Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. / Made available in DSpace on 2012-10-17T14:24:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T16:34:51Z : No. of bitstreams: 1 175172.pdf: 5209583 bytes, checksum: 5a0af09a3dc460bebb6a47cb057c1f0a (MD5) / Neste trabalho são propostos modelos para se descrever o comportamento elétrico de dispositivos do tipo metal/polímero eletroluminescente/metal, os quais formam a estrutura básica para a confecção de diodos emissores de luz com camada ativa orgânica. Assume-se que o processo de injeção de carga nesses dispositivos se faz por tunelamento quântico através da barreira de energia potencial triangular formada na interface metal/polímero. Partindo dessa premissa, demonstra-se como a expressão para a densidade de corrente de tunelamento dependente da temperatura explica os desvios da teoria de Fowler-Nordheim na região de baixos campos elétricos aplicados. Estes desvios foram observados em medidas de corrente elétrica como função da tensão realizadas em dispositivos com condutividade dominada pela injeção de um único tipo de portador de carga (unipolares). Do ajuste dessa teoria aos dados experimentais resulta um método de determinação da altura de barreira presente na interface metal/polímero, que independe do conhecimento prévio da massa específica do portador de carga ou da espessura do filme polimérico para sua aplicação. Os valores de altura de barreira fornecidas por este método estão em razoável acordo com os valores reportados na literatura para diferentes interfaces metal/polímero. As magnitudes de densidade de corrente medidas em dispositivos poliméricos unipolares são menores que as calculadas utilizando os modelos de injeção por tunelamento. Esta discrepância foi atribuída a existência de uma camada de óxido entre o eletrodo injetor e o polímero. Da análise realizada neste trabalho vê-se que, apesar das correntes de tunelamento através da dupla barreira presente nas interfaces metal/óxido/polímero serem em alguns casos passíveis de observação experimental, a hipótese da existência da camada de óxido não é capaz de explicar a discordância entre teoria e experiência. Por intermédio da aproximação regional, o efeito da carga espacial sobre a densidade de corrente de portadores que tunelam do eletrodo metálico em direção ao polímero é calculado. Considera-se que a densidade de carga espacial no filme polimérico decresce com o aumento da distância do eletrodo injetor. A teoria do tunelamento limitado por carga espacial (SCTC) assim derivada é capaz de explicar a divergência entre as magnitudes da densidade de corrente prevista pelos modelos de tunelamento e as densidades medidas em dispositivos poliméricos unipolares. Da mesma forma, a partir dessa teoria pode-se entender porque, em certas circunstâncias experimentais, observa-se que a condutividade elétrica de dispositivos poliméricos unipolares é determinada pelo processo de injeção na interface metal/polímero e, em outras circunstâncias, que ela é dominada pelo transporte dos portadores de carga ao longo do filme polimérico. Demostra-se ainda que a teoria SCTC fornece os mesmos resultados que a teoria da condutividade elétrica limitada por carga espacial (SCLC) quando a altura de barreira para a injeção de portadores de carga é pequena ou quando o filme polimérico é muito espesso. A teoria do tunelamento limitada por carga espacial é aplicada aos dados experimentais, resultando em valores para a mobilidade de arraste de buracos bastante próximos daqueles reportados na literatura e em valores para a altura de barreira para a injeção de buracos em concordância com os estimados pela regra de Schottky-Mott. Finalmente, é proposto um modelo analítico para explicar as características elétricas de dispositivos de camada única nos quais ocorre a injeção, o transporte e a recombinação de elétrons e buracos (dispositivos bipolares). Novamente por intermédio da aproximação regional, a distribuição espacial da intensidade do campo elétrico, da concentração de portadores de carga e da taxa de recombinação ao longo do dispositivo é calculada. As características elétricas de dispositivos com diferentes alturas de barreira para a injeção dos portadores de carga e diferentes valores de mobilidade de elétrons e buracos são analisadas. Constata-se que a pequena mobilidade dos elétrons em relação aos buracos concentra a distribuição de emissão nas regiões próximas ao cátodo. Um método simples para se avaliar a eficiência de um dispositivo, para cada tensão aplicada, é proposto. Através de sua utilização verifica-se que dispositivos com injeção balanceada de elétrons e buracos são mais eficientes do que os dispositivos com injeção não balanceada, antes que eles atinjam a condição de operação de máxima eficiência (definido como o conjunto de valores de tensão em que todo o buraco injetado no ânodo recombina-se com todo elétron injetado pelo cátodo). O aumento da mobilidade dos elétrons diminui levemente a eficiência do dispositivo nas vizinhanças da condição de operação de máxima eficiência, para dispositivos que apresentam, entre si, as mesmas alturas de barreira no cátodo e no ânodo e a mesma mobilidade de buracos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química / Made available in DSpace on 2012-10-26T09:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 301844.pdf: 2754979 bytes, checksum: 36c9eca74510415e9fdd397a97937d46 (MD5) / Apresenta-se a sintese do complexo binuclear [Cu2(L)Cl3] (1) onde L e a forma desprotonada do ligante 3-[(4,7-diisopropil-1,4,7-triazaciclononan-1-il)metil]-2-hidroxi-5-metilbenzaldeido ou tacn-Ipr2mff. O complexo foi caracterizado por difratometria de raios-X por monocristal, titulacao potenciometrica, espectrometria de massa, medidas eletroquimicas, EPR, UV-Vis e IR. O complexo 1 e capaz de aumentar a velocidade da hidrolise do diester de fosfato bis-(2,4-dinitrofenil)fosfato (2,4-BDNPP) em 2700 vezes e promover a clivagem de DNA plasmidial em meio aquoso neutro e ainda inibir a formacao do cromoforo formazan em processos redox envolvendo radical superoxido. Usando o modelo celular eucariotico Saccharomyces cerevisiae (BY4741 wt) observou-se que o complexo e nao citotoxico. Alem disso, o tratamento de celulas da linhagem wt e mutantes deficientes em CuZn-Superoxido Dismutase (Sod1) e Catalase citosolica (Ctt1) com o complexo 1 aumenta a viabilidade celular apos estresse com H2O2 ou menadiona (gerador intracelular de O2#o-), indicando que 1 pode atuar como um modelo biomimetico de Sod1 e Ctt1. Unidos os resultados suportam consideracoes acerca de um comportamento dinamico de um complexo nao X simetrico binuclear de Cu(II) em estado solido e em equilibrios aquosos pH-dependentes. / Here we present the synthesis of the dinuclear complex [Cu2(L)Cl3] (1) where L is the deprotonated form of the 3-[(4,7-diisopropyl-1,4,7-triazacyclononan-1-yl)methyl]-2-hydroxy-5-methylbenzaldehyde ligand. The complex was characterized by single crystal x-ray diffraction, potentiometric titration, mass spectrometry, electrochemical measurements, EPR, UV-Vis and IR. Complex 1 is capable of increase the hydrolysis rate of the diester bis-(2,4-dinitrophenyl)phosphate (2,4-BDNPP) in 2700 times, promote the plasmidial DNA cleavage at pH 6 and inhibit the formazan chromophore formation in redox processes at pH 7 as well. Using Saccharomyces cerevisiae (BY4741) as eukaryotic cellular model, we observed that 1 presented reduced cytotoxicity. In addition, treatment of Wild-type and mutant cells lacking Cu/Zn-superoxide dismutase (Sod1) and cytoplasmic Catalase (Ctt1) with 1 promotes an increase of survival after H2O2 and menadione (O2#o- generator) stresses indicating that 1 might be acting as Sod1 and Ctt1 mimics. Taken together the results give support to considerations about the dynamic XII behavior of an unsymmetrical copper(II) dimer complex in solid state and aqueous pH-dependent solution.

Orientador: Lauro Tatsuo Kubota / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:10:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marzal_PercyCalvo_M.pdf: 1907499 bytes, checksum: 940f8b75199ed7abc6dc5bfe51b1239b (MD5) Previous issue date: 2000 / Mestrado

Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T09:35:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Granjeiro_PauloAfonso_D.pdf: 6945763 bytes, checksum: 1bf35dc294eff2d10a98cde194872e8b (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O presente trabalho contém dados sobre estudos cinéticos, físico-químicos e conformacional da fosfatase ácida de sementes de mamona. Através do enfoque cinético foram estudados efeitos de inibidores e determinados os aminoácidos presentes no sítio ativo ou importantes para a catálise. Para fosfato, molibdato e o-vanadato as inibições foram do tipo competitiva, com valores de Ki 0,14 mM, 10 x 10-6 mM e 1,6 x 10-3 mM, respectivamente. Por outro lado, na presença de fluoreto a inibição foi do tipo mista, com valores de Kic e Kiu de 0,91 mM e 0,42 mM, respectivamente. Nos estudos sobre estabilidade térmica observou-se que a enzima perdeu 80% de sua atividade quando incubada a 60°C por 15 mino Na presença de 10 mM de p-nitrofenol e fosfato inorgânico, a perda foi de 40%. Na determinação dos aminoácidos presentes no sítio ativo da enzima utilizando-se agentes modificadores, observou-se que a fosfatase ácida de sementes de mamona era inativada em 5010 por ácido iodoacético (IA A), que atua em grupos SH, sendo esta inativação tempo e concentração dependente. Observou se a presença de duas cisteínas no sítio ativo, com valor de constante bimolecular igual 2,9 X 10-4 M-1 S-I. Do ponto de vista físico-químico e conformacional, determinou-se o ponto isoelétrico da enzima, o seu conteúdo em carboidrato e realizou-se um estudo de desnaturação da enzima, por temperatura e por agentes caotrópicos. A fosfatase ácida de sementes de mamo na apresentou um ponto isoelétrico de 4,6 e um conteúdo de carboidratos de 40%, sendo glicose o único monossacarídeo detectado. A desnaturação da enzima na presença de agentes caotrópicos, como uréia e cio reto de guanidina, mostrou ser reversível. Foram determinados os parâmetros termodinâmicos como variação de energia livre {_G(HzO)}, concentração do composto que causa 50'0 de desnaturação (D1/z) e o intercepto da transição desnaturante (m), cujos valores foram 4,9 Kcal mol-l, 4,95 M e 0,991 Kcal mol-l M-l, em presença de uréia, e 4,98 Kcal mol-l, 2,35 M e 2,118 Kcal mol-l M-l em presença de GndHCl, respectivamente. Na desnaturação térmica o desnovelamento da enzima resultou em aumento da absorbância, com formação de agregados quando a temperatura foi superior a 90°C. Porém, este efeito não foi observado quando a desnaturação da enzima ocorreu na presença de 10 mM de pNP e Pi. Porém, o processo de desnaturação térmica da enzima apresentou ser i rreversíve I em ambas as situações. Por fim foram estudadas algumas propriedades da enzima após remoção da porção de carboidrato pela endoglicosidase H. Observou-se o aparecimento de um pH ótimo adicional em 3,5, uma diminuição de duas vezes na constante de especificidade para o substrato p-nitrofenilfosfato, um aumento do ponto isoelétrico para 4,75 e uma diminuição da heterogeneidade da banda de proteína em eletroforese de gel de poliacrilamida. Nos estudos de germinação foram determinadas as atividades fosfatásicas dos extratos de plântulas germinadas durante um período. A enzima apresentou picos de atividade fosfatásica nos 79., 59. e 99. dias utilizando pNPP, PEP, PPi e Tyr-P como substratos, respectivamente. Porém, durante este período não foi observada atividade fosfatásica na presença de ácido fítico. A quantidade de proteínas aumentou durante a germinação ao passo que a quantidade de fosfato diminui / Abstract: This work contains results about kinetic, physico-chemical and conformationalstudies of castor bean seed acid phosphatase. About kinetic approaches we studied the effect of inhibitors and determined the amino acids present in the active site. Inorganic phosphate, molybidate and o vanadate were competitive inhibitors, with Ki values of 0,14 mM, 10 x 10-6 mM e 1,6 X 10-3 mM, respectively. On the other hand, fluoride inhibition was of the mixed type, with Kic and Kiu values of 0.91 mM and 0.42 mM, respectively. The thermal stability studies showed that the enzyme lost 80% of activity when incubated at 60°C for 15 mino But, in the presence of 10 mM of p-nitrophenol and Pi the enzyme lost 40% of activity. 5tudying the amino acids present in the active site by using modifying reagents, we observed that castor bean seed acid phosphatase was inactivated 50% in the presence of IAA, that acted sulfhydryl groups, in an inactivation time- and concentration-dependent. The acid phosphatase has two cysteines in its active site, with bimolecular constant value of 2.9 X 10-4 M-1 S-I. In the physico-chemical and conformational approaches, we determined the isoeletric point, the carbohydrate composition and denaturation studies in the presence of caotropic agents and temperature. The acid phosphatase has a pI value of 4.6 and contained 40% of carbohydrate in its structure, and glucose was the only monossacharide found in the composition. The enzyme denaturation in the presence of caotropic agents, as urea and GndHCl, showed to be reversible. The thermal parameters such as f1G (HzO), DlIz and m were determined to be 4.9 Kcal mol-l, 4.95 M and 0.991 Kcal mol-l, in the presence of urea, and 4.98 Kcal mol-l, 2.35 M and 2.118 Kcal mol-l, in the presence of GdnHCl, respectively. In the thermal denaturation, the enzyme unfolded as aggregate when the temperature was ligher than 90°C. This aggregation was not observed when the enzyme was incubated in the presence of 10 mM pNP and Pi. In both cases the process of denaturation was irreversible. Finally, we studied some properties of the enzyme after carbohydrate remotion by endoglicosidase H. We observed an additional optimum pH of 3.5, a decrease in the specificity constant using pNPP as substrate, a increasing in the pI value and a decrease in the carbohydrate heterogeneity migration in SDS-PAGE. This work contains also some germination studies of castor bean seeds, with determination of acid phosphates activity using pNPP, Tyr-P and PPi as substrates. The peaks of acid phosphatase activity using pNPP, PEP, PPi and Tyr-P as substrates were 7th, 5th and 9th, respectively. The protein concentration increase during germination whi le phosphate concentration decrease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Eulazio Mikio Taga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T20:29:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_ThelmaLopesda_M.pdf: 4447485 bytes, checksum: c7c9ff90037e1b28d23b82044ec65119 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (20 kDa) do rim de carneiro foi purificada 1.291 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 4%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, cromatografia de troca-iônica em SP-Sephadex com eluição por íon afinidade e cromatografia de exclusão molecular (Sephacryl S-200). A enzima 1 ¿1 purificada apresentou uma A.E. de 99,4 µmol min mg . O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou uma faixa de pH ótimo de 4,0 a 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 57°C. A atividade da enzima foi pouco sensível a diversos compostos, reagentes redutores de tióis e íons metálicos, exceto pela inibição por Zn2+, CU2+, Hg2+ e Ag+ e, pela ativação por guanosina. A energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 54,5 kJ mol-1 K-1. Dos substratos testados, o pNPP, o B-Naftil-P, a FMN e a Tyr-P foram os únicos hidrolisados significativamente com Km de 0,08 mmol L-1; 0,37 mmol L-1; 10,9 mmol L-1 e 0,51 mmol L-1, respectivamente. A análise dos parâmetros cinéticos na presença de BSA 1 mg mL-1 (no meio de diluição ou no meio de reação) para os substratos pNPP e B Naftil-P, mostrou um aumento na Km e na Vmax, enquanto que para a Tyr-P a Km diminuiu. A Km para a hidrólise da FMN não foi alterada. A Ea para a hidrólise do pNPP, na presença de BSA no meio de reação ou no meio de diluição, foi similar à obtida na ausência de BSA. Nos estudos de estabilidade térmica observamos que os diversos compostos testados (Pi, BS_ Glicerol e DTT) somente protegeram a enzima quando utilizados em conjunto. Isoladamente não houve proteção significativa. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto, e inibição por vanadato (Ki, 0,18 µmol L-1), piridoxal-5-P (Ki, 3,7 µmol L-I), Pi (Ki, 0,6 mmol L-1), molibdato de amônio (Kic, 0,1 mmol L-1 e Kia, 0,2 mmol L-1) e pCMB. Assim como para o pNPP, o vanadato era um inibidor competitivo com relação a FMN e Tyr-P, com valores de Ki de 0,34 nmol L-1 e 0,48µmol L-1, respectivamente / Abstract: A low molecular weight sheep kidney protein tyrosine phosphatase was purified 1291-fold to homogeneity, with 4% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution and molecular exc1usion chromatography. The purified 1 ¿1 enzyme had a specific activity of 99.4 J!mol min mg . The pNPP hydrolysis reaction catalyzed by this enzyme had a broad pH optimum of 4.0-5.5 and maximal activity at 57°C. Reducing thiol compounds, metal ions and other different compounds did not significantly affect the enzyme activity except for the inhibition by Zn2+, CU2+, Hg2+, Ag+ and activation by guanosine. An activation energy value of 54.5 µmofl K-1 was determined from Arrhenius plot for the hydrolysis of pNPP. The apparent Km values obtained, at 37°C and pH 5.0, for the best substrates were 0.08 mmol L-1, 0.37 mmol L-1, 0.51 mmol L-1 and 10.9 mmol L-1 for pNPP, B-Naphthyl-P, FMN and Tyr-P, respectively. Kinetic parameters in the presence of 1 mg mL-1 BSA, in the reaction medium or in the enzyme dilution medium, showed an increase in Km and Vmax for the substrates pNPP and B-Naphthyl-P. For the substrates Tyr-P and FMN, the Km decreased or was not. affected, respectively. The activation energy was not also affected in the presence of BSA. The following compounds Pi, DTT, BSA, and glycerol only protected the enzyme against thermal inactivation if used together. The enzyme was inhibited by vanadate (Ki, 0.18 µmol L-1), pyridoxal-5-P (Ki, 3.7 µmol L-1), inorganic phosphate (Ki, 0.6 mmol L-1), ammonium molybdate (Kic, 0,1 mmol L-1 e Kia, 0,2 mmol L-1) and pCMB. Both tartrate and fluoride were ineffective inhibitors. As observed for pNPP, was a competitive inhibitor, in relation to FMN and Tyr-P, with the following Ki values: 0.34 nmol L-1 and 0.48 µmol L-1 respectively / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Eulazio Mikio Taga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T20:55:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_IsabeleFabriciaTakedaMarianoda_M.pdf: 8492782 bytes, checksum: 3412a86c31242813d8dbde4a7e2aa6c8 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O chumbo é o metal tóxico mais ubiquamente distribuido e detectável em praticamente todas as fases inertes do meio ambiente e em todos os sistemas biológicos. O efeito tóxico do chumbo envolve vários sistemas orgânicos e atividades bioquímicas. Nesse trabalho foi estudado o efeito do chumbo na atividade da fosfatase ácida e as alterações morfológicas resultantes. Nesta pesquisa foram utilizados 45 ratos "Wistar" machos albinos, com dois meses de idade, sendo 15 do grupo controle e 30 do grupo tratado. Para o grupo tratado foi dado, diariamente, 0,5 ml de acetato de chumbo (45 mglKg), intragastricamente, enquanto que o grupo controle recebia apenas água (0,5 ml). Após 06 semanas (42 dias), os animais foram decapitados e os órgãos (testículo, intestino, rim, baço, figado, estômago, coração, pulmão, cérebro e cóclea) removidos para análises. .A atividade enzimática no extrato foi determinada em tampão acetato0,1M, pH 5,0 à 37°C, por dois minutos, usando 5mM de pNPP como substrato. Tartarato (0,1M) e pHMB (10mM) foram utilizados como inibidores da fosfatase ácida de AMr e BMr, respectivamente. No grupo tratado as fosfatases de AMr e BMr foram similarmente inibidas (70%) em todos os órgãos, em relação ao grupo controle. V árias alterações foram encontradas nos diversos tecidos (analisados por microscopia óptica), como degeneração e desorganização celular, grânulos de pigmentos enegrecidos intra-citoplasmáticos, hiperemia, aumento da basofilia no osso coclear, etc / Abstract: Lead is the most unibiniquitous toxic metal and is detectable in practically all phases of the inert environment and in all biological systems. The toxic effects of lead involve several organs systems and biochemical activities. In this work we studied the effect of lead on acid phosphatase activity and the morphologic changes. Male albino Wistar rats (2-months years old) were used at the experiments. To the treated group were given 0.5 mllead acetate (45 mg/K.g weight daily), intragastrically, while the control group received water (0.5 ml). After six weeks (42 days), the animaIs were decapitated and the organs (testicle, intestine, kidney, spleen, liver, stomach, heart, lung, brain and cochlea) removed for analyses. The enzyme activity in the extract was determined in 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, 37°C, for 2 minutes, using 5 mM pNPP as substrate. Tartrate (0.1 M) and pHMB (10 mM) were used as inhibitors of high and low Mr acid phosphatases, respectively. In the trated group the high and low Mr acid phosphatase were similarly inhibited (70%) in all organs, in relation to the control group. Several changes were found in the tis sue (analyzed by light microscopy) as cellular degeneration and disorganization, intracitoplasmic pigment granules,. hyperemia, increase of basophilic in the cochlea bone, etc / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sebastião Roberto Taboga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:37:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Custodio_AnaMariaGalvan_M.pdf: 4317395 bytes, checksum: 951f93aab0b057bcee52459f54707a5e (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A glândula prostática não é um órgão exclusivo do aparelho reprodutor masculino. Inicialmente conhecida como glândula de Skene, estudos demonstraram que a próstata feminina está presente em várias espécies de roedores e em humanos. Evidências embriológicas e histoquímicas comprovaram a homologia entre os dois órgãos. Em ambos os sexos, a próstata é composta por elementos epiteliais, estromais e neuroendócrinos cuja diferenciação e cujo desenvolvimento estão sob a regulação hormonal. Muitas alterações fisiopatológicas do complexo prostático masculino podem se manifestar no órgão feminino. As fosfatases ácidas são enzimas difundidas na natureza podendo ser encontradas em animais e plantas. Pertencentes à classe das hidrolases apresentam habilidade de catalisar, em condições ácidas, a hidrólise de monoesteres ortofosfato. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar a expressão da fosfatase ácida nas próstatas femininas e masculinas de Meriones unguiculatus durante as fases do desenvolvimento pós-natal. Para isso, as próstatas de 18 animais foram removidas, congeladas em nitrogênio liquido, seccionadas em criostato e submetidas à incubação com o substrato sintético f3-glicerofosfato de Sódio. O controle da reação foi obtido incubando o material sem o substrato e com o inibidor NaF (fluoreto de sódio) adicionado a este. Após a reação citoquímica, as lâminas foram contra coradas com Metil-Green para a análise à microscopia de luz. A verificação ultra-estrutural da atividade enzimática nos compartimentos celulares também foi realizada. A intensidade da atividade fosfatásica ácida pennitiu distinguir quatro categorias de marcações nas próstatas de ambos os sexos: ácinos com marcação forte, intermediária, fraca e ausente. Nossos resultados apontaram atividade fosfatásica ácida em todas as idades do desenvolvimento pós-natal. A próstata feminina apresentou maturidade biológica e funcional anterior à masculina. Em ambos os sexos, ao longo do desenvolvimento pós-natal do animal, foram verificados a dependência da atividade fosfatásica ácida aos níveis de testosterona / Abstract: The prostate gland is not an exclusive organ of the male reproductive system. lnitially known as Skene' s gland, studies have demonstrated that the female prostate is present in several rodents and in human specie. Embryological and histochemical evidences have been proposed by the homology between these organs. Secretory epithelium, connective stroma, smooth muscle cells and neuroendocrine elements compose the female and male prostate gland. Androgen levels regulate the differentiation, development and maintenance of these structures. Some pathological alterations in the prostate gland may occur in the both male and female, however the existence of this organ in the female has been neglected. Acid phosphatase is a family of enzymes that are widespread in nature, and can be found in many animal and plant species. By Gõmõri' s method, the use of the f3-glycerophosphate was employed to analyze the acid phosphatasic activity in the female and male prostates of Meriones unguiculatus gerbil during the postnatal development. Eighteen animaIs were employed and their prostates, immediately after the removal, were ITozen at liquid nitrogen, sectioned in Leica cryostat and incubated in sodium f3-glycerophosphate substrate. The controls of the reaction were obtained by incubation without the substrate and with the inhibitor sodium fluoride added at the incubation media. After the reaction, the material was stained by methyl green. The ultrastructural analyses of the acid phosphatase activity were employed. In the both sexes, the acid phosphatase reaction intensity was classified in four categories: acini with high, intermediate, low and absent acinar demarcation. Ours results revealed that the maturation of the female prostate occurs previously to the male prostate. These data reinforce the dependence, in both sexes, of the acid phosphatase activity and of the androgen levels during the postnatal development. ln addition, our results demonstrate that the female prostate is a gland functionally active in the female organism / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Eulazio Mikio Taga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T05:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Buzalaf_MariliaAfonsoRabelo_D.pdf: 5040554 bytes, checksum: 5d7774aeca4271c23aebb3bb510d14d7 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A PTP de BMr do fígado de carneiro foi purificada 1350 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 2,6%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, diálise, cromatografia de troca iônica em SP-Sephadex com eluição por íon afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os critérios de pureza utilizados foram a AE, P AGE, SDSPAGE e filtração em gel (Superdex HR 200). A enzima purificada (AE de 81,18 µmol min-1 mg-1) é composta por uma cadeia polipeptídica simples e possui Mr de 17,4 e 18,3 kDa, como determinado através de filtração em gel e SDS-PAGE, respectivamente. O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou que o pH ótimo é em tomo de 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 50°C. A energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 49,674 kJ mol-1. A adição de BSA (0,1 a 0,75 mg/mL) ao meio de reação enzimática promoveu um incremento de até 40% na atividade enzimática, sendo que concentrações maiores tiveram pouco efeito. Já a adição de BSA ao meio de diluição enzimática elevou a velocidade em até 350%, tendo provocado um ligeiro aumento na Km, praticamente sem interferir com a Ea. A atividade da enzima foi pouco sensível a diversos compostos e íons metálicos, exceto pela ativação por guanosina e inibição por SDS, ácido úrico, Ag+, Hg+, CU2+ e Zn2+. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto e inibição por vanadato (Ki de 0,097µM), fosfato inorgânico (Ki de 0,94 mM), molibdato de amônio (Kic de 12,8 µM e Kia de 2,7 µM) e pCMB. Dos substratos testados, apenas pNPP, ß-Naftil-P, Tyr-P e FMN foram hidrolisados significativamente, com Km de 0,151, 0,726, 3,873e 0,12 mM, no pH 5,0 e 1,861, 4,447, 5,673 e 0,11 mM no pH 7,0, respectivamente. Também houve hidrólise sobre o acetil-P (Km de 0,18 mM) no pH 5,0, entretanto com uma velocidade 100 vezes menor em relação ao pNPP / Abstract: A low molecular weight sheep liver phosphotyrosine protein phosphatase was purified 1350-fold to homogeneity, with 2.6% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, dialysis, SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution and molecular exclusion chromatography. The following homogeneity criteria were used: specific activity, P AGE, SDS-P AGE and gel filtration (Superdex HR 200). The purified enzyme (specific activity 81,18 µmol min-1 mg-l) contained a single peptide chain and had a relative molecular mass of 17.4 and 18.3 kDa, as determined by gel filtration chromatography and SDS-PAGE, respectively. pNPP hydrolysis cata1yzed by this enzyme had a pH optimum of 5.5 and maximal activity at 50°C. An activation energy value of 49.674 kJ mol-1 for the reaction of pNPP hydrolysis was determined from Arrhenius plot. Addition of BSA (0.1 to 0.75 mg/mL) to enzyme reaction media increased unti140% enzyme activity, but higher concentrations of BSA had a small effect. Addition of BSA to enzyme dilution media increased velocity until 350%, causing a slight increase in Km, without interfering in activation energy. Different compounds and meta1lic ions did not significant1y affect enzyme activity, except for inhibition by SDS, uric acid, Ag+, Hg+,Cu2+ and Zn2+ and activation by guanosine. Enzyme was also inhibited by vanadate (Ki, 0.097 µM), inorganic phosphate (Ki 0.94 µM), ammonium molybdate (Kic, 12.8 µM and Kia, 2.7 µM) and pCMB. Both tartrate and fluoride were very weak inhibitors. Apparent Km values obtained, at 37°C were 0.151, 0.726, 3.873 and 0.12 mM at pH 5.0 and 1.861, 4.447, 5.673 and 0.11 mM, at pH 7.0, for pNPP, ßNaftil-P, Tyr-P and FMN, respectively. Acetyl-P was also hydrolyzed CKm, 0,18 mM) at pH 5.0, but the velocity was 100 times smaller in respect to pNPP / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T05:29:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavagis_AlexandreDonizetiMartins_M.pdf: 4418052 bytes, checksum: 75d7494a0289b525b36b334f41a92428 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O objetivo central do presente trabalho foi avaliar a estabilidade conformacional da fosfatase ácida de sementes quiescentes de soja. Através de estudos de desnaturação térmica, verificou-se uma temperatura de transição (TM) de 65 oC que mostra uma resistência incomum frente à temperatura. Observaram-se efeitos da concanavalina A (lectina) e de molibdato (inibidor) no perfil de desnaturação enzimática com alterações na TM. A desnaturação enzimática por dodecilsulfato de sódio (SDS) foi muito pouco significativa em presença do fosfoenolpiruvato (PEP) como substrato. Essa insensibilidade ao agente desnaturante pode ser explicada pela alta afinidade apresentada pela fosfatase em relação ao substrato em questão. A desnaturação térmica da enzima em presença do PEP revelou que este substrato produz uma mudança significativa no perfil de desnaturação, induzindo uma diminuição na temperatura de transição (TM) que representa um efeito antagônico àquele observado na desnaturação por SDS. A análise de aminoácidos revelou informações valiosas que explicam propriedades como o pI relativamente baixo (5,0), e o número expressivo de resíduos ácidos pode estar relacionado à estabilidade conformacional da enzima. Os estudos sistemáticos da desnaturação reversível por uréia e cloreto de guanidínio (GuaCl) foram realizados utilizando-se a fluorescência como técnica de monitoramento. O cálculo da Estabilidade Conformacional (deltaG H2O) foi feito tomando-se os deslocamento nos comprimentos de onda de máxima emissão de fluorescência como parâmetro e o valor obtido foi de 2,48 kcal/mol -1. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casos. A análise de carboidratos, realizada por HPLC revelou a presença de manose, glicosamina e galactosamina e a remoção da fração de carboidratos não foi possível mesmo após tratamento com 300 mU das endoglicosidases endo-H, endo-F e endo-F1 / Abstract: The central aim of the present work was to evaluate the conformational stability of an isoform of soybean seeds acid phosphatase. Through thermal denaturation studies, the transition temperature (TM) value determined (65 oC), indicated an unusual resistance of the enzyme under high temperatures. Effects of strongly binding compounds such as concanavalin A (lectin) and molybdate (inhibitor) on the denaturation profile and transition temperature values were also observed. Enzymatic denaturation by sodium dodecyl sulfate (SDS) was insignificant in presence of phosphoenolpyruvate (PEP) which might be explained by the high affinity of the enzyme for this substrate. Thermal denaturation studies in presence of PEP showed both a significant change on the denaturation profile and a reduction on the transition temperature value. Aminoacid analysis contributed to important informations that are in accordance with some properties of the enzyme such as the relatively low isoelectric point (pI): 5.0. Furthermore, the expressive number of acid residues seems to be related to the conformational stability of the polypeptidic chain. Systematic studies of reversible denaturation by urea and guanidinium chloride (GuaCl) were carried out using fluorescence as a monitoring technique. Conformational Stability calculations were made based on the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a parameter and the value obtained was 2.48 kcal.mol-1. Calculations of the centre of mass were made as a function of the denaturating agent concentration in both cases. Carbohydrate analysis was carried out by using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) revealed mannose, glucosamine and galactosamine as main carbohydrates in the glycoconjugated structure. Carbohydrate removal was not possible even after treatment with 300 mU/mL of the endo-beta-N-acetylglucosaminidases-H, F and F1 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: João Matins Pizauro Júnior / Coorientador: Cecília Maria Costa do Amaral / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Luís Henrique Souza Guimarães / Resumo: Bactérias do gênero Enterobacter sp. são conhecidas por produzir ácidos orgânicos e solubilizar fosfato inorgânico presente no solo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a enzima fosfatase ácida ligada à membrana de Enterobacter sp. isolada de raízes de orquídeas Cyrtopodium paludicolum. A enzima ligada à membrana foi purificada por centrifugação a 100.000 x g durante uma hora a 4ºC. A atividade da p-nitrofenilfosfatase (PNFFásica) foi determinada descontinuamente a 37°C. A bactéria foi inoculada em meio de cultura líquido e a enzima foi estritamente regulada pelo fósforo, atingindo expressão máxima a 5 mM, em pH ótimo aparente de 3,5. Em relação aos inibidores avaliados, verificouse que o cobre apresentou inibição não-competitiva. Já o arsenato, vanadato e fosfato inibiram competitivamente a enzima, demonstrando que são análogos estruturais. A enzima exibiu comportamento "michaeliano" para a hidrólise do PNFF (atividade específica de 30,67 U/mg, Km = 0,55 mM e n = 1). Interações sítio-sítio foram observadas para a hidrólise do ATP (atividade específica de 11,2 U/mg, Km = 0,62 mM e n = 1,8) e para a hidrólise do pirofosfato (atividade específica de 15,64 U/mg, Km = 0,89 mM e n = 2,8). Os valores obtidos pela inativação térmica demonstraram que a enzima manteve-se estável a 45°C e a atividade enzimática diminuiu com o aumento da temperatura. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida promove aumento na disponibilidade dos nutrientes para as plantas, solubilizando minerais insolúveis através da produção de enzimas, sendo um dos mecanismos que esses microrganismos utilizam para solubilização de fosfato mineral / Abstract: Bacteria of the genus Enterobacter sp. are known as organic acid producers and are able to solubilize inorganic phosphate which is present in soil. The aim of this work was to characterize the cell-wall associated acid phosphatase of Enterobacter sp. symbionts of plants and were isolated from roots of orchid Cyrtopodium paludicolum. The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000 x g, for one hour at 4ºC and the activity from p-nitrophenilphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C Culture medium was inoculate d with bacteria and supplemented with phosphorus. Under optimal conditions (5mM phosphorus, pH 3.5) the enzyme was expressed. The activity from p-nitrophenylphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C. The enzyme presen ted Michaelis behavior for the hydrolysis of PNPP (specific activity of 30.67 U/mg, Km = 0.55 mM and n = 1). Besides site-site interactions were observed for ATP hydrolysis (specific activity of 11.2 U/mg, Km = 0.62 mM and n = 1.8) and pyrophosphate hydrolysis (specific activity of 15.64 U/mg, Km = 0.89 mM and n = 2.8). It was observed that enzyme activity decreased with increasing temperature. Inhibition studies revealed that copper inhibited the enzyme in a non-competitive manner. In contrast arsenate, and vanadate which are structural analogues of phosphate presented a competitive inhibition. The results suggest that plants expressing acid phosphatase are able to solubilize mineral phosphate and are able to hydrolyse insoluble minerals thereby increasing the availibilty of nutrients which can be used by the plant / Mestre