Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The proprotein convertases (PC) are endoproteolytic enzymes essential for the generation of bioactive peptides.The production of KO mice for some of these PCs has allowed us to identify many different physiological phenotypes for these enzymes. PC1/3 is traditionally classified as a neuroendocrine enzyme. This has been supported by many studies performed in PC1/3 KO mice, as well as human subjects deficient in PC1/3, where this enzyme is responsible for the cleavage of neuroendocrine substrates, namely POMC and pro-insulin. However, very little research has been done on the potential role of PC1/3 in the immune system, despite evidence of its expression in immune cells, including macrophages. In the present study, we investigate the PC1/3 KO mouse through an immunological aspect. Our laboratory has previously reported an increase in the expression of PC1/3 in the spleen following LPS stimulation. By examining closely the spleen, we observed a splenomegaly of the organ as well as a marked disorganization of the regions of the spleen, such as an invasion of the red pulp with the marginal zone, which may affect the proper immunological response. Labeling of different immune cells demonstrated a decrease in the dendritic cells present in the PC1/3 KO mouse spleen. An interesting phenotype that was observed in the PC1/3 KO mice is their sensitivity to an LPS-induced septic shock, which was evident by an exaggerated secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-1[bêta] et TNF-[alpha]). Furthermore, the present study identifies the macrophages as major contributors to the unbalanced secretion observed in the PC1/3 KO mice since we report an increase in cytokine secretion in isolated peritoneal macrophages. We also demonstrate a link with the adaptive immune system. A massive secretion of IFN-[gamma] was measured in the PC1/3 KO mouse plasma, supporting the notion that the Th1 pro-inflammatory pathway is predominant in these mice following an LPS challenge. Taking into account these results, the study presented identifies a novel and unconventional role of PC1/3 in the regulation of the innate immune system.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Résumé : Dans les maladies respiratoires chroniques, les propriétés biochimiques et mécaniques des muscles lisses des voies respiratoires (MLVR) ont été analysées, mais les modes d’action des médiateurs lipidiques endogènes dérivés des oméga-3 (époxy- ou polyhydroxy- éicosanoïdes) restent à clarifier. Mon travail de recherche a pour but de caractériser le rôle potentiel de monoacyglycéride de l’acide éicosapentaénoϊque (MAG-EPA) et de monoacylglycéride de l’acide docosahexaénoϊque (MAG-DHA) ainsi que leurs métabolites (acide 17,18-époxyéicosatétraénoϊque : 17,18-EpETE, résolvine D1 : RvD1), sur le statut inflammatoire et l’activité contractile des voies respiratoires mises en culture organoϊde avec des cytokines pro-inflammatoires. Sur des trachées de cobayes (TC) natives précontractées au U-46619 (agoniste du récepteur thromboxane prostanoϊde), le 17,18-EpETE relaxe les tissus de manière plus importante que son précurseur, le MAG-EPA. Dans les TC mises en culture pendant 3 jours, les niveaux de TNF-α ont augmenté dans les fractions microsomales par rapport aux trachées natives. Sur ces tissues cultivés et traités avec 0.3 µM 17,18-EpETE, une réduction de la sensibilité au Ca2+ a été démontrée. De plus, une diminution de niveaux de détection des P-p65-NFκB, c-fos et c-Jun a été quantifiée en présence de 17,18-EpETE et des inhibiteurs de PKC ou Rho kinase lorsque les TC sont préalablement traités par 10 ng/ml TNF-α. Les cytokines pro-inflammatoires (IL-13 et TNF-α, etc…) jouent un rôle majeur dans la physiopathologie de l’asthme. Le projet de bronchioles humaines évalue l’effet de la RvD1 et de ses précurseurs (MAG-DHA, MAG-DPA et 17(S)-HpDoHE) sur le statut inflammatoire et la bronchoréactivité, in vitro. Dans les bronchioles stimulées par l’IL-13 pendant 48 h, le MAG-DHA ainsi que ces métabolites diminuent l’activation de la voie TNF-α/NFκB et la sensibilité au Ca2+ des tissus prétraités avec l’IL-13 vers des niveaux proches des conditions contrôles. Dans les bronchioles prétraitées par le TNF-α, l’inflammation et l’hypersensibilité au Ca2+ sont abolies par 1 µM MAG-DPA. De plus, l’aspirine combinée au MAG-oméga-3 potentialise les effets inhibiteurs de ce dernier sur l’inflammation et l’hyperréactivité bronchique induite par les cytokines, tout en régulant à la hausse les niveaux de détection du GPR-32 (le récepteur de RvD1). En conclusion, les dérivés des oméga-3 à longue chaîne pourraient résoudre l’inflammation et contrer les causes de l’hyperréactivité bronchique (HRB). / Abstract : In chronic respiratory diseases, the biochemical and mechanical properties of airway smooth muscle were analyzed, but the mode of action of omega-3 derivatives (epoxy or polyhydroxy-eicosanoids) remains to be clarified. My research work aims to characterize the potential role of eicosapentaenoic acid monoacyglyceride (MAG-EPA) and docosahexaenoic acid monoacylglyceride (MAGDHA) and their bioactive metabolites (17,18-epoxyeicosatetraenoic acid: 17 18-EpETE, resolvin D1: RvD1) on the inflammatory status and the contractile activity of organcultured airway explants with pro-inflammatory cytokines. On 30 nM U-46619 (Thromboxane prostanoid receptor agonist) pre-contracted fresh guinea pig trachea, 17,18 EpETE displays a greater ability than its precursor, MAG-EPA to relax airways. In 72-h-cultured tracheal rings, TNF-α levels increase in the microsomal fractions when compared to native trachea. In cultured and pre-treated tracheal rings with 0.3 µM 17,18-EpETE, the Ca2+ hypersensitivity is alleviated in comparaison to 3 day cultured tracheal rings. In addition, the detection levels of P-NFκB, c-fos and c-Jun were abolished in the presence of 17,18-EpETE and PKC or Rho kinase inhibitors in short term-TNF-α- incubated tracheal rings. Pro-inflammatory cytokines (IL-13, TNF-α, etc…) play a major role in asthma pathophysiology. The human bronchi project evaluates the effect of RvD1 and its precursors (MAG-DHA, MAG-DPA and 17 (S)-HpDoHE) on the inflammatory status and bronchial reactivity, in vitro. In IL-13 stimulated human bronchi for 48 h, the MAG-DHA and its metabolites decrease the activation of TNF-α / NFκB pathway and blunt the Ca2+ hypersensitivity triggered by IL-13. In TNF-α-pretreated human bronchi, airway inflammation and Ca2+ hypersensitivity are reversed by 1 µM MAG-DPA. Hence, aspirin combined with MAG-omega-3 potentiate the inhibitory effects of MAG-DHA on inflammation and bronchial hyperrresponsiveness triggered by pro-inflammatory cytokines, while upregulating the GPR-32 detection levels (RvD1 receptor). In conclusion, omega-3 derivatives could counteract the causes of airway hyperrresponsiveness (AHR).

Une des difficultés majeures dans le traitement des cancers est l’acquisition de résistance par les cellules tumorales vis-à-vis de la mort induite par les différentes chimiothérapies. Au sein du laboratoire, nous nous intéressons aux propriétés anti-tumorales d’un donneur de monoxyde d’azote (NO), le Glycéryl TriNitrate (GTN), fréquemment utilisé dans le traitement de l’angine de poitrine. Au cours de ce travail, nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels le GTN sensibilise les cellules tumorales de plusieurs types de cancer (colique, mammaire, prostatique) à la mort impliquant des voies de signalisation régulées par des cytokines telles que le TNFα, l’IL-6 ou encore le GDF-15.Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l’action anti-tumorale du GTN permettrait de potentialiser son utilisation comme nouvelle thérapie anti-cancéreuse.Modèle colique : le GTN, en présence de la cytokine pro-inflammatoire TNFα, sensibilise les cellules cancéreuses coliques et mammaires à l’apoptose. Du point de vue mécanistique, le GTN induit la S-nitrosylation de cIAP1, inhibant ainsi son activité ubiquitine E3 ligase. Ce qui abroge la voie de signalisation classique NF-кB de survie cellulaire activée par la voie TNFα/TNFR1 en faveur d’une voie de signalisation pro-apoptotique.Modèle mammaire : le GTN intervient au niveau de la migration cellulaire en altérant la voie de signalisation Jak2/STAT3 activée par la cytokine pro-inflammatoire IL-6, dans un modèle de cancer du sein triple négatif. En présence de dérivés du platine (carboplatine) générant de l’IL-6, le GTN freine la migration des cellules en induisant la S-nitrosylation, et probablement l’inactivation, de la kinase Jak-2, indispensable pour l’activation de la voie.Modèle prostatique : le GTN sensibilise à la mort les cellules cancéreuses prostatiques résistantes au docétaxel en modulant le taux de deux marqueurs de résistance à cette chimiothérapie : la clusterine (CLU) et le growth differentiation factor 15 (GDF-15). Au niveau moléculaire, le GTN diminue le taux de l'isoforme cytoprotectrice soluble de la CLU (sCLU) et augmente le taux de l'isoforme cytotoxique nucléaire (nCLU) dans les cellules prostatiques résistantes au docétaxel. Plus particulièrement, en présence de GTN, nous avons établi un lien entre le GDF-15 et la modulation du taux des isoformes de la CLU. / One of the main difficulties in the treatment of cancers is the acquisition of resistance by the tumor cells vis-à-vis the death induced by the different chemotherapies. In the laboratory, we are interested in the anti-tumor properties of a nitric oxide (NO) donor, Glyceryl TriNitrate (GTN), frequently used in the treatment of angina pectoris. In this work, we investigated the molecular mechanisms by which GTN sensitizes tumor cells of several types of cancer (colonic, mammary, prostate) to death involving signaling pathways regulated by cytokines such as TNFα, IL-6 or GDF-15.A better understanding of the mechanisms underlying the GTN's anti-tumor action would make it possible to use it as a new anti-cancer therapy.Colon model: GTN, in the presence of the pro-inflammatory cytokine TNFα, sensitizes colon and mammary cancer cells to apoptosis. From a mechanistic point of view, GTN induces S-nitrosylation of cIAP1, thus inhibiting its ubiquitin E3 ligase activity. This abrogates the classical NF-κB signaling pathway of TNFα / TNFR1 activated cell survival in favor of a pro-apoptotic signaling pathway.Mammary model: GTN intervenes at the level of cell migration by altering the Jak2 / STAT3 signaling pathway activated by the pro-inflammatory cytokine IL-6, in a model of triple negative breast cancer. In the presence of platinum (carboplatin) derivatives generating IL-6, GTN inhibits cell migration by inducing S-nitrosylation, and probably inactivation, of Jak-2 kinase, essential for the activation of the way.Prostate model: GTN sensitizes prostatic prostate cancer cells to death by modulating the level of two markers of resistance to this chemotherapy: clusterin (CLU) and growth differentiation factor 15 (GDF-15). At the molecular level, GTN decreases the level of the soluble cytoprotective isoform of CLU (sCLU) and increases the level of nuclear cytotoxic isoform (nCLU) in prostatic cells resistant to docetaxel. More particularly, in the presence of GTN, we have established a link between GDF-15 and the modulation of the isoform rate of the CLU.

Les neutrophiles sont généralement considérés résistants aux glucocorticoïdes. Cependant, peu d’études comparant l’effet de ces drogues sur les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins (monocytes, lymphocytes et éosinophiles) ont été rapportées. Dans notre étude, nous avons évalué la réponse aux glucocorticoïdes de ces deux populations cellulaires chez le cheval et l’homme. Les cellules, préalablement isolées du sang de 6 chevaux et 4 sujets humains sains, ont été incubées pendant 5 h en présence de lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/mL) seul ou combiné avec de l’hydrocortisone, de la prednisolone ou de la dexaméthasone (10-8M et 10-6M). L’expression d’ARNm pour l’IL-1β, le TNF-α, l’IL-8, la glutamine synthétase et le récepteur α des glucocorticoïdes (GR-α) a été quantifiée par qPCR. Les neutrophiles équins ont également été incubés pendant 20 h en présence de ces 3 glucocorticoïdes et la survie cellulaire a été évaluée par cytométrie de flux et microscopie optique. Nous avons démontré que les glucocorticoïdes inhibaient l’expression des gènes pro-inflammatoires induite par le LPS pour les deux populations cellulaires chez les deux espèces étudiées. L’expression de la glutamine synthétase était également significativement augmentée par les glucocorticoïdes chez les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins équins. De manière générale, l’intensité de la réponse aux glucocorticoïdes s’est avérée similaire dans les 2 populations leucocytaires et chez les deux espèces. Les glucocorticoïdes augmentaient également la survie des neutrophiles équins, phénomène également rapporté dans d’autres espèces. Ainsi, les glucococorticoïdes exercent des effets d’intensité comparable sur les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins. Nous spéculons que la faible réponse à la corticothérapie observée lors de maladies inflammatoires chroniques neutrophiliques comme l’asthme sévère ou la Maladie Pulmonaire Obstructive Chronique (MPOC) ne s’explique pas par une corticorésistance intrinsèque des neutrophiles. / Neutrophils are generally considered resistant to glucocorticoids compared to other inflammatory cells. However, there are few studies comparing the effects of glucocorticoids in neutrophils and those of other blood leukocytes (monocytes, lymphocytes and eosinophils). In our study, we assessed glucocorticoid-responsiveness in equine and human peripheral blood neutrophils and in neutrophil-depleted leukocytes. Cells were isolated from 6 healthy horses and 4 human healthy subjects. They were incubated for 5 h with or without lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/mL) alone or combined with hydrocortisone, prednisolone or dexamethasone (10-8M and 10-6M). IL-1β, TNF-α, IL-8, glutamine synthetase and Glucocorticoid Receptor α (GR-α) mRNA expression was quantified by qPCR. Equine neutrophils were also incubated for 20 h with or without the three glucocorticoids and cell survival was assessed by flow cytometry and light microscopy. We found that glucocorticoids down-regulated LPS-induced pro-inflammatory mRNA expression in both cell populations and species. These drugs also significantly increased glutamine synthetase gene expression in both equine cell populations. The magnitude of glucocorticoid response was generally similar in both cell populations and species. As reported in other species, glucocorticoids significantly increase the survival in equine neutrophils. Based on these results, it appears that glucocorticoids exert effects of similar magnitude on neutrophils and on other blood leukocytes. We speculate that the poor response to glucocorticoids observed in some chronic neutrophilic human diseases such as severe asthma or Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is not explained by an inherent attenuated response of neutrophils to these drugs.

Les glucocorticoïdes sont les médicaments les plus efficaces pour le contrôle de l'obstruction respiratoire chez les chevaux atteints du souffle, et de l'asthme humain. Toutefois, les neutrophiles persistent dans les voies respiratoires suite à ce traitement. Nous avons précédemment rapporté que les neutrophiles sanguins humains et équins sont sensibles à l'action des glucocorticoïdes. Comme elle contribue à l'insensibilité des cellules épithéliales pulmonaires humaines aux glucocorticoïdes, nous avons émis l'hypothèse que l'IL-17 a un effet similaire sur les neutrophiles et qu’elle contribue à leur persistance dans les voies respiratoires asthmatiques. Objectifs : Évaluer 1. L’expression des deux sous-unités du récepteur de l’IL-17 (l'IL-17RA/IL-17RC) chez les neutrophiles équins hautement purifiés. 2. Si l'IL-17 active directement les neutrophiles et si cette réponse est sensible à l'action des glucocorticoïdes. 3. L'effet de l'IL-17 sur la viabilité et l'apoptose des neutrophiles. Résultats: 1. Les neutrophiles expriment l’IL-17RA/IL-17RC aux niveaux translationnel et protéique. 2. L’IL-17 induit une activation sélective des neutrophiles (surrégulation de l’IL-8), qui n’est pas atténuée par dexaméthasone et 3. l’IL-17 augmente la viabilité des neutrophiles stimulés (LPS) par une diminution de l'apoptose. Nos résultats indiquent que l'IL-17 active directement le neutrophile équin, et que l’augmentation de l’IL-8 (puissant chimioatractant des neutrophiles) qui en résulte n’est pas contrôlée par la dexaméthasone. L'IL-17 pourrait aussi contribuer à la persistance de neutrophiles dans les voies respiratoires chez les chevaux atteints du souffle, en diminuant l'apoptose. / Glucocorticoids are the most potent drugs for the control of the airway obstruction present in heaves and asthma, although the airway neutrophilia persist with these agents. It was previously reported that human and equine’s peripheral blood neutrophils are sensitive to glucocorticoid. Interleukin-17 (IL-17) is a cytokine contributing to glucocorticoid insensitivity airway epithelial cells in human. We therefore hypothesized that IL-17 has a similar effect on neutrophils and contributes to the persistence of these cells in the airways in response to glucocorticoid therapy. In this study, we evaluated: 1. The expression of both subunits of IL-17 receptor (IL-17RA/ IL-17RC) in highly purified neutrophils. 2. The gene expression of proinflammatory cytokines in neutrophils to assess their activation by IL-17 and their effect in these cells treated with glucocorticoids. 3. The effects of IL-17 on the viability and apoptosis in neutrophils were performed. Results showed that 1. Equine neutrophils express IL-17RA and IL-17RC at transcriptional at protein level. 2. IL-17 induces a selective activation in neutrophils, which results in an upregulation of IL-8, not attenuated by dexamethasone and finally, 3. IL-17 increases the viability of neutrophils stimulated with LPS by a decrease in apoptosis. Our results indicate that IL-17 directly activates neutrophils to upregulate IL-8, a potent neutrophils chemoattractant, and that this response is not prevented by glucocorticoids. They also suggest a possible role of IL-17 in the persistence of neutrophils in the asthmatic airways by decreasing apoptosis.

Les neutrophiles sont généralement considérés résistants aux glucocorticoïdes. Cependant, peu d’études comparant l’effet de ces drogues sur les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins (monocytes, lymphocytes et éosinophiles) ont été rapportées. Dans notre étude, nous avons évalué la réponse aux glucocorticoïdes de ces deux populations cellulaires chez le cheval et l’homme. Les cellules, préalablement isolées du sang de 6 chevaux et 4 sujets humains sains, ont été incubées pendant 5 h en présence de lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/mL) seul ou combiné avec de l’hydrocortisone, de la prednisolone ou de la dexaméthasone (10-8M et 10-6M). L’expression d’ARNm pour l’IL-1β, le TNF-α, l’IL-8, la glutamine synthétase et le récepteur α des glucocorticoïdes (GR-α) a été quantifiée par qPCR. Les neutrophiles équins ont également été incubés pendant 20 h en présence de ces 3 glucocorticoïdes et la survie cellulaire a été évaluée par cytométrie de flux et microscopie optique. Nous avons démontré que les glucocorticoïdes inhibaient l’expression des gènes pro-inflammatoires induite par le LPS pour les deux populations cellulaires chez les deux espèces étudiées. L’expression de la glutamine synthétase était également significativement augmentée par les glucocorticoïdes chez les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins équins. De manière générale, l’intensité de la réponse aux glucocorticoïdes s’est avérée similaire dans les 2 populations leucocytaires et chez les deux espèces. Les glucocorticoïdes augmentaient également la survie des neutrophiles équins, phénomène également rapporté dans d’autres espèces. Ainsi, les glucococorticoïdes exercent des effets d’intensité comparable sur les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins. Nous spéculons que la faible réponse à la corticothérapie observée lors de maladies inflammatoires chroniques neutrophiliques comme l’asthme sévère ou la Maladie Pulmonaire Obstructive Chronique (MPOC) ne s’explique pas par une corticorésistance intrinsèque des neutrophiles. / Neutrophils are generally considered resistant to glucocorticoids compared to other inflammatory cells. However, there are few studies comparing the effects of glucocorticoids in neutrophils and those of other blood leukocytes (monocytes, lymphocytes and eosinophils). In our study, we assessed glucocorticoid-responsiveness in equine and human peripheral blood neutrophils and in neutrophil-depleted leukocytes. Cells were isolated from 6 healthy horses and 4 human healthy subjects. They were incubated for 5 h with or without lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/mL) alone or combined with hydrocortisone, prednisolone or dexamethasone (10-8M and 10-6M). IL-1β, TNF-α, IL-8, glutamine synthetase and Glucocorticoid Receptor α (GR-α) mRNA expression was quantified by qPCR. Equine neutrophils were also incubated for 20 h with or without the three glucocorticoids and cell survival was assessed by flow cytometry and light microscopy. We found that glucocorticoids down-regulated LPS-induced pro-inflammatory mRNA expression in both cell populations and species. These drugs also significantly increased glutamine synthetase gene expression in both equine cell populations. The magnitude of glucocorticoid response was generally similar in both cell populations and species. As reported in other species, glucocorticoids significantly increase the survival in equine neutrophils. Based on these results, it appears that glucocorticoids exert effects of similar magnitude on neutrophils and on other blood leukocytes. We speculate that the poor response to glucocorticoids observed in some chronic neutrophilic human diseases such as severe asthma or Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is not explained by an inherent attenuated response of neutrophils to these drugs.

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