A proteína de choque térmico Hsp90 é uma chaperone molecular encontrada no citosol. O cDNA incompleto desta proteína foi isolado de uma biblioteca construída a partir de mRNA de células de esporulação de B. emersonii submetidas a choque térmico. Um clone genômico contendo a seqüência completa do gene hsp90 também foi isolado, seqüenciado e caracterizado. A região codificadora do gene hsp90 é interrompida por um único íntron de 184 nucleotídeos. A seqüência de aminoácidos deduzida indicou uma proteína de 71 O resíduos, com massa molecular calculada de 80.792 Da e um pl médio de 4,85. Experimentos de extensão de oligonucleotídeo e RACE-PCR demonstraram um sítio único de início de transcrição localizado a -65 e -70 nucleotídeos do ATG da metionina iniciadora, respectivamente. Motivos similares ao consenso do elemento de choque térmico eucariótico (HSE) e do elemento responsivo a estresse (STRE) foram encontrados na região promotora do gene a -395 e -98 nucleotídeos do ATG, respectivamente. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para a Hsp90 apresenta níveis máximos aos 90 minutos da fase de esporulação do fungo. Análise por \"western blot\" mostrou que a proteína Hsp90 está presente durante todo o ciclo de vida do fungo e os níveis máximos de acúmulo foram observados aos 90 minutos da esporulação, indicando um controle transcricional do gene. Tanto a proteína quanto o mRNA são altamente induzidos quando as células são submetidas a choque térmico e a cádmio. As proteínas Hsp60 e Hsp10 são chaperones moleculares mitocondriais (chaperoninas). Os cDNAs completos destas proteínas foram isolados e totalmente seqüenciados. A seqüência de aminoácidos deduzida da Hsp60 corresponde a uma proteína de 559 resíduos, com massa molecular calculada em 58.741 Da e um pl médio de 8, 7. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para Hsp60 tem níveis máximos de expressão aos 90 minutos da esporulação. Análise por \"western blot\" mostrou que a Hsp60 está presente durante todo o ciclo de vida do fungo, com níveis máximos da proteína 90 minutos após a indução da esporulação. Tanto a proteína quanto o mRNA são bastante induzidos quando as células são submetidas ao choque térmico. A seqüência de aminoácidos deduzida da Hsp10 corresponde um polipeptídeo de 101 resíduos com massa molecular calculada em 10.688 Da e um pl médio de 6,25. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para Hsp10 tem níveis máximos de expressão aos 120 minutos da germinação e é bastante induzido quando as células são submetidas ao choque térmico. / The heat shock protein 90 (Hsp90) is a cytosolic molecular chaperone. The incomplete cDNA of this protein was isolated by immunoblot screening of a heat shock cDNA expression library. The complete genomic clone was also isolated and completely sequenced and characterized. The coding sequence is interrupted by a single intron with 184 nucleotides. The deduced amino acid sequence corresponds to a 710-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 80,792 Da and an average pl of 4.85. Primer extension and RACE-PCR experiments demonstrated a single transcription start site localized -65 and -70 nucleotides from de ATG of the initiator methionine, respectively. Sequence motifs resembling the standard eukaryotic heat shock element (HSE) and the stress responsive element (STRE) were evident in the regulatory region -395 and -98 nucleotides from de ATG, respectively. Northern blot analysis revealed that the Hsp90 mRNA presents maximum levels by 90 minutes of the sporulation stage. Immunoblot analysis indicated that the Hsp90 is present during the entire life cycle of the fungus and maximum levels were observed 90 minutes after the induction of sporulation, indicating a transcriptional control. During heat shock both the mRNA and the Hsp90 protein are highly induced. Proteins Hsp60 and Hsp10, are mitochondrial molecular chaperones (chaperonines). The complete cDNAs encoding these proteins were and completely sequenced. The deduced amino acid sequence for Hsp60 corresponds to a 559-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 58,741 Da and an average pl of 8.7. Immunoblot analysis showed that Hsp60 is present during the entire life cycle of the fungus and presents maximum levels by 90 minutes of the sporulation. Northern blot analysis indicated maximum levels of the Hsp60 mRNA by 90 minutes of sporulation too. Both mRNA and the protein are highly induced during heat shock. The deduced amino acid sequence for Hsp10 corresponds to a 101-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 10,688 Da and an average pl of 6.25. Northern blot analysis indicated maximum mRNA levels by 120 minutes of germination and high levels of expression when the cells are exposed to heat shock.

Blastocladiella emersonii é um fungo aquático da classe dos quitridiomicetos, notável pelas mudanças morfogenéticas que ocorrem durante o seu ciclo de vida. Neste trabalho isolamos 8.495 seqüências expressas (ESTs) deste fungo, que representam 3.226 seqüências únicas putativas. Destas seqüências, 37% foram classificadas segundo o processo biológico onde estariam envolvidas, de acordo com o sistema de anotação do Gene Ontology (GO). Analisamos os perfis de expressão in silico das ESTs usando estatística Bayesiana e os resultados obtidos foram validados por Northern blot para sete perfis de expressão selecionados. Pudemos encontrar boa correlação entre vários padrões de expressão e determinados processos biológicos. Foram selecionadas algumas seqüências potencialmente envolvidas com a esporulação do fungo para melhor caracterização. Analisamos a expressão de dois genes codificando centrinas (BeCenl e BeCen2) pertencentes a subfamílias distintas. Centrinas são proteínas ligantes de cálcio envolvidas em diferentes processos como o direcionamento do aparelho flagelar e a duplicação dos centros organizadores de microtúbulos (MTOCs). Observamos que os níveis da proteína BeCenl, que não havia sido descrita em fungos, apresentam um máximo aos 150 min da esporulação, defasado do pico de expressão do seu mRNA que ocorre aos 90 min deste estágio. A proteína BeCen2 está presente em níveis constantes durante todo a ciclo de vida do fungo, embora o seu mRNA apresente um pico de expressão aos 120 min da esporulação. Experimentos de imunofluorescência localizaram a proteína BeCenl no citoplasma e no corpo basal do zoósporo. Estes dados sugerem que BeCenl atue na re-orientação e movimento dos corpos basais e BeCen2 na duplicação dos MTOCs. Investigamos também a expressão de dois genes codificando proteína-quinases dependentes de ciclina putativas (BeCdkl e BeCdk2). Apenas uma Cdk (Cdkl) foi descrita em fungos como diretamente envolvida no controle do ciclo celular. Ambos os genes apresentam expressão diferencial, com níveis máximos de mRNA para os dois casos aos 90 min da esporulação. Por outro lado, a proteína BeCdkl está presente durante todo o ciclo de vida do fungo e foi localizada no núcleo e no capacete nuclear dos zoósporos. Um transportador putativo de hexose (Bemst) foi também analisado, com base na regulação por glicose de genes envolvidos com o ciclo celular observada em eucariotos. Verificou-se que os níveis do mRNA de Bemst diminuem drasticamente durante a esporulação, mas glicose ou outras hexoses não afetaram a expressão de Bemst. / Blastocladiella emersonii is an aquatic fungus that belongs to the class of chytridiomycetes, notable for the morphogenetic processes which occur during its life cycle. In this work we have isolated 8,495 expressed sequence tags (ESTs) from this fungus, representing 3,226 putative unigenes. From these unigenes, 37% were classified into a biological process, as a result of Gene Ontology (GO) annotation. Furthermore, we analyzed the expression profile in silico of each transcript using Bayesian Statistics and seven of these profiles were validated by Northern blot analysis. In addition, we found a good correlation between several of these expression patterns and certain biological processes. Some ESTs potentially involved in the sporulation of the fungus were selected to be further characterized. We analyzed the expression of two genes encoding two centrins (BeCenl and BeCen2) of distinct subfamilies. Centrins are calcium-binding proteins involved in different processes such as basal body orientation and duplication of the microtubuleorganizing centers (MTOCs). The amount of BeCenl, a centrin ortholog not previously described in fungi, presents a maximum at 150 min of sporulation, whereas the peak of its mRNA occurs at 90 min of this stage. Protein BeCen2 presents constant levels during the entire life cycle of the fungus, even though its mRNA shows a peak of expression at 120 min of sporulation. In addition, immunofluorescent studies localized BeCenl in the cytoplasm and the basal body of zoospores. These results suggest that BeCenl plays a role in re-orientation and movement of basal bodies and BeCen2 in MTOCs duplication. We also investigated the expression of two genes encoding putative cyclin-dependent protein kinases (BeCdkl and BeCdk2). Only one type of Cdk (Cdkl) directly involved in cell cycle control has been described in other fungi. Both genes were found to be differentially expressed, with maximum mRNA levels being detected in either case at 90 min of sporulation. In contrast, BeCdk1 is present throughout the life cycle of the fungus and was immunolocalized in the nuc1eus and the nuclear cap of zoospores. A putative hexose transporter (Bemst) was also investigated, taking into account the regulation by glucose of cell cycle controlled genes in eukaryotes. We found that Bemst mRNA levels decrease drastically during sporulation, but glucose and other hexoses had no effect on Bemst expression.

A proteína de choque térmico Hsp90 é uma chaperone molecular encontrada no citosol. O cDNA incompleto desta proteína foi isolado de uma biblioteca construída a partir de mRNA de células de esporulação de B. emersonii submetidas a choque térmico. Um clone genômico contendo a seqüência completa do gene hsp90 também foi isolado, seqüenciado e caracterizado. A região codificadora do gene hsp90 é interrompida por um único íntron de 184 nucleotídeos. A seqüência de aminoácidos deduzida indicou uma proteína de 71 O resíduos, com massa molecular calculada de 80.792 Da e um pl médio de 4,85. Experimentos de extensão de oligonucleotídeo e RACE-PCR demonstraram um sítio único de início de transcrição localizado a -65 e -70 nucleotídeos do ATG da metionina iniciadora, respectivamente. Motivos similares ao consenso do elemento de choque térmico eucariótico (HSE) e do elemento responsivo a estresse (STRE) foram encontrados na região promotora do gene a -395 e -98 nucleotídeos do ATG, respectivamente. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para a Hsp90 apresenta níveis máximos aos 90 minutos da fase de esporulação do fungo. Análise por \"western blot\" mostrou que a proteína Hsp90 está presente durante todo o ciclo de vida do fungo e os níveis máximos de acúmulo foram observados aos 90 minutos da esporulação, indicando um controle transcricional do gene. Tanto a proteína quanto o mRNA são altamente induzidos quando as células são submetidas a choque térmico e a cádmio. As proteínas Hsp60 e Hsp10 são chaperones moleculares mitocondriais (chaperoninas). Os cDNAs completos destas proteínas foram isolados e totalmente seqüenciados. A seqüência de aminoácidos deduzida da Hsp60 corresponde a uma proteína de 559 resíduos, com massa molecular calculada em 58.741 Da e um pl médio de 8, 7. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para Hsp60 tem níveis máximos de expressão aos 90 minutos da esporulação. Análise por \"western blot\" mostrou que a Hsp60 está presente durante todo o ciclo de vida do fungo, com níveis máximos da proteína 90 minutos após a indução da esporulação. Tanto a proteína quanto o mRNA são bastante induzidos quando as células são submetidas ao choque térmico. A seqüência de aminoácidos deduzida da Hsp10 corresponde um polipeptídeo de 101 resíduos com massa molecular calculada em 10.688 Da e um pl médio de 6,25. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para Hsp10 tem níveis máximos de expressão aos 120 minutos da germinação e é bastante induzido quando as células são submetidas ao choque térmico. / The heat shock protein 90 (Hsp90) is a cytosolic molecular chaperone. The incomplete cDNA of this protein was isolated by immunoblot screening of a heat shock cDNA expression library. The complete genomic clone was also isolated and completely sequenced and characterized. The coding sequence is interrupted by a single intron with 184 nucleotides. The deduced amino acid sequence corresponds to a 710-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 80,792 Da and an average pl of 4.85. Primer extension and RACE-PCR experiments demonstrated a single transcription start site localized -65 and -70 nucleotides from de ATG of the initiator methionine, respectively. Sequence motifs resembling the standard eukaryotic heat shock element (HSE) and the stress responsive element (STRE) were evident in the regulatory region -395 and -98 nucleotides from de ATG, respectively. Northern blot analysis revealed that the Hsp90 mRNA presents maximum levels by 90 minutes of the sporulation stage. Immunoblot analysis indicated that the Hsp90 is present during the entire life cycle of the fungus and maximum levels were observed 90 minutes after the induction of sporulation, indicating a transcriptional control. During heat shock both the mRNA and the Hsp90 protein are highly induced. Proteins Hsp60 and Hsp10, are mitochondrial molecular chaperones (chaperonines). The complete cDNAs encoding these proteins were and completely sequenced. The deduced amino acid sequence for Hsp60 corresponds to a 559-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 58,741 Da and an average pl of 8.7. Immunoblot analysis showed that Hsp60 is present during the entire life cycle of the fungus and presents maximum levels by 90 minutes of the sporulation. Northern blot analysis indicated maximum levels of the Hsp60 mRNA by 90 minutes of sporulation too. Both mRNA and the protein are highly induced during heat shock. The deduced amino acid sequence for Hsp10 corresponds to a 101-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 10,688 Da and an average pl of 6.25. Northern blot analysis indicated maximum mRNA levels by 120 minutes of germination and high levels of expression when the cells are exposed to heat shock.

Blastocladiella emersonii é um fungo aquático da classe dos quitridiomicetos, notável pelas mudanças morfogenéticas que ocorrem durante o seu ciclo de vida. Neste trabalho isolamos 8.495 seqüências expressas (ESTs) deste fungo, que representam 3.226 seqüências únicas putativas. Destas seqüências, 37% foram classificadas segundo o processo biológico onde estariam envolvidas, de acordo com o sistema de anotação do Gene Ontology (GO). Analisamos os perfis de expressão in silico das ESTs usando estatística Bayesiana e os resultados obtidos foram validados por Northern blot para sete perfis de expressão selecionados. Pudemos encontrar boa correlação entre vários padrões de expressão e determinados processos biológicos. Foram selecionadas algumas seqüências potencialmente envolvidas com a esporulação do fungo para melhor caracterização. Analisamos a expressão de dois genes codificando centrinas (BeCenl e BeCen2) pertencentes a subfamílias distintas. Centrinas são proteínas ligantes de cálcio envolvidas em diferentes processos como o direcionamento do aparelho flagelar e a duplicação dos centros organizadores de microtúbulos (MTOCs). Observamos que os níveis da proteína BeCenl, que não havia sido descrita em fungos, apresentam um máximo aos 150 min da esporulação, defasado do pico de expressão do seu mRNA que ocorre aos 90 min deste estágio. A proteína BeCen2 está presente em níveis constantes durante todo a ciclo de vida do fungo, embora o seu mRNA apresente um pico de expressão aos 120 min da esporulação. Experimentos de imunofluorescência localizaram a proteína BeCenl no citoplasma e no corpo basal do zoósporo. Estes dados sugerem que BeCenl atue na re-orientação e movimento dos corpos basais e BeCen2 na duplicação dos MTOCs. Investigamos também a expressão de dois genes codificando proteína-quinases dependentes de ciclina putativas (BeCdkl e BeCdk2). Apenas uma Cdk (Cdkl) foi descrita em fungos como diretamente envolvida no controle do ciclo celular. Ambos os genes apresentam expressão diferencial, com níveis máximos de mRNA para os dois casos aos 90 min da esporulação. Por outro lado, a proteína BeCdkl está presente durante todo o ciclo de vida do fungo e foi localizada no núcleo e no capacete nuclear dos zoósporos. Um transportador putativo de hexose (Bemst) foi também analisado, com base na regulação por glicose de genes envolvidos com o ciclo celular observada em eucariotos. Verificou-se que os níveis do mRNA de Bemst diminuem drasticamente durante a esporulação, mas glicose ou outras hexoses não afetaram a expressão de Bemst. / Blastocladiella emersonii is an aquatic fungus that belongs to the class of chytridiomycetes, notable for the morphogenetic processes which occur during its life cycle. In this work we have isolated 8,495 expressed sequence tags (ESTs) from this fungus, representing 3,226 putative unigenes. From these unigenes, 37% were classified into a biological process, as a result of Gene Ontology (GO) annotation. Furthermore, we analyzed the expression profile in silico of each transcript using Bayesian Statistics and seven of these profiles were validated by Northern blot analysis. In addition, we found a good correlation between several of these expression patterns and certain biological processes. Some ESTs potentially involved in the sporulation of the fungus were selected to be further characterized. We analyzed the expression of two genes encoding two centrins (BeCenl and BeCen2) of distinct subfamilies. Centrins are calcium-binding proteins involved in different processes such as basal body orientation and duplication of the microtubuleorganizing centers (MTOCs). The amount of BeCenl, a centrin ortholog not previously described in fungi, presents a maximum at 150 min of sporulation, whereas the peak of its mRNA occurs at 90 min of this stage. Protein BeCen2 presents constant levels during the entire life cycle of the fungus, even though its mRNA shows a peak of expression at 120 min of sporulation. In addition, immunofluorescent studies localized BeCenl in the cytoplasm and the basal body of zoospores. These results suggest that BeCenl plays a role in re-orientation and movement of basal bodies and BeCen2 in MTOCs duplication. We also investigated the expression of two genes encoding putative cyclin-dependent protein kinases (BeCdkl and BeCdk2). Only one type of Cdk (Cdkl) directly involved in cell cycle control has been described in other fungi. Both genes were found to be differentially expressed, with maximum mRNA levels being detected in either case at 90 min of sporulation. In contrast, BeCdk1 is present throughout the life cycle of the fungus and was immunolocalized in the nuc1eus and the nuclear cap of zoospores. A putative hexose transporter (Bemst) was also investigated, taking into account the regulation by glucose of cell cycle controlled genes in eukaryotes. We found that Bemst mRNA levels decrease drastically during sporulation, but glucose and other hexoses had no effect on Bemst expression.