En aquesta tèsi s'ha avaluat l'ús de la teràpia fotodinàmica antimicrobiana (APDT) com a alternativa als antibiòtics. Inicialment, s'ha demostrat in vitro i en un model de cremades en ratolins el potencial de les fenotiazines, i més concretament del nou blau de metilè, per inactivar un bacteri resistent a antibiòtics com Acinetobacter baumanii. A més, també s'ha investigat el potencial dels porficens aril catiònics com a agents fotosensibilitzadors per a APDT in vitro i in vivo, inactivant exitosament diferents tipus de bacteris gram positius i negatius, així com fongs. Per altra banda, s'han estudiat les cinètiques de formació i decaïment d'oxigen singlet (1O2) en E. coli mitjançant un espectrofotòmetre ultrasensible a l'infraroig proper amb resolució temporal per sota del microsegon. Els resultats ens permeten profunditzar en el mecanisme de l'APDT, és a dir, en la localització del fotosensibilitzador (PS) en el bacteri i la reactivitat de l'1O2. Per un costat, l'entorn del PS canvia quan la distribució de les càrregues catiòniques varia. Per l'altre, en funció del lloc de formació, l'1O2 reacciona amb l'entorn proper o és capaç d'escapar fora de les cèl·lules. En tercer lloc, també s'ha estudiat, mitjançant sondes fluorescents i tècniques amb resolució temporal, l'habilitat d'una proteïna fluorescent per produir espècies reactives d'oxigen, actuant com a agents fotosensibilitzadors genèticament codificats. Així, s'ha calculat per primera vegada el rendiment quàntic de formació d'1O2 obtenint un valor similar al del cromòfor sintètic de les GFPs. Finalment, s'ha investigat mitjançant l'espectrofotòmetre en l'infraroig proper l'efecte plasmó produït per films d'illes de plata sobre l'1O2, demostrant un increment màxim en la luminescència d'1O2 a 1270 nm al voltant de 30 vegades en alguns casos. / En esta tesis se ha evaluado el uso la terapia fotodinámica antimicrobiana (APDT) como alternativa a los antibióticos. Inicialmente, se ha demostrado, in vitro y en un modelo de quemaduras en ratón, el potencial de las fenotiazinas, y más concretamente del nuevo azul de metileno, para inactivar una bacteria resistente a antibióticos como Acinetobacter baumanii. Además, también se ha investigado el potencial de los porficenos aril catiónicos como agentes fotosensibilizadores para APDT in vitro e in vivo, inactivando exitosamente distintos tipos de bacterias gram positivas y negativas, así como hongos. Por otro lado, se ha estudiado las cinéticas de formación y decaimiento de oxígeno singlete (1O2) en E. coli mediante un espectrofotómetro ultrasensible en el infrarrojo cercano con resolución temporal por debajo del microsegundo. Los resultados nos permiten profundizar en el mecanismo de la APDT, es decir, en la localización del fotosensibilizador (PS) en la bacteria y la reactividad del 1O2. Por un lado, el entorno del PS cambia cuando la distribución de las cargas catiónicas varía. Por otro lado, en función del lugar de formación, el 1O2 reacciona con el entorno cercano o es capaz de escapar fuera de las células. En tercer lugar, también se ha estudiado, mediante sondas fluorescentes y técnicas con resolución temporal, la habilidad de una proteína fluorescente para producir especies reactivas de oxígeno, actuando pues como agentes fotosensibilizadores genéticamente codificados. Así, se ha calculado por primera vez el rendimiento cuántico de formación de 1O2 mostrando un valor similar al del cromóforo sintético de las GFP. Finalmente, se ha investigado mediante el espectrofotómetro en el infrarojo cercano el efecto plasmon producido por films de islas de plata sobre 1O2, observando un incremento máximo de la luminiscencia de 1O2 a 1270 nm alrededor de 30 veces en algunos casos. / In this thesis, the use of antimicrobial photodynamic therapy as alternative to antibiotics has been assessed. First, the potential of phenothiazinium dyes, and specifically new methylene blue, to inactivate multidrug-resistant strains has been demonstrated against Acinetobacter baumanii in vitro and in a mouse burn model. In this regard, it also has been investigated the potential of aryl cationic porphycenes as photosensitizing drugs in APDT in vitro and in vivo, successfully inactivating different gram-positive and negative bacteria, and fungal cells.Second, the kinetics of singlet oxygen (1O2) production and fate in E. coli have been investigated by means of an ultrasensitive near-infrared spectrometer with submicrosecond time resolution. The results allowed us to gain insight into the mechanism of APDT, i.e., the localization of the photosensitiser (PS) in the bacteria and the reactivity of 1O2. On one hand, the microenvironment of the PS changes when the distribution of the cationic charges changes. On the other hand, depending on the site of production, 1O2 reacts with the nearest microenvironment or is able to escape out of the cells. Third, the ability of fluorescent proteins (GFPs), as genetically-encoded photosensitisers, to produce reactive oxygen species has been studied by means of fluorescent probes and time-resolved techniques. Thus, for the first time, the quantum yield of 1O2 production of some of the studied proteins has been calculated showing a value similar to that of the synthetic GFP chromophore.Finally, the plasmonic effect of silver island films on 1O2 has been investigated using the near-infrared spectrometer, demonstrating a maximum enhancement of the 1O2 luminescence signal at 1270 nm ca. 30-fold in some cases.

S'ha estudiat la cinètica de fotosensibilització de l'oxigen singlet (1O2) en cèl·lules eucariotes en suspensió mitjançant un espectròmetre d'última generació amb resolució temporal per sota del microsegon. Els estudis revelen que la cinètica del 1O2 depèn del seu lloc de formació. Per una banda, la producció del 1O2 es més lenta en els lisosomes que en el nucli. Per altra banda, el 1O2 es capaç d'escapar de les cèl·lules quan es fotosensibilitza en el nucli, però es queda confinat al interior si es fotosensibilitza en els lisosomes. Malgrat que el temps de vida del 1O2 es troba en els microsegons, la desactivació principal ve donada per interaccions amb les biomolècules característiques de cadascú dels orgànuls. La incertesa respecte a la producció de 1O2 en un orgànul determinat es pot eliminar mitjançant l'ús de fotosensibilitzadors modificats genèticament, ja que aquets poden ésser expressats selectivament. Amb aquesta finalitat, s'avaluen les propietats fotosensibilitzants de mutants de proteïna fluorescent verd (GFP). Algunes de les GFPs estudiades sensibilitzen la formació del 1O2 malgrat amb baixa eficiència. Els resultats obtinguts es comparen amb els del cromòfor de la GFP i mostren que l'estructura proteínica, a sobre de modular les propietats fotofísiques del cromòfor, també el protegeix de la desactivació col·lisional. Finalment, s'estudien les propietats d'absorció bifotónica del 2,7,12,17-tetrafenilporficé i del seu complex de pal·ladi (II). L'eficiència de formació del 1O2 per part dels dos compostos, desprès de l'absorció simultània de dos fotons, es aproximadament 100 vegades superior a la dels seus anàlegs porfirínics, amb seccions d'absorció bifotòniques δ ~ 25 GM. Les excel·lents propietats d'aquestos compostos s'expliquen mitjançant arguments qualitatius i s'analitzen les seves perspectives de cara al seu ús en teràpia fotodinámica. / Se ha estudiado la cinética de fotosensibilización de 1O2 en células eucariotas en suspensión, usando un espectrómetro de última generación con resolución temporal por debajo del microsegundo. Los estudios revelan que la cinética del 1O2 depende de su lugar de formación. Por una parte, la producción de 1O2 es más lenta en los lisosomas que en el núcleo. Por otra parte, el 1O2 es capaz de escapar de las células cuando es fotosensibilizado en el núcleo, mientras que queda confinado en el interior si se fotosensibiliza en los lisosomas. A pesar de que el tiempo de vida del 1O2 se encuentra en los microsegundos, la desactivación principal viene dada por interacciones con las biomoléculas características de cada orgánulo. La incertidumbre respecto a la producción de 1O2 en un orgánulo determinado puede ser eliminada mediante el uso de fotosensibilizadores modificados genéticamente ya que pueden ser expresados selectivamente. Con este fin, se evalúan las propiedades fotosensibilizantes de mutantes de proteína fluorescente verde (GFP). Algunas de las GFPs estudiadas sensibilizan la formación de 1O2 aunque con baja eficiencia. Los resultados obtenidos se comparan con los del cromóforo de la GFP y muestran que la estructura proteínica, además de modular las propiedades fotofísicas del cromofóro, también lo protege de la desactivación colisional. Finalmente, se estudian las propiedades de absorción bifotónica del 2,7,12,17-tetrafenilporficeno y de su complejo de paladio (II). La eficacia de formación de 1O2 de ambos compuestos, tras la absorción simultánea de dos fotones, es aproximadamente 100 veces superior a la de sus análogos porfirínicos, con secciones de absorción bifotónica δ ~ 25 GM. Las excelentes propiedades de estos compuestos se explican mediante argumentos cualitativos y se analizan sus perspectivas de cara a su uso en terapia fotodinámica. / The kinetics of singlet oxygen (1O2) photosensitisation in human skin fibroblasts have been investigated by means of an ultrasensitive near-infrared spectrometer with submicrosecond time resolution. The results indicate that the 1O2 kinetics are site-dependent. On one hand, the production of 1O2 is slower in the lysosomes than in the nucleus. On the other hand, 1O2 is able to escape out of the cells when photosensitised in the nucleus, while 1O2 photosensitized in the lysosomes is confined. Despite showing a lifetime in the microsecond time domain, the decay of 1O2 is governed by interactions with the biomolecules within the organelle there it is produced. The uncertainty as to the intracellular site of 1O2 production may be removed by the use of genetically-encoded photosensitisers, which can be expressed in any desired organelle. Towards this end, the ability of some fluorescent proteins (GFPs) to photosensitise 1O2 has been studied. Some of the studied proteins are able to produce 1O2 albeit with a very low quantum yield. The results obtained are compared to those of the synthetic GFP chromophore and indicates that the protein scaffold not only plays a role in modulating the photophysical properties of the chromophore but also has a protective function from collisional quenching. Finally, the two-photon absorption properties of tetraphenylporphycene and its palladium (II) complex have been determined. These compounds are ca. 100-fold more efficient two-photon 1O2 photosensitisers than their isomeric porphyrin counterparts, with two-photon absorption cross sections δ ~ 25 GM. Qualitative symmetry-based arguments are provided to explain the excellent two-photon properties and the prospects for photodynamic therapy are discussed.