jouent un rôle crucial dans l’acquisition de propriétés agressives par les cellules tumorales / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the solid tumors with the poorest prognosis. The stroma of this tumor is abundant and composed of extracellular matrix and stromal cells (including cancer-associated fibroblasts and immune cells). Nerve fibers invading this stroma represent a hallmark of PDAC, involved in neural remodeling, which participates in neuropathic pain, cancer cells dissemination and tumor relapse after surgery. Pancreatic cancer-associated neural remodeling is regulated through functional interplays mediated by physical and molecular interactions between cancer cells, nerve cells and surrounding Schwann cells, and other stromal cells. In the present study, we show that Schwann cells (glial cells supporting peripheral neurons) can enhance aggressiveness (migration, invasion, tumorigenicity) of pancreatic cancer cells in a transforming growth factor beta (TGFβ)-dependent manner. Indeed, we reveal that conditioned medium from Schwann cells contains various signaling cues, including high amounts of TGFβ able to activate the TGFβ-SMAD signaling pathway in cancer cells. Secretome analyses by mass spectrometry of Schwann cells and pancreatic cancer cells cultured alone or in combination highlighted the central role of TGFβ in neuro-epithelial interactions, as illustrated by proteomic signatures related to cell adhesion and motility. Altogether, these results demonstrate that Schwann cells are a meaningful source of TGFβ in PDAC, which plays a crucial role in the acquisition of aggressive properties by pancreatic cancer cells

L'exercice de forces est indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus cellulaires. Chez les eucaryotes, une majorité de ces phénomènes motiles est assurée par la polymérisation et la dépolymérisation spatialement et temporellement contrôlée du cytosquelette d'actine. Le cytosquelette est composé de microfilaments d'actine qui s'associent en structures complexes aux propriétés mécaniques particulières. Au cours des dix dernières années, beaucoup d'efforts ont été menés pour comprendre la dynamique des réseaux branchés de filaments d'actine initiés par le complexe Arp2/3. En revanche, peu de choses sont connues à propos de la dynamique de formation et de désassemblage des câbles de filaments d'actine. Récemment, il fut montré que les formines représentent une famille de protéines essentielles à l'initiation de ces structures.<br />Cette thèse résume dans un premier temps le travail accompli pour comprendre le mécanisme d'action des formines à l'échelle moléculaire. La plupart des formines sont des nucléateurs processifs, c'est-à-dire qu'ils permettent la formation et l'élongation de nouveaux filaments d'actine, tout en restant liées à l'extrémité du filament qui polymérise. Nous avons montré par la technique originale de microscopie à onde évanescente que Arabidopsis Thaliana FORMIN1 représente un nouveau type de formine, qui se déplace sur le côté des filaments d'actine après les avoir formés. Depuis le côté d'un filament préexistant, FORMIN1 est capable de nucléer un autre filament, initiant la formation de câbles de filaments d'actine. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse au mécanisme moléculaire mis en jeu par l'ADF/cofiline pour accélérer la dynamique d'assemblage/désassemblage des filaments d'actine, et traite pour la première fois de la dynamique de l'actine en temps réel à l'échelle du filament individuel ou à l'intérieur de structures organisées de filaments d'actine.

La thèse concerne l'étude des déformations cellulaires à travers 2 approches complémentaires, expérimentale et théorique. motivées par la mise en évidence lors de travaux antérieurs, de l'existence d'une certaine auto-organisation des schémas des déformations membranaires pour des cellules arrondies. Nous avons choisi de nous intéresser ici au cas de fibroblastes L929 qui présentent une organisation plus complexe du cytosquelette. La caractérisation expérimentale a été réalisée à partir de séquences d'images vidéomicroscopiques. Les données morphodynamiques des cellules ont été extraites des séquences par 2 méthodes : (i) une segmentation des contours et (ii) une méthode de flot optique. Les résultats montrent que les cellules présentent le plus souvent des morphologies symétriques caractérisées dynamiquement par un mouvement pulsant synchronisé et périodique. Sur le plan théorique, nous nous sommes intéressés à un modèle cytomécanique des déformations décrivant la dynamique de poly/dépolymérisation de l'actine en relation avec les interactions mécaniques entre la membrane et le cytosquelette. Les simulations montrent la capacité du modèle à générer qualitativement des états pulsants tels qu'observés. Deux extensions du modèle ont alors été proposées pour prendre en compte : (i) l'interaction cellule-cellule caractérisée par l'inhibition de l'activité protrusive et (ii) la migration cellulaire par chimiotaxie, en agissant dans les 2 cas sur les propriétés mécaniques de la membrane et du cortex. Des comportements cellulaires réalistes ont ainsi pu être simulés. Finalement, une nouvelle formulation du modèle initial a été proposée pour modéliser les longs prolongements membranaires des fibroblastes. Le travail réalisé permet en particulier de proposer la possibilité d'utiliser les paramètres morphodynamiques comme critères d'identification des phénotypes cellulaires.

Cette thèse de doctorat mène une réflexion sur les mobilités juvéniles périurbaines sous l’angle de « l’entre-deux », terme caractérisant à la fois les espaces périurbains et la jeunesse. Comment la jeunesse vit-elle une localisation résidentielle, choisie par les parents, et se déplace-t-elle dans ces espaces peu densément peuplés et faiblement desservis par des transports en commun ? Quel rôle jouent les contextes périurbains dans la construction identitaire des jeunes ? L’étude menée, à partir de trois lycées généraux et technologiques situés dans les franges de l’agglomération parisienne en proie à un mouvement de périurbanisation plus ou moins ancien, a consisté à interroger une population lycéenne périurbaine par le biais de méthodes qualitatives (85 entretiens) et quantitatives (1522 sondés en ligne). Développant un ancrage différencié à l’espace habité dans lequel la maison individuelle tient une place centrale, les jeunes adoptent une multitude de stratégies pour s’émanciper des contextes périurbains. Ils combinent les ressources des entre-deux pour s’affirmer en tant qu’individu, y compris dans le cadre de la socialisation secondaire marquant cet âge. Ils y trouvent ainsi leur bonheur, bien qu’ils cherchent souvent, de manière plus ou moins réaliste ou réalisable, à sortir de ces espaces. Ces bricolages spatiaux les amènent à développer une motilité (Kaufmann, 2002) plus importante que celle des jeunes urbains. En revanche, à l’heure de s’inventer une vie adulte, ce n’est pas tant l’espace périurbain qui apparaît comme un obstacle à leur projet que les ressources sociales, financières ou culturelles de leur famille. Malgré tout, les contextes périurbains, parce qu’ils font territoires, sont des lieux où les jeunes projettent volontiers leur vie future, même si, pour certains, l’attraction urbaine ou de l’étranger est plus forte. / The ‘‘space-in-between’’ refers to any specified situation or space characterizing an intermediary and transitional state. This paper aims at exploring the notion of “space-in-between” through the themes of mobility and the youth living in the periurban fringes of the Great Paris. How does the youth live the residential choice of theirs parents and move to those median zone between rural and urban areas where public transit is deficient? What role have the periurban fringes in the building of the youth identity? Across this research, led in three public high schools located in the periurban fringes of the Great Paris, 85 young spoke about their mobilities and 1522 answered a questionnaire. Become oneself ask to move alone, to explore new spaces without parents but with peers, so these young people combine a lot of means to leave these spaces (walking, hitch-hiking, car-sharing, taking school buses for shopping and so on). Developing a specific link with the periurban areas where the home could be perceived as a special place, these young people live happily and do not consider themselves as ‘‘prisoners’’ in their territories. Nevertheless, they try to going out of them: going to parties, meeting other young people in the night clubs, meeting their friends as they want, practising sport and cultural leisures, and moving anywhere without asking their parents to drive them. At the time to become an adult, when they want to follow high education currucula, if they don’t choose the same way that urban and rural students, it seems that financial ressources and capacities to move are central in their choice. Some of them want to live in big cities or in foreign countries but most of them imagine them living the perurban edges where they had grow up. So the periurban fringes seem, as territories, the ‘place to be’! / El « espacio de transición » es una situación o un espacio que se caracteriza por ser intermedio.Aquella idea de intermedio interesa a los geografos en sus investigaciones sobre el espacio periurbano. Este proyecto , como continuidad de un precedente trabajo de investigaciones (Ser joven en el periurbano de SENS. ¿ Qué movilidades para los alumnos del instituto JANOT ? ; Catherine DIDIER-FEVRE, Máster 2 investigaciones, 2011. 229 páginas), intenta explorar la noción de « transición » a través de las movilidades. Si el término periurbano se define por un espacio de transición (noción aparecida con la instalación de la población en una extensión de la zona urbana) entre dos contrapuestos : espacio urbano y espacio rural, el de la juventud responde también a la noción de « espacio de transición ». En efecto, la juventud es la transición entre la desaparición de las claves de la infancia y la construcción de nuevos modelos. Es un tiempo de experiencias.Mientras « el periurbano sigue siendo el espacio de la juventud en una sociedad envejeciéndose : es el único espacio donde encontramos más de 3 jóvenes para con 2 mayores», muy pocas cosas fueron escritas sobre la juventud del periurbano. Aquella idea de las movilidades de la juventud es nueva. Tener en cuenta la edad de los habitantes de un espacio definido es fundamental para entender las relaciones de ellos con su territorio. Hasta ahora sólo los mayores o los niños pequeños preocuparon a los geografos del periurbano. Al investigar sobre los jóvenes del periurbano una se pregunta :¿Qué relaciones viven los jóvenes con el territorio periurbano al vivir una movilidad singular ?

L'expression des gènes peut être contrôlée à différents niveaux : transcriptionnel post-transcriptionnel, traductionnel et post­-traductionnel. A ce jour la majorité des études se sont concentrées au niveau transcriptionnel, néanmoins l'importance des mécanismes de régulation post-transcriptionnels se fait de plus en plus évidente. Chez les procaryotes cette régulation post-transcriptionnelle est assurée par les ARN régulateurs dont le mécanisme d'action passe par l'interaction directe avec les ARN messagers ou les protéines. Grâce à l'essor des analyses transcriptomiques haut-débit (RNA-seq), l'identification de ces ARN est devenue accessible, en revanche leur caractérisation fonctionnelle demeure toujours un défi. Nous avons identifié de nombreux ARN régulateurs candidats chez Agrobacterium fabrum C58 (anciennement Agrobacterium tumefaciens C58). Cette bactérie commune du sol devient phytopathogène lorsqu'elle porte le plasmide Ti (pour Tumor inducing). Elle est alors responsable de la maladie dite de la galle du collet qui se traduit par la formation de tumeurs chez les plantes. Ces travaux de thèse ont eu pour objectif de caractériser fonctionnellement des ARN régulateurs présent sur le plasmide Ti. Deux candidats ont été étudiés en combinant prédiction de cibles et analyses phénotypiques. Le premier, nommé RNA1111, a été caractérisé tant que régulateur de la virulence. Quant au deuxième, nommé QfsR, nous avons démontré qu'il régulait des gènes responsables du transfert conjugatif du plasmide Ti et de la production du signal de quorum sensing associé, mais également des gènes chromosomiques responsables de la motilité et de la production de succinoglycane. En utilisant un système rapporteur, nous avons également démontré que QfsR agissait via une interaction directe avec les ARN messagers des gènes cibles. QfsR représente le premier exemple d'ARN régulateur plasmidique régulant des cibles chromosomiques. L'existence d'un tel régulateur chez un plasmide présent transitoirement au sein des populations d'Agrobacterium illustre le dialogue entre plasmide et chromosome / Gene expression can be controlled at different levels: transcriptional, post-transcriptional, translational and post-translational. To date, the majority of studies have been concentrated on the transcriptional level, but the importance of post-transcriptional regulation mechanisms is becoming more and more evident. In prokaryotes this post-transcriptional regulation is ensured by regulatory RNAs whose mechanism of action passes through direct interaction with messenger RNAs or proteins. With development of high-throughput transcriptomic analyzes (RNA-seq), the identification of these RNAs has become accessible, but their functional characterization remains challenging. We have identified many candidate regulatory RNAs in Agrobacterium fabrum C58 (formerly Agrobacterium tumefaciens C58). This common bacterium of the soil becomes phytopathogenic when carrying the plasmid Ti (for Tumor inducing). It is then responsible for the so-called grown gall disease which results in the formation of tumors in plants. The objective of this thesis was to characterize functionally regulatory RNAs present on the Ti plasmid. Two candidates were studied by combining target prediction and phenotypic analysis. The first, named RNA1111, was characterized as a regulator of virulence. As for the second, named QfsR, we demonstrated that it regulates genes responsible for the conjugative transfer of the Ti plasmid and the production of the associated quorum sensing signal, as well as chromosomal genes responsible for the motility and succinoglycan production. Using a reporter system, we also demonstrated that QfsR was acting via direct interaction with the messenger RNAs of the target genes. QfsR represents the first example of plasmid regulatory RNA regulating chromosomal targets. The existence of such a regulator in a plasmid transiently present in the populations of Agrobacterium illustrates the dialogue between the plasmid and the chromosome

La phophomannose isomérase de type I (PMI), une métalloenzyme à zinc, et la phosphoglucose isomérase (PGI), catalysent l’isomérisation réversible du β-D-fructose-6-phosphate (F6P), respectivement en β-D-mannose-6-phosphate (M6P) et en α-D-glucose-6-phosphate (G6P). Ces deux enzymes sont des cibles thérapeutiques potentielles. La phosphoglucose isomérase humaine (hPGI), connu également sous le nom de facteur de motilité autocrine (AMF), stimule, en plus de son activité glycolytique intracellulaire, la migration des cellules in vitro et le développement de métastases in vivo. D'autre part, Candida albicans est la principale levure impliquée en pathologie humaine. Ces dernières années, un problème de résistance du germe aux antifongiques classiques est apparu. En conséquence, la recherche se dirige vers de nouvelles cibles thérapeutiques, dont la PMI de C. albicans (CaPMI) qui joue un rôle important dans la biosynthèse de structures mannosylées nécessaires à la survie du pathogène. Les réactions catalysées par ces deux enzymes mettent en jeu le même intermédiaire de haute énergie (IHE) de type 1,2-cis-ènediolate, sauf qu’il est coordiné au zinc dans le cas de la PMI. La surexpression ainsi que la purification de CaPMI et de hPGI ont été réalisées au laboratoire. Une petite chimiothèque a été créée à partir du 5-phospho-D-arabinono-1,4-lactone (5-PAL) en modulant la partie tête de l’IHE. Un groupe chélatant du zinc (zinc binding group, ZBG) a été introduit dans plusieurs composés dans le but d’inhiber sélectivement CaPMI. De plus, deux composés possédant en partie tête une fonction amine terminale ont été synthétisés pour inhiber spécifiquement la PGI humaine en ciblant un résidu glutamate du site actif de l'enzyme (Glu357). Toutes ces molécules ont d’abord été testées sur la PGI du muscle de lapin et la PMI de E. coli commerciales, et par la suite sur la CaPMI et la hPGI surexprimées. Une série de bons voire très bons inhibiteurs de hPGI, et donc potentiellement anti-métastatiques, a été découverte. Ces composés ne sont cependant pas inhibiteurs de la CaPMI. Deux structures tridimensionnelles à haute résolution de complexes enzyme-inhibiteur ont été obtenues. Au delà des aspects thérapeutiques, mécanistiques et structuraux, un biocapteur électrochimique à base d'un des inhibiteurs synthétisés a été réalisé pour la détection de hPGI qui est un biomarqueur validé de cancers métastatiques. Ce biocapteur a démontré une limite de détection de 43 fM dans du tampon phosphate (PBS). / Phosphoglucose isomerase (PGI) and type I phosphomannose isomerase (PMI), a zinc metalloenzyme, catalyze the reversible isomerization of β-D-fructose 6-phosphate (F6P) to α-D-glucose 6-phosphate (G6P) and β-D-mannose 6-phosphate (M6P), respectively. These two enzymes are potential therapeutic targets. Human PGI (hPGI) often called as AMF-PGI (autocrine motility factor-PGI), in addition to its intracellular glycolytic activity, stimulates cell migration in vitro and metastasis in vivo. Inhibition of its extracellular activity is obviously interesting in oncology. On the other hand, Candida albicans is the main yeast involved in human pathology. During recent years, resistance of this pathogenic fungus to conventional antifungal drugs appeared. Consequently, research is moving towards new therapeutic targets, including C. albicans PMI (CaPMI) that plays an important role in the biosynthesis of mannosylated structures required for pathogen survival. The reactions catalyzed by these two enzymes involve the same high energy intermediate (HEI) type 1,2-cis-enediolate, except that it is coordinated to the zinc active site in the case of PMI. Overexpression and purification of both CaPMI and hPGI were performed in our laboratory. A small chemical library was created from the synthon 5-phospho-D-arabinono-1,4-lactone (5-PAL) by modulating the head part of the HEI. A zinc binding group (ZBG) was introduced in several compounds in order to selectively inhibit the CaPMI enzyme. Moreover, two compounds with a terminal amine function were designed to selectively inhibit hPGI by targeting a glutamate residue of the enzyme (Glu357). All these molecules were first tested on rabbit muscle PGI and PMI from E. coli, and later on CaPMI and hPGI. None of these compounds are good inhibitors of CaPMI. However, a series of strong inhibitors of hPGI, and therefore potentially anti-metastatic drugs, was discovered. High-resolved 3D structures of the two enzymes complexed with inhibitors have been successfully obtained. Beyond the therapeutic, mechanistic and structural aspects, an electrochemical biosensor based on one of the synthesized inhibitors was carried out for the detection of hPGI, which is a validated biomarker of metastatic cancers. This biosensor demonstrated a detection limit of 43 fM in phosphate buffer (PBS).

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurodégénérative du système nerveux central (SNC) caractérisée par une démyélinisation, une perte axonale, une activation des cellules gliales et une accumulation de cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral. Les lymphocytes T (LT) jouent un rôle clé dans la mise en place d’un tel environnement neuroinflammatoire. Notre compréhension des mécanismes impliqués dans le dialogue entre les LT et les astrocytes reste cependant incomplète. Les astrocytes représentent les premières cellules que rencontrent les LT lors de leur migration dans le parenchyme cérébral. Cette interaction est essentielle et peut être modulée par différents processus inflammatoires. Afin d’étudier comment l’inflammation modifie la rencontre des LT avec les cellules neurales, nous avons développé un modèle de co-culture de cellules neurales primaires humaines et de LT CD8+ humains permettant la visualisation de ces interactions par la microscopie en temps réel. Le suivi vidéo des LT a permis de montrer que la réponse des astrocytes et des neurones à la cytokine pro-inflammatoire IL-1β augmente la motilité des LT. L’analyse visuelle appuyée par une analyse statistique de différents paramètres spatiotemporels a montré que les LT adoptent des comportements différents associés à des interactions stables de type synapse ou dynamiques de type kinapse. Nous avons montré que l’inflammation des astrocytes affecte la dynamique de certains comportements et que l’expression des molécules du CMH de classe I par les astrocytes contribue à la mise en place des comportements de type synapse. Parmi les cytokines impliquées dans la physiopathologie de la SEP, l’interleukine-27 (IL-27) semble être associée à des effets bénéfiques en modulant l’activité des cellules immunitaires périphériques. Notre équipe a démontré que dans le cerveau des patients atteints de la SEP, des niveaux élevés d’IL-27 sont observés ainsi que la présence de son récepteur (IL-27R) sur des astrocytes et des lymphocytes T infiltrants. Afin d’évaluer l’impact de l’IL-27 sur les astrocytes humains, nous avons réalisé une analyse transcriptomique des astrocytes exposés à l’IL-27. Les astrocytes exposés à l’IL-27 augmentent l’expression de gènes impliqués dans la modulation de la réponse inflammatoire. La co-culture de ces cellules gliales avec des LT CD4+ et CD8+ a démontré que les astrocytes exposés à l’IL-27 modifient l’expression de facteurs de transcription impliqués dans la polarisation des LT, ainsi que l’expression de molécules impliquées dans la réponse immunitaire. Enfin, l’utilisation de notre modèle de microscopie sur cellules vivantes a révélé que les astrocytes exposés à l’IL-27 augmentent la motilité des LT CD8+ provenant de patients atteints de la SEP et de donneurs sains, mais que les LT provenant des patients présentent une motilité accrue comparés aux LT de donneurs sains. En conclusion, nos résultats fournissent de nouveaux éléments permettant de mieux comprendre l’interaction des LT avec des astrocytes et des neurones humains. Ces résultats soulignent l’importance de la réponse des astrocytes à différentes cytokines et leur implication dans la modulation de la réponse des LT dans des conditions physiologiques et pathologiques comme la SEP. / Multiple sclerosis (MS) is a neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS) characterized by an important demyelination, axonal loss, glial activation and accumulation of immune cells in the brain parenchyma. Among immune infiltrating cells, T lymphocytes are key players of the neuroinflammatory processes observed in MS. Our understanding of the dialogue between T lymphocytes and astrocytes in this context of neuroinflammation is still incomplete. Upon their entry in the CNS, T lymphocytes come into close contact with astrocytes. This physical and molecular interaction can be modulated by the inflammatory context. In order to study how inflammatory context affects the interactions of human T lymphocytes with human neural cells, we have developed a co-culture model allowing the visualization of T lymphocytes interacting with primary human astrocytes and neurons using time lapse microscopy. Individual T lymphocyte tracking showed that astrocytes and neurons exposed to the pro-inflammatory cytokine IL-1β increase T lymphocyte motility. Visual interpretation supported by statistical analysis of T lymphocytes spatio-temporal variables allowed us to identify four different behaviors that can be associated to stable synapse-like interactions or dynamic kinapse-like interactions. Finally, we showed that inflammation of astrocytes specifically affects T cell behaviors and that MHC class I expression by inflamed astrocytes is implicated in synapse-like behaviors. Among the cytokines implicated in MS physiopathology, the interleukine-27 (IL-27) has been associated with beneficial effects by modulating peripheral immune cell activity. Our group has shown that IL-27 is elevated in the brain of MS patients and that both astrocytes and infiltrating T lymphocytes express the receptor of IL-27. To evaluate the impact of IL-27 on human astrocytes, we analyzed gene and protein expression of astrocytes exposed to IL-27. We found that most of the IL-27-induced differentially expressed genes in astrocytes are involved in immune responses and immune modulation. Moreover, IL-27-exposed astrocytes when co-cultured with CD4+ and CD8+ T lymphocytes specifically induce the expression of transcriptional factors involved in T lymphocytes polarization and surface molecules that can actively modulate immune processes. Finally, using our live imaging co-culture model, we showed that IL-27-treated astrocytes increase the motility of CD8+ T lymphocytes from healthy donors and MS patients. Notably, T lymphocytes form MS patients have an increased motility compared with those from healthy donors after contact with IL-27-treated astrocytes. In conclusion, our results provide a better understanding of the complex dialogue between human T lymphocytes and human astrocytes and neurons and highlight the role of neural cell responses to different cytokines in physiological and pathological conditions.

Les organismes vivants, qu'ils soient simples ou complexes, ont acquis des stratégies pour s'adapter aux changements environnementaux. Ces changements correspondent à un large éventail de signaux chimiques, physiques ou mécaniques qui doivent être transmis en messages intracellulaires. Dans la cellule, des réseaux de signalisation sont modulés avec une grande précision pour transmettre ces messages et générer une réponse cellulaire appropriée. Les protéines d'échafaudage jouent un rôle crucial dans la sélectivité et la modulation spatio-temporelle de la transduction du signal. Par divers mécanismes moléculaires, elles médient l’organisation de complexes multimoléculaires impliqués dans plusieurs processus biologiques. CNK est une protéine d'échafaudage découverte par le biais d’études génétiques chez la drosophile où elle agit comme modulateur positif de la signalisation RAS/MAPK. Cependant, les fonctions physiologiques des homologues de CNK de mammifères (CNK1, CNK2 et CNK3) et leurs contributions aux pathologies humaines sont mal caractérisées. De plus, il existe peu d’évidences rapportant leur implication dans la signalisation RAS/MAPK. Elles ont plutôt été associées à des voies de signalisation contrôlées par les guanosine triphosphatases (GTPases) des familles ARF et RHO. Dans un premier manuscrit, nous avons montré que CNK2 est requise pour la migration et l'invasion des cellules cancéreuses en couplant le récepteur tyrosine kinase (RTK) prométastatique AXL à l'activation de la GTPase ARF6. D'un point de vue mécanistique, la signalisation induite par AXL favorise le recrutement de CNK2 à la membrane plasmique de manière dépendante de PI3K. Ensuite, CNK2 promeut l’activation d’ARF6 via son interaction aux ARF Guanosine exchange factors (GEFs) cytohésines et à la protéine adaptatrice SAMD12. Nous démontrons également qu’ARF6 coordonne l'activité des GTPases RAC1 et RHOA. Enfin, l'ablation génétique de CNK2 ou SAMD12 réduit considérablement les lésions métastatiques hépatiques et pulmonaires dans un modèle de xénogreffe de souris. Dans une série d’expériences de BioID supplémentaires utilisant le mutant gain-de-fonction ARF6 Q67L, nous avons identifié PLD1 et ITGB1 comme candidats potentiels pouvant médier la signalisation RAC1 et RHOA en aval d’ARF6. Dans une autre série d’expériences, nous avons caractérisé l'interaction entre les CNKs et la sous-famille des kinases Misshapen (MSN). Les trois membres de cette sous-famille, MAP4K4, TNIK et MINK1, ont été identifiés comme principaux interacteurs proximaux de CNK2A et CNK3 dans les expériences de BioID. Toutefois, leur interaction ne semble pas être impliquée dans la fonction promigratoire de CNK2A. Par des expériences de cartographie, nous démontrons que les domaines CRIC et DUF1170 de CNK2/3 et la région coiled-coil de MAP4K4 sont importants pour leur interaction. Nos travaux suggèrent également que SAMD10 compétitionne avec MAP4K4 pour se lier à CNK2 et que SAMD10/12 modulent la stabilité de CNK2. Enfin, nos résultats préliminaires suggèrent que MAP4K4 induit la phosphorylation de CNK2/3. Cependant, la pertinence biologique de ces évènements reste à déterminer. Dans l'ensemble, nos travaux révèlent une fonction inattendue de CNK2 dans la régulation de la motilité des cellules cancéreuses et identifient une nouvelle voie de signalisation qui pourrait être ciblée pour limiter les métastases. En outre, nos travaux identifient plusieurs pistes pour approfondir le rôle de CNK dans les cellules de mammifères. / All living organisms, whether simple or complex, have acquired sophisticated strategies to adapt to their changing environment. These environmental changes correspond to a breadth of chemical and mechanical signals that need to be transmitted into intracellular information. In cells, dense signalling networks are put into place and modulated with great precision to transmit messages and generate appropriate cellular responses. Scaffolding proteins play a crucial role in the selectivity and spatiotemporal modulation of signal transduction. Through various molecular mechanisms, they mediate the organization of multimolecular complexes implicated in various biological processes. CNK is a scaffolding protein discovered through genetic studies in drosophila where it acts as an important positive regulator of the highly oncogenic RAS/MAPK pathway. In contrast, the physiological functions of human CNKs and their roles in human diseases are poorly characterized. Moreover, evidence supporting their requirement for RAS/MAPK signalling remains sparse. Rather, they have been linked to signalling pathways controlled by the ARF and RAS homologous (RHO) subfamilies of GTPases. In a first manuscript, we found that mammalian CNK2 promotes cancer cell migration and invasion by coupling the pro-metastatic RTK AXL to downstream activation of ARF6 GTPase. Mechanistically, we showed that AXL signalling induces PI3K-dependent recruitment of CNK2 to the plasma membrane where it stimulates ARF6 via its interaction with the cytohesin ARF GEFs and the adaptor protein SAMD12. We also showed that ARF6 coordinates RAC1 and RHOA GTPase activity. Finally, the genetic ablation of CNK2 or SAMD12 potently reduces liver and lung metastatic lesions in a mouse xenograft model. In a series of supplemental BioID experiments using the gain-of-function ARF6 Q67L mutant, we identified PLD1 and ITGB1 as potential candidates that could mediate RAC1 and RHOA signalling downstream of ARF6. In another study, we characterized the interaction between CNKs and the MSN subfamily of kinases. The three members of this subfamily, namely MAP4K4, TNIK and MINK1, were identified as top proximal interactors of CNK2A and CNK3 in the BioID experiments. However, their interaction does not appear to be involved in the pro-migratory function of CNK2A. Through mapping experiments, we found that the CRIC and DUF1170 domains of CNK2 and CNK3 and the coiled-coil region of MAPK4K4 are important for their interaction. In addition, we found that SAMD10 competes with MAP4K4 for binding to CNK2 and that SAMD10/12 proteins also modulate CNK2 stability. Finally, our preliminary results suggest that MAP4K4 induces CNK2/3 phosphorylation. However, the biological relevance of these interactions and phosphorylation events remains to be addressed. Overall, our work uncovers an unanticipated function of CNK2 in regulating cancer cell motility and identifies a novel signalling pathway that could be targeted to restrain metastasis. Moreover, it identifies several avenues for further study into CNK function in mammalian cells.

La motilité cellulaire est fondamentale dans de nombreux processus physiologiques, qu’ils soient normaux ou pathologiques. Cependant, bien que ces derniers impliquent la plupart du temps de nombreuses cellules se mouvant en même temps, les effets des interactions entre cellules sur leur dynamique, à la fois individuelle et collective, restent assez mal connu. Dans cette thèse, j’ai utilisé Dictyostelium discoideum à l’état végétatif pour étudier cette régulation collective de la motilité. Je me suis principalement appuyé sur une analyse minutieuse de nombreuses trajectoires cellulaires dans des situations variées pour (i) caractériser un facteur sécrété qui régule négativement la motilité cellulaire (nature chimique, voie de signalisation, dynamique de sécrétion et de réponse) et (ii) analyser et modéliser quantitativement la dynamique d’étalement de colonie cellulaires de forme, dimension et densité contrôlées. Je décris enfin un phénomène d’agrégation dynamique observé lorsque les cellules sont placées à haute densité dans un milieu nutritif / Cell motility is fundamental in many physiological, either normal or pathological, phenomena. Yet, although these most often involve several cells moving at the same time, how the interactions between cells affect both individual and collective dynamics remains a poorly understood question. In this thesis, I used vegetative Dictyostelium discoideum cells as a model to study this collective regulation of the motility. I relied mainly on the thorough analysis of numerous cell trajectories in various situations to (i) characterise a secreted factor used to down-regulate the cells’ motility (biochemical nature, response pathway, secretion and response dynamics) and (ii) quantitatively analyse and model the dynamics of spreading cell colonies of controlled initial shape, size and density. Last, I describe a dynamic aggregation phenomenon that occurs when the cells are seeded at high density in a nutrient-rich medium