As células mesenquimais estromais multipotentes (CMM) são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e na terapia celular. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos (0,01%-0,0005%) e às elevadas doses necessárias para uma infusão (aproximadamente 106 células/Kg paciente) tornou-se necessário o desenvolvimento de tecnologias de expansão in vitro, eficientes e de custo reduzido, que permitam a obtenção de CMM com manutenção das características funcionais (diferenciação e inibição da proliferação de linfócitos), imunofenotípicas e citogenéticas. As CMM são células aderentes, ou seja, necessitam de um substrato sólido para se aderir e proliferar. O procedimento convencional de expansão em garrafas estáticas, geralmente envolve um processo laborioso em que não há correto controle e monitoramento dos parâmetros de cultivo e possui uma maior susceptibilidade à contaminação devido à excessiva manipulação para atingir o número ideal de células. Além disso, este tipo de cultivo não permite uma produção em larga escala. Em função disso, o presente trabalho foi proposto com o objetivo de desenvolver um bioprocesso escalonável, economicamente viável e eficiente para expansão de CMM derivadas da medula óssea em microcarregadores. Para isso, as células foram cultivadas em microcarregador Cyotdex 3, em frasco spinner com o meio -MEM suplementado com 15% de SFB. Foram avaliadas neste trabalho, a adesão celular aos microcarregadores, crescimento, metabolismo, recuperação celular final e avaliação das propriedades funcionais e imunofenotípicas pré e pós cultivo, comparando ao cultivo já estabelecido em garrafas estáticas. De maneira geral, os resultados obtidos mostraram que foi possível expandir CMM utilizando a tecnologia de microcarregadores. A análise do metabolismo celular mostrou que não houve exaustão de nutrientes importantes como glicose e glutamina durante o cultivo, tampouco formação dos subprodutos lactato e amônia em concentrações inibitórias. As células recuperadas após a expansão mantiveram as características imunofenotípicas e funcionais. A produção média (n=10) foi de aproximadamente 4,9x105 cel/mL. Como o sistema utilizado permite o escalonamento, se utilizássemos um biorreator de 1L, seria possível a produção de aproximadamente 5x108 células que seriam suficientes para tratar mais de 3 pacientes de até 70Kg na dose de 2x106 células/Kg. Para expansão da mesma quantidade de células na forma tradicional seriam necessárias 135 garrafas de 175 cm2 com um custo total de expansão duas vezes superior à estimativa do custo de expansão utilizando microcarregadores. / Multipotent mesenchymal stromal cells are currently an attractive source for applications in tissue engineering and cell therapy. Due to the low availability in tissues (0,01%-0,0005%) and the high doses necessary for an infusion (about 106 cells/Kg patient), it has become necessary the development of effective and low cost technologies for in vitro expansion that enable to obtain MSC with maintenance of functional (differentiation and inhibition of lymphocytes proliferation), immunophenotypic and cytogenetics characteristics. MSC are adherent cells, i.e., they need a solid substrate to adhere and proliferate. The conventional procedure for expansion in static flasks normally involves a laborious process in which there is no suitable control and monitoring of the cultivation parameters besides presenting a higher susceptibility to contamination due to excessive manipulation to reach the ideal amount of cells. Moreover, this kind of cultivation does not allow a large scale production. For this reason, this work was proposed with the objective to develop a low cost, effective and scalable bioprocess for expansion of bone marrow-derived MSC in microcarriers. Cells grew on microcarriers Cyotdex 3, in spinner flasks with the -MEM medium supplemented with 15% FBS. We evaluated the cell adhesion to microcarriers, growth, metabolism, final cell recovery, and the functional and immunophenotypic properties before and after cultivation, comparing them with the cultivation already established in static flasks. In general, the results obtained showed that it was possible to expand MSC using microcarriers technology. The analysis of the cell metabolism showed that there was no depletion of important nutrients such as glucose and glutamine during cultivation, neither formation of lactate and ammonia subproducts in inhibitory concentrations. The cells recovered after the expansion kept the immunophenotypic and functional characteristics. The mean production (n=10) was about 4,9x105 cel/mL. As the system used allows the scale-up, if we had used a bioreactor of 1L it would had been possible to produce approximately 5x108 cells that would be enough to treat more than three patients of up to 70kg with a dose of 2x106 cells/kg. For the expansion of the same amount of cells in the traditional way, it would be necessary 135 T-flasks of 175 cm2 with total cost twice higher than the estimate cost of expansion using microcarriers.

As células mesenquimais estromais multipotentes (CMM) são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e na terapia celular. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos (0,01%-0,0005%) e às elevadas doses necessárias para uma infusão (aproximadamente 106 células/Kg paciente) tornou-se necessário o desenvolvimento de tecnologias de expansão in vitro, eficientes e de custo reduzido, que permitam a obtenção de CMM com manutenção das características funcionais (diferenciação e inibição da proliferação de linfócitos), imunofenotípicas e citogenéticas. As CMM são células aderentes, ou seja, necessitam de um substrato sólido para se aderir e proliferar. O procedimento convencional de expansão em garrafas estáticas, geralmente envolve um processo laborioso em que não há correto controle e monitoramento dos parâmetros de cultivo e possui uma maior susceptibilidade à contaminação devido à excessiva manipulação para atingir o número ideal de células. Além disso, este tipo de cultivo não permite uma produção em larga escala. Em função disso, o presente trabalho foi proposto com o objetivo de desenvolver um bioprocesso escalonável, economicamente viável e eficiente para expansão de CMM derivadas da medula óssea em microcarregadores. Para isso, as células foram cultivadas em microcarregador Cyotdex 3, em frasco spinner com o meio -MEM suplementado com 15% de SFB. Foram avaliadas neste trabalho, a adesão celular aos microcarregadores, crescimento, metabolismo, recuperação celular final e avaliação das propriedades funcionais e imunofenotípicas pré e pós cultivo, comparando ao cultivo já estabelecido em garrafas estáticas. De maneira geral, os resultados obtidos mostraram que foi possível expandir CMM utilizando a tecnologia de microcarregadores. A análise do metabolismo celular mostrou que não houve exaustão de nutrientes importantes como glicose e glutamina durante o cultivo, tampouco formação dos subprodutos lactato e amônia em concentrações inibitórias. As células recuperadas após a expansão mantiveram as características imunofenotípicas e funcionais. A produção média (n=10) foi de aproximadamente 4,9x105 cel/mL. Como o sistema utilizado permite o escalonamento, se utilizássemos um biorreator de 1L, seria possível a produção de aproximadamente 5x108 células que seriam suficientes para tratar mais de 3 pacientes de até 70Kg na dose de 2x106 células/Kg. Para expansão da mesma quantidade de células na forma tradicional seriam necessárias 135 garrafas de 175 cm2 com um custo total de expansão duas vezes superior à estimativa do custo de expansão utilizando microcarregadores. / Multipotent mesenchymal stromal cells are currently an attractive source for applications in tissue engineering and cell therapy. Due to the low availability in tissues (0,01%-0,0005%) and the high doses necessary for an infusion (about 106 cells/Kg patient), it has become necessary the development of effective and low cost technologies for in vitro expansion that enable to obtain MSC with maintenance of functional (differentiation and inhibition of lymphocytes proliferation), immunophenotypic and cytogenetics characteristics. MSC are adherent cells, i.e., they need a solid substrate to adhere and proliferate. The conventional procedure for expansion in static flasks normally involves a laborious process in which there is no suitable control and monitoring of the cultivation parameters besides presenting a higher susceptibility to contamination due to excessive manipulation to reach the ideal amount of cells. Moreover, this kind of cultivation does not allow a large scale production. For this reason, this work was proposed with the objective to develop a low cost, effective and scalable bioprocess for expansion of bone marrow-derived MSC in microcarriers. Cells grew on microcarriers Cyotdex 3, in spinner flasks with the -MEM medium supplemented with 15% FBS. We evaluated the cell adhesion to microcarriers, growth, metabolism, final cell recovery, and the functional and immunophenotypic properties before and after cultivation, comparing them with the cultivation already established in static flasks. In general, the results obtained showed that it was possible to expand MSC using microcarriers technology. The analysis of the cell metabolism showed that there was no depletion of important nutrients such as glucose and glutamine during cultivation, neither formation of lactate and ammonia subproducts in inhibitory concentrations. The cells recovered after the expansion kept the immunophenotypic and functional characteristics. The mean production (n=10) was about 4,9x105 cel/mL. As the system used allows the scale-up, if we had used a bioreactor of 1L it would had been possible to produce approximately 5x108 cells that would be enough to treat more than three patients of up to 70kg with a dose of 2x106 cells/kg. For the expansion of the same amount of cells in the traditional way, it would be necessary 135 T-flasks of 175 cm2 with total cost twice higher than the estimate cost of expansion using microcarriers.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3854.pdf: 3648790 bytes, checksum: 7cf8d19b11b10f9d50e9f3a326c8d0db (MD5) Previous issue date: 2010-10-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / The Mesenchymal Stem Cells (MSCs) from adult tissues are at present an attractive source for applications in tissue engineering and cellular therapies. It presents a potential to differentiate into different cell lines as adipocytes, chondrocytes, osteocytes and myocytes. Due to low availability in the tissues and the fact that the demand for therapeutic applications is much larger than the supply capacity has become necessary to expand them in vitro strongly dependent on conservation of their differentiation potential. The MSCs are anchorage dependent, they have the characteristic of adhering to a solid substrate for subsequent proliferation. The conventional procedure of expansion in T-flasks with growth in monolayers, usually involves a difficult monitoring and control process, with high contamination indexi, low cell yield and high cost. In this work, we evaluated a methodology of expansion of hMSC-TERT line in spinner flask with microcarriers (small particles with properties favorable for cell adhesion and proliferation). In the experiments, two type of microcarriers were used, Cytodex 1 non-porous and with positive electric charge and Cultispher S, macroporous and electrically neutral, both in stirred spinner flask of 100 mL in culture medium α-MEM with 15% fetal calf serum, maintained in a CO2 incubator at 37°C and pH between 7.2 and 7.4. To increase productivity, some strategies were adopted during the research as a nutritional balance of the culture medium, addition of microcarriers and dilution and/or replacement of medium during cultivation. Aided by analysis of metabolites by high performance liquid chromatography and optical microscopy, the results showed that it was possible to grow hMSC-TERT with two microcarriers while maintaining good conditions for growth in three dimensions. However, the cell yield was limited mainly by the formation of clusters of microcarriers/extracellular matrix and is possible to obtain a cellular expansion factor of 4.98 with Cytodex 1 and 9,70 with Cultispher S. Because of the easy recovery of the cell showed by later microcarrier, it was performed an analysis of the maintenance of antigenic phenotype by flow cytometry and induction of differentiation into adipocytes and osteocytes. The results confirmed the conversation of phenotypic characteristics of hMSC-TERT with the cultivation technique evaluated in this work. / As Células-Tronco Mesenquimais (CTMs) de tecido adulto são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e em terapias celulares. Apresentam um potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares como adipócitos, condrócitos, osteócitos e miócitos. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos e ao fato da demanda para aplicações terapêuticas ser muito maior do que a capacidade de fornecimento tornou-se necessária sua expansão in vitro fortemente condicionada à conservação do seu potencial de diferenciação. As CTMs são dependentes de ancoramento, ou seja, possuem a característica de aderir a um substrato sólido para posterior proliferação. O procedimento convencional de expansão em frascos T, com crescimento em monocamadas, geralmente envolve um processo de difícil monitoramento e controle, com maior índice de contaminação, de baixo rendimento celular e de alto custo. No presente trabalho, avaliou-se uma metodologia de expansão da linhagem hMSC-TERT em frasco spinner com microcarregadores (pequenas partículas com propriedades favoráveis para adesão e proliferação celular). Nos cultivos foram utilizados dois tipos de microcarregadores, Cytodex 1, não poroso e com carga elétrica positiva, e Cultispher S, macroporoso e eletricamente neutro, ambos em frasco spinner agitado de 100 mL, com o meio de cultura α-MEM com 15% de soro fetal bovino, mantidos em incubadora de CO2 a 37ºC e pH entre 7,2 e 7,4. Para aumentar a produtividade celular, algumas estratégias foram adotadas durante a pesquisa como balanceamento nutricional do meio de cultura, adição de microcarregadores e a diluição e/ou a troca do meio durante o cultivo. Auxiliado pela análise de metabólitos por cromatografia líquida de alta eficiência e por microscopia ótica, os resultados obtidos mostraram que foi possível cultivar as CTMs com os dois microcarregadores mantendo boas condições para o crescimento tridimensional. Contudo, o rendimento celular foi limitado, principalmente, pela formação de aglomerados de microcarregadores/matriz extracelular sendo possível obter um fator de expansão celular de 4,98 com o Cytodex 1 e de 9,70 com o Cultispher S. A fácil recuperação da célula, vantagem oferecida por este microcarregador, foi aproveitada para realizar a análise da manutenção do fenótipo antigênico por citometria de fluxo e por indução da diferenciação em adipócitos e osteócitos. Os resultados comprovaram a conservação das características fenotípicas da hMSC-TERT com a técnica de cultivo avaliada neste trabalho.