Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est la forme de cancer gynécologique la plus létale. Ainsi, la compréhension des changements moléculaires associés à ce cancer métastatique ovarien peut mener à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques essentielles. La glycosylation, une modification post-traductionnelle, joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires. Cette glycosylation participe à des événements physiopathologiques majeurs durant la progression tumorale. De plus, il a été prouvé que l’expression aberrante des structures glycanes interfère avec des mécanismes cellulaires comme l’adhésion, la migration et la prolifération des cellules. Dans ce contexte, notre laboratoire a récemment montré que le gène codant pour la protéine N-acétylgalactosaminyltransférase 3 (GALNT3), membre de la famille des GalNAcTransférases (GalNAc-Ts), est hypométhylé et que la protéine GALNT3 est plus fortement exprimée dans les tumeurs CEO dont la sévérité est de grade élevé (“high-grade (HG) serous”), en comparaison avec des tumeurs à potentiel malin faible (“low malignant potential (LMP) ”) et des tissus ovariens normaux. Ces observations indiquent un fort potentiel oncogénique pour le gène GALNT3 dans les stades avancés du CEO. Ces premières constatations suggèrent également que la surexpression de GALNT3 peut jouer un rôle important dans la tumorigenèse du CEO en augmentant sa dissémination via une O-glycosylation de type mucine aberrante. Ces glycosylations anormales peuvent donc être impliquées dans la carcinogenèse ovarienne et nécessitent une étude approfondie. Dans ce projet de recherche, nous proposons d’approfondir les observations déjà obtenues in vitro en utilisant un modèle in vivo chez la souris, afin d’élucider le rôle fonctionnel de la GALNT3 et d’autres membres de cette famille dans la progression du CEO. A partir d’une étude de glycoprotéomique indépendante de la masse, qui a permis d’identifier des glycopeptides intacts ou métaboliquement marqués, ce projet de recherche a rendu possible la définition précise du rôle de GALNT3 dans la O-glycosylation des cibles de type mucine au sein des cellules CEO. Ainsi, via une recherche ciblée dans la base de données « SwissProt » du protéome humain, nous avons trouvé plusieurs centaines de glycoprotéines et glycopeptides uniques, différemment exprimés dans les clones cellulaires dépourvus en iv GALNT3 KD. Par la suite, nous avons identifié les gènes codant pour ces glycoprotéines et glycopeptides. Nous avons notamment trouvé, parmi la liste, un groupe de gènes impliqués dans le métabolisme cellulaire dont les modifications post-traductionnelles sont, de manière intéressante, principalement supprimées dans les clones GALNT3 KD. De plus, nous nous sommes intéressés aux autres membres de la famille des GalNAc-Ts dans le CEO et nous avons montré que de multiples membres et pas uniquement GALNT3 peuvent jouer un rôle important dans la dissémination et la progression du CEO. De plus, une découverte très intéressante fut la redondance possible des rôles joués par certains membres de la famille des GalNAc-Ts dans le CEO. Ainsi, nous avons identifié GALNT6 qui serait, à l’image de GALNT3, impliquée dans la dissémination et la progression du CEO. Cette implication du GALNT6 est supportée par le fait que cette protéine a les mêmes fonctions que GALNT3, suggérant un effet compensatoire de GALNT6 en absence de GALNT3. Pour tester cette hypothèse, nous avons abolie l’expression des deux protéines GALNT3 et GALNT6, in vivo, et nous avons observé une effet significatif sur la formation des tumeurs et la survie des animaux. Pour la suite de ce projet, nous proposons d’analyser la structure glycane des différentes glycoprotéines identifiées dans les cellules cancéreuses, afin de déterminer les altérations des modifications O-glycanes suite à la perte d’expression de GALNT3 et d’autres membres de la famille des GalNAc-Ts. En conclusion, notre étude contribue à comprendre la participation du glycoprotéome dans la tumorigenèse du CEO et à identifier d’autres cibles de type mucine ou des O-glycoprotéines dont l’expression aberrante serait modulée dans le CEO. Ainsi, pris dans son ensemble, ce projet de recherche montre la possibilité de discriminer entre des cellules cancéreuses et des cellules contrôles via les glycosylations de leurs protéines et permet d’entrevoir la glycobiologie comme une voie prometteuse pour l’identifier de nouveaux biomarqueurs pour le diagnostic du CEO. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the most lethal gynecologic malignancy, thus understanding the molecular changes associated with ovarian cancer metastasis could lead to the identification of essential therapeutic targets. Glycosylation is a post-translational modification (PTM) of proteins playing a major role in various cell properties. Glycosylation participates in major pathophysiology events during tumor progressions, and the aberrant expression of glycan structures was shown to interfere with cell properties such as cell adhesion, migration, and proliferation. The lab has previously identified the polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3 (GALNT3) gene, a member of the GalNAc-Transferases (GalNAc-Ts) gene family, as hypomethylated and overexpressed in high-grade (HG) serous EOC tumors, compared to low malignant potential (LMP) EOC tumors and normal ovarian tissues. Taken together, the data obtained were indicative of a strong oncogenic potential of the GALNT3 gene in advanced EOC and suggest that GALNT3 overexpression might contribute to EOC dissemination through aberrant mucin O-glycosylation, thus specifying some of the putative mechanisms of abnormal glycosylation implicated in ovarian carcinogenesis, which warrant further investigation. The current research project focused on expanding the in vitro observations obtained by using animal models to investigate in vivo the functional significance of GALNT3 and other close members of the GalNAc-Ts gene family in serous EOC progression. Moreover, by applying a mass-independent chemical glycoproteomics platform to characterize intact, metabolically labeled glycopeptides, this project more profoundly characterized the role of GALNT3 in aberrant O-glycosylation of mucin-like targets in EOC cells. Isotopically recorded ions were searched against the Swiss-Prot human proteome; and data obtained were indicative of hundreds of unique glycoproteins and glycopeptides that were differentially expressed upon GALNT3 KD. Related gene groups were identified, and interestingly, genes implicated in mechanisms of cellular metabolic functions, and PTMs were found to be predominantly suppressed in GALNT3 KD clones. In accordance, we also investigated the role of other members of the GalNAc-T family in EOC and we showed that multiple members and not only GALNT3 can play an important role in EOC cancer dissemination and progression. One very interesting finding was the redundant role some members of the GalNAc-T family members play in EOC. We investigated the compensatory functions of GALNT3 and GALNT6, and we were able to demonstrate these two genes can impose that synthetic backup. Furthermore, we found that and their ablation can affect animal survival and tumor formation as observed both in vivo and in vitro. In continuation of this work, this project will focus on analyzing the glycan structures of those differentially expressed glycoproteins, to further examine the specific O-glycans alterations associated with the GALNT3 and other members of the GalNAc-Ts upon gene knockout (KO). Fully elaborated glycopeptides can reveal structural details of the glycoproteome, thus our results could give important information on the glycome in EOC cells, and the identification of other O-glycoproteins/mucin-like targets whose aberrant expression may be modulated by these in EOC. Taken together, the ability to mark differences in the glycosylation of proteins between cancer cells and control cells can emphasize glycobiology as a promising field for potential biomarker identification.

Les maladies complexes sont des maladies multifactorielles dans lesquelles plusieurs gènes et facteurs environnementaux peuvent intervenir et interagir. De nombreuses études ont identifié des locus (gènes ou régions chromosomiques), avec ou sans effets marginaux, qui interagissent pour contribuer au risque de la maladie. Pour les études d'association par polymorphismes, plusieurs méthodes ont été développées récemment pour évaluer l'interaction gène-gène. Cependant, les études d'association par haplotypes donnent parfois une meilleure puissance pour détecter l'association. Mais, la majorité de ces dernières ne permet pas d'évaluer les interactions entre les haplotypes de deux gènes et celles qui le permettent présentent des restrictions, comme l'utilisation du phénotype de la maladie en dichotomique (présence ou absence de la maladie) ou encore n'ajustent pas pour les facteurs environnementaux. Cette thèse traite cette problématique en deux volets : méthodologique et appliqué. Au niveau méthodologique, cette thèse rapporte une nouvelle méthode statistique pour effectuer l'analyse simultanée et l'analyse conditionnelle de deux régions indépendantes (gènes ou régions chromosomiques) dans les études d'associations par haplotypes des maladies complexes. Une étude de simulation a été effectuée pour confirmer sa validité. En présence d'un effet d'interaction entre les haplotypes de deux gènes avec ou sans effets marginaux, les résultats de l'étude de simulation ont montré que notre modèle d'analyse conditionnelle a plus de puissance pour détecter l'association et donne une estimation plus précise des effets comparativement aux méthodes alternatives disponibles actuellement. Au niveau appliqué, l'approche de la cartographie fine dans un premier échantillon de Québec avec une réplication dans un échantillon indépendant de Toronto a été mise à profit pour raffiner l'étude de deux gènes candidats de l'ostéoporose : ESRRG (estrogen receptor-related gamma) et ESRRA (estrogen receptor-related alpha). Pour ESRRG, cette approche combinée aux deux méthodes d'analyse, par polymorphismes ou par haplotypes, confirma son implication dans l'étiologie de la maladie chez les femmes d'origine européenne, tandis que pour ESRRA, elle a constitué une investigation approfondie révélant une association dans un premier échantillon de femmes préménopausées de Québec, mais sans réplication dans un deuxième échantillon indépendant de femmes préménopausées de Toronto. Puisque les deux gènes étudiés appartiennent au même sentier métabolique, l'effet conditionnel de ESRRA sachant ESRRG a été évalué par notre méthode. Cette analyse a révélé une association dans un premier échantillon, mais, encore une fois, sans réplication dans le deuxième échantillon. Ces résultats suggèrent que le premier gène est un gène de susceptibilité de l'ostéoporose. Toutefois, notre étude n'était pas concluante en ce qui concerne l'effet du deuxième gène ainsi que son effet conditionnel sachant l'effet du premier. Ainsi, une réplication dans un échantillon indépendant, de même taille ou plus grande que celle de l'échantillon de Québec, s'avère nécessaire pour confirmer ou infirmer les résultats observés chez les femmes provenant de la région métropolitaine de Québec.

Titre de l'écran-titre (visionné le 26 mars 2024) / La biogenèse des ribosomes est un processus cellulaire important qui se produise dans le nucléole et qui nécessite la participation des trois ARN polymérases nucléaires. L'étape initiale et limitante de ce processus est la transcription de l'ARN ribosomal précurseur (pré-ARNr/47S) contenant les ARN 28S, 18S et 5,8S par l'ARN polymérase I (RPI, également connue sous le nom de Pol1 et POLR1). RPI dispose d'un ensemble dédié de facteurs basaux responsables pour son action : le facteur architectural UBF ou UBTF, le facteur SL1, le facteur d'initiation RRN3 et le facteur de terminaison TTF1. La synthèse de l'ARN ribosomal est étroitement régulée et représente 40 % de la transcription totale des gènes. Le déséquilibre de la synthèse de l'ARN ribosomal a été observé dans de nombreuses maladies comme le cancer. Par conséquent, ce processus est lié à la croissance, la transformation, la prolifération cellulaire et aux actions des suppresseurs de tumeurs et des oncogènes. Par conséquent, l'étude de la régulation transcriptionnelle des ARN ribosomiques revêt une importance cruciale dans la compréhension et le traitement ultérieur de ces maladies. Le génome haploïde humain et murin contient environ 200 copies des gènes de l'ARN ribosomal, l'ADN ribosomal (ADNr). Ces copies d'ADN ribosomique sont disposées en répétitions sur les bras courts des chromosomes acrocentriques. Il est intéressant de noter que seule une fraction des copies d'ADNr est active et qu'un nombre important est épigénétiquement silencieux et hétérochromatique. Cependant, les mécanismes à l'origine de la reconnaissance et de l'inactivation du promoteur de gène de l'ARN ribosomal ne sont pas encore bien compris. Cette thèse propose un modèle d'ajustement induit pour la reconnaissance du promoteur de l'ARN polymérase I et présente les rôles du facteur de terminaison de la transcription I dans la régulation du gène ribosomal. Nous montrons que la coopération entre SL1 et le variant d'épissage UBTF1 génère la spécificité requise pour la reconnaissance du promoteur de l'ADNr dans la cellule. Nous constatons que la suppression conditionnelle de la sous-unité Taf1b de SL1 provoque une déplétion de l'UBTF au niveau des deux promoteurs de l'ADNr, mais pas ailleurs dans l'ADNr. Nous constatons également que même si les variants UBTF1 et -2 se lient dans toute la région exempte de nucléosomes de l'ADNr, seul UBTF1 est présent avec SL1 au niveau des promoteurs. Ainsi, les données suggèrent fortement un modèle d'ajustement induit de reconnaissance du promoteur RPI dans lequel UBTF1 joue un rôle architectural. Parmi les promoteurs ribosomiques, on note la présence du promoteur spacer situé 2 kb en amont du promoteur principal du gène où se lie TTF1. Nous avons montré que cette liaison est importante pour empêcher l'ARN polymérase I de transcrire la région dites « enhancer repeats » interférant ainsi avec l'assemblage du complexe de pré-initiation au niveau du promoteur principal du gène ribosomique via un mécanisme d'occlusion du promoteur induit par un long ARN non codant, inhibant ainsi la transcription de l'ADN ribosomique et cela se produit en réponse à l'activité du suppresseur de tumeur ARF. Le même scénario est observé lors de la différenciation des cellules souches embryonnaires en cellules neuronales où nous avons montré que KLF4 régule la transcription de RPI via la régulation de ses facteurs associés TTF1 et RRN3. En prenant toutes les données ensemble, nous suggérons deux nouveaux mécanismes qui régulent le gène ribosomal : le modèle d'ajustement induit pour la reconnaissance du promoteur RPI et le mécanisme d'occlusion du promoteur induit par un long ARN non codant suite à l'activation du suppresseur de tumeur ARF dans la cellule. / Ribosome biogenesis is an important cellular process occurring in the nucleolus that requires the transcription by all three nuclear RNA polymerases. The initial and rate-limiting step of this process is the transcription of the precursor ribosomal RNA (pre-rRNA/47S) containing the catalytic RNAs 28S, 18S and 5.8S by RNA polymerase I (RPI, also known as Pol1 and POLR1). RPI has a dedicated set of basal factors responsible for its action: the architectural factor UBF or UBTF, the TBP containing factor SL1, the initiation factor RRN3, and the termination factor TTF1. Ribosomal RNA synthesis is tightly regulated and accounts for 40% of total gene transcription. The imbalance of ribosomal RNA synthesis has been observed in many diseases such as cancer. Therefore, this process is linked to cell growth, transformation, proliferation and the actions of tumor suppressors and oncogenes. Consequently, the study of transcriptional regulation of ribosomal RNAs is of crucial importance in the understanding and subsequent treatment of these diseases. The human and mouse haploid genome contain ~200 copies of the ribosomal RNA genes, the ribosomal DNA (rDNA). These ribosomal DNA copies are arranged in tandem repeats on the short arms of acrocentric chromosomes. Interestingly, only a fraction of the rDNA copies is active, and a significant number are epigenetically silenced and heterochromatic. However, the mechanisms behind ribosomal RNA gene promoter recognition and silencing are not yet fully understood. This thesis suggests an induced-fit model for RNA polymerase I promoter recognition and presents the roles played by the transcription termination factor I in regulating the ribosomal gene. We show that cooperation between SL1 and the UBTF1 splice variant generates the specificity required for rDNA promoter recognition. We find that conditional deletion of the Taf1b subunit of SL1 causes a striking depletion of UBTF at both rDNA promoters but not elsewhere across the rDNA. We also find that while both UBTF1 and -2 variants bind throughout the rDNA nucleosome-free region, only UBTF1 is present with SL1 at the promoters. Thus, the data strongly suggest an induced-fit model of RPI promoter recognition in which UBTF1 plays an architectural role. Of the ribosomal promoters, we note the presence of the spacer promoter located 2Kb upstream the main gene promoter where TTF1 binds. We showed that this binding is important to block the RNA polymerase I from transcribing the enhancer repeat region. We further demonstrated that the spacer promoter is the source of a lncRNA that interferes with the assembly of the pre-initiation complex at the main gene promoter via promoter interference or occlusion thereby inhibiting rDNA transcription. The mechanism is proposed to explain the action of the p19ARF tumor suppressor activity in limiting cell growth. The same scenario is observed during ESCs to NPCs differentiation where we showed that KLF4 determines RPI transcription by regulating the genes encoding TTF1 and RRN3. Our data suggest two novel mechanisms that regulate the ribosomal genes: the RPI promoter recognition induced-fit model and the lncRNA-induced promoter occlusion mechanism driven by ARF displacement of TTF1, and further suggests a role for rDNA regulation in differentiation and loss of pluripotency of embryonic stem cells.

Décrire les bases génétiques de la variation phénotypique est un but important en biologie; c’est aussi nécessaire pour comprendre l’évolution et développer des outils utilisables en amélioration et conservation. L’expression des gènes, mesurée par le niveau de transcrits produits, reflète l’activité des gènes et la variation de cette expression influence les phénotypes moléculaire et physiologiques en aval. Cette thèse présente deux expériences visant à développer une approche complémentaire aux méthodes traditionnelles souvent inapplicables chez les conifères afin d'étudier les bases génétiques de la variation d’expression génique chez l’épinette blanche (Picea glauca, Moench. Voss). Analyses des tissus haploïde et diploïde de semences à l’aide de biopuces d'expression et de RNA-seq ont permis de décrire la variation d’expression selon la complexité des bases génétiques, la fonction biologique des gènes impliqués, la liaison génétique entre les effets et les gènes influencés, la spécificité des effets génétiques aux allèles, et l’additivité des effets génétiques chez des individus hétérozygotes. Les effets ayant des bases génétiques relativement simples étaient majoritairement uniques à chaque individu et surreprésentés au sein des gènes impliqués dans la réponse au stress et les gènes dupliqués, suggérant un rôle adaptif. Les effets liés aux variations génétiques situées au sein du gène peuvent être particulièrement importants pour l’adaptation en raison de leur plus grande additivité et spécificité allélique. Une minorité des effets locaux étaient non-spécifiques aux allèles, en accord avec une action de facteurs de régulations indépendants mais étroitement liés au gène ou une auto-régulation de la transcription par le gène lui-même. Une grande partie de la variation d'expression locale montrait des signes de compensation entre des effets spécifiques et non-spécifiques aux allèles, possiblement en raison d'une sélection qui favoriserait un lien étroit entre les effets agissant sur le même gène. Les effets non-liés, non-spécifiques aux allèles, étaient transmis de façon cohérente avec la théorie physiologique de Wright sur la dominance, suggérant qu'ils modulent l'expression en interaction avec d'autres facteurs. L’approche développée dans cette thèse peut potentiellement être appliquée à la large gamme des conifères, avec le possibilité d’étudier le rôle de l'expression dans la divergence entre les populations et les espèces. / Dissecting the genetic bases of phenotypic variation is a major goal in biology and underlies basic understanding of evolution as well as development of practical applications in breeding and conservation. Gene expression (transcript accumulation) reflects gene activity and variation therein translates to variation in other molecular and physiological phenotypes. The goal of my thesis was to establish a novel system for the genetic dissection of expression variation in white spruce (Picea glauca, Moench. Voss) because conventional approaches are mostly unfeasible in conifers. The approach that was used in developing this system is based on analyzing gene expression in the haploid and diploid meiotic seed tissues. Expression analysis using both microarray and RNA-seq techniques revealed a complex and diverse genetic basis for expression variation, which was dissected according to the complexity of genetic bases, focal gene function, effect linkage, effect allele-specificity and additivity of expression variation in heterozygous individuals. Expression variation with simple genetic bases was largely unique to each of two studied individuals and was biased towards genes involved in stress-response and duplicated genes, indicating that it may have adaptive value. Genetic variation in linkage with the expressed gene may be particularly important in adaptive evolution because of their additive effects, associated with their allele-specificity. A minority of local effects was non-specific to alleles, consistent with the action of closely linked but independent regulatory factors or self-regulation of transcription. Much of local expression variation showed evidence of compensation by allele-specific and non-specific effects, suggesting that selection has favored close linkage between certain effets acting on the same gene. Unlinked effects, always non-specific to alleles, exhibited inheritance consistent with Wright’s physiological theory of dominance suggesting that they influence expression in interaction with other partners. Furthermore, widespread dominance/recessivity in expression variation may explain the observation of highly pleiotropic effects influencing key cellular processes and suggests that recessive expression variation may contribute to inbreeding depression. The approach developed in this thesis can potentially be applied to other conifers because of their shared reproductive biology, and can be used to address the role of expression variation in the divergence of populations and species.

La majorité des populations de Rangifer tarandus, soit le caribou en Amérique du Nord et le renne en Eurasie, est en déclin et plusieurs risquent l'extinction. Les causes potentielles de ces déclins sont multiples et incluent la perturbation des habitats, les changements climatiques et la compétition apparente entrainant une augmentation de la prédation. Bien que des stratégies de gestion et de protection soient en place, l'évaluation de la structure génétique et de la dynamique des populations de caribous sauvages demeure difficile. L'étude génomique offre un moyen de décrire comment la diversité génétique de ces populations varie lorsque soumises à un déclin rapide. Nous rapportons ici le développement d'une plateforme de génotypage basée sur les SNPs (Illumina iSelect caribou/renne 60K) afin de réaliser des analyses génomiques. L'hypothèse de travail est que la puce à SNPs de Rangifer tarandus offre une grande puissance pour déterminer l'origine d'un échantillon dans un contexte d'expertise bio-légale, mais également pour appuyer de manière rigoureuse la planification des travaux de gestion et de conservation de la faune. Les objectifs de ce projet de recherche sont dans un premier temps de valider et de tester cette plateforme pour sa sensibilité, sa répétabilité, sa robustesse, son habilité à distinguer des échantillons mélangés et sa spécificité. Dans un deuxième temps, nous souhaitons évaluer la capacité d'assignation d'un individu d'une provenance inconnue à un écotype. Un écotype est le regroupement de populations de caribous présentant des comportements et des préférences écologiques similaires. Les résultats de ce projet ont démontré que la puce à SNPs est robuste, très sensible, fiable et précise et ce en utilisant jusqu'à 10 fois moins d'ADN que recommandé. La qualité de l'ADN a eu peu d'impact sur le taux de réussite (call rate) et le type d'échantillons biologiques n'était pas problématique, même pour ce qui est des fèces. L'hybridation inter-espèces a démontré une importante baisse du taux de réussite (call rate) et de l'hétérozygotie. Les échantillons mélangés étaient détectables selon la proportion de chacun des individus dans le mélange. Ces étapes de validation étaient cruciales afin de tester la puissance et les limites de ce nouvel outil génomique. / The vast majority of Rangifer tarandus populations, caribou in North America and reindeer in Eurasia, are declining and many herds are at risk. They are multiple causes for these declines including habitats pertubations, climate change and predation. Although management and protection strategies are in place, assessing the structure and dynamics of wild caribou populations remains difficult. Genomic surveying offers a mean to describe how populations are evolving when facing such rapid declines. We report here the development of a SNP-based genotyping platform to perform such analyses (Illumina iSelect caribou/reindeer 60K). Our hypothesis is that the Rangifer tarandus SNPs chip offers a great power to determine the origin of a sample in the context of bio-forensic expertise. Our objectives are initially to validate and test this platform for its sensitivity, repeatability, robustness, ability to distinguish mixed samples and its specificity. Secondly, we aim to assess the platform ability to assign an individual of unknown provenance to an ecotype. An ecotype is the grouping of caribou populations with similar behaviors and ecological preferences. Results showed that the SNP chip is robust, highly sensitive, reliable, and accurate at 10 times below recommended DNA input. DNA quality had little impact on call rates, and sample source was not an issue, even for fecal pellets. Interspecies hybridization showed an important drop in call rates and extent of heterozygosity. Mixed samples could be identified according to the proportion of each individual in the sample. These validation steps are crucial to test the power and limitations of this new genetic tool.

Les variations de nombre de copies (VNCs) sont des variations génétiques de grande taille qui ont été détectées parmi les individus de tous les organismes multicellulaires examinés à ce jour. Ces variations ont un impact considérable sur la structure et la fonction des gènes et ont été impliquées dans le contrôle de différents traits phénotypiques. Chez les plantes, les caractéristiques génétiques des VNCs sont encore peu caractérisées et les connaissances concernant les VNCs sont encore plus limitées chez les espèces arborescentes. Les objectifs principaux de cette thèse consistaient i) au développement d’une approche pour la détection de VNCs dans l’espace génique de conifères arborescents appartenant à l’espèce P. glauca, ii) à l’estimation du taux de mutation des VNCs à l’échelle du génome et iii) à l’examen des profils de transmission des VNCs d’une génération à la suivante. Nous avons utilisé des données brutes de génotypage par puces de SNPs qui ont été générées pour 3663 individus appartenant à 55 familles biparentales, et avons examiné plus de 14 000 gènes pour identifier des VNCs. Nos résultats montrent que les VNCs affectent une petite proportion de l’espace génique. Les polymorphismes de nombre de copies observés chez les descendants étaient soit hérités soit générés par des mutations spontanées. Notre analyse montre aussi que les estimés du taux de mutation couvrent au moins trois ordres de grandeur, pouvant atteindre de hauts niveaux et variant pour différents gènes, allèles et classes de VNCs. Le taux de mutation du nombre de copies était aussi corrélé au niveau d’expression des gènes et la relation entre le taux de mutation et l’expression des gènes était mieux expliquée dans le cadre de l’hypothèse de barrière par la dérive génétique. Concernant l’hérédité des VNCs, nos résultats montrent que la plupart de ces derniers (70%) sont transmises en violation des lois mendéliennes de l’hérédité. La majorité des distorsions de transmission favorisaient la transmission d’une copie et contribuaient à la restauration rapide du génotype à deux-copies dans la génération suivante. Les niveaux de distorsion observés variaient considérablement et étaient influencés par des effets parentaux et des effets liés au contexte génétique. Nous avons aussi identifié des situations où la perte d’une copie de gène était favorisée et soumise à différentes formes de pressions sélectives. Cette étude montre que les mutations de novo et les distorsions de transmission de VNCs influencent la diversité génétique présente chez une espèce et jouent un rôle important dans l’adaptation et l’évolution. / Copy number variations (CNVs) are large genetic variations detected among the individuals of every multicellular organism examined so far. These variations have a considerable impact on gene structure and function and have been shown to be involved in the control of several phenotypic traits. In plants, the key genetic features of CNVs are still poorly understood and even less is known about CNVs in trees. The goals of this thesis were to i) develop an approach for the identification of CNVs in the gene space of the conifer tree Picea glauca, ii) estimate the rate of CNV generation genome-wide and iii) examine the transmission patterns of CNVs from one generation to the next. We used SNP-array raw intensity genotyping data for 3663 individuals belonging to 55 full-sib families to scan more than 14 000 genes for CNVs. Our findings show that CNVs affect a small proportion of the gene space and copy number variants detected in the progeny were either inherited or generated through de novo events. Our analyses show that copy number (CN) mutation rate estimates spanned at least three orders of magnitude, could reach high levels and varied for different genes, alleles and CNV classes. CN mutation rate was also correlated with gene expression levels and the relationship between mutation rate and gene expression was best explained within the frame of the drift-barrier hypothesis (DBH). With regard to CNV inheritance, our results show that most CNVs (70%) are transmitted from the parents in violation of Mendelian expectations. The majority of transmission distortions favored the one-copy allele and contributed to the rapid restoration of the two-copy genotype in the next generation. The observed distortion levels varied considerably and were influenced by parental, partner genotype and genetic background effects. We also identified instances where the loss of a gene copy was favored and subject to different types of selection pressures. This study shows that de novo mutations and transmission distortions of CNVs contribute both to the shaping of the standing genetic variation and play an important role in species adaptation and evolution.

Les niveaux d’expression de nombreux gènes peuvent être affectés par l’environnement et mener au développement de la cryptorchidie. Cette malformation congénitale est la plus commune dont une des conséquences majeures est l’infertilité masculine due au testicule non-descendu, auquel un risque plus élevé de cancer testiculaire est associé. L’expression des ARN totaux isolés à partir de biopsies testiculaires ont été analysés par micropuces, puis par une analyse bio-informatique et une validation par RT-qPCR de plusieurs gènes sélectionnés. Ces analyses m’ont permis d’identifier plus de deux milles candidats montrant une expression différente entre des sujets cryptorchides et normaux. Certains de ces gènes sélectionnés peuvent être associés à la descente testiculaire, d’autres au cancer testiculaire ou encore aux divers types cellulaires retrouvés dans cet organe. Les différences dans le transcriptome dues à la cryptorchidie vont nous aider à comprendre la cause génétique de cette maladie. / Expression level of numerous genes may be affected by environmental condition and lead to development of cryptorchidism. The most common congenital malformation in male is cryptorchidism. One major consequence of this anomaly is infertility due to undescended testis, to which an increased risk of testicular cancer is associated. Expression of total RNAs isolated from testicular biopsies were analysed with microarray. This was followed by subsequent bioinformatic analysis and RT-qPCR validation of many highlighted genes. Those analyses allowed me to identified more than two thousand genes that showed a differential expression between normal and cryptorchid subjects. Among these highlighted and validated genes, some can be either associated to testicular descent, to testicular cancer, or to specific cell types in testes. Differences in transcriptome due to cryptorchidism should give us clues to identify the genetic causes of this malformation.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative affectant les neurones moteurs supérieurs et inférieurs menant éventuellement à une paralysie générale du patient. Le décès du patient survient généralement entre 2 à 5 ans subséquemment à l’apparition des premiers symptômes. La SLA consiste en la maladie neurologique causant le plus décès chez l’adulte et il est estimé qu’environ 10% des cas sont familiaux (fSLA) et 90% sont sporadiques (sSLA). De plus, 15% des patients souffrant de la SLA développent également une démence fronto-temporale (DFT) s’illustrant par des troubles de comportements ainsi qu’un changement de personnalité majeur. Il a été démontré que la SLA et la DFT partagent un spectre génétique commun et les patients atteints de DFT démontrent une protéinopathie caractérisée par une accumulation anormale de certaines protéines dans le cytoplasme des neurones et des cellules gliales, tout comme pour les patients souffrant de SLA. Plusieurs gènes mutés ont été identifiés au cours des dernières années pour la forme fSLA, notamment superoxide dismutase 1 (SOD1), TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), ubiquilin-2 (UBQLN2), Fused in sarcoma (FUS), optineurin (OPTN), etc. Un des gènes le plus étudié et le mieux décrit est celui codant la protéine TDP-43. Cette protéine nucléaire, lorsque mutée, est délocalisée dans le cytoplasme, où elle forme des inclusions anormales et persistantes. Ces agrégats, lorsque formés, renferment également plusieurs autres composés, notamment d’autres protéines telles qu’UBQLN2, différentes nucléoporines, ubiquitine, etc. UBQLN2 est une protéine ayant un rôle primordial dans le système de dégradation du protéasome (UPS) ainsi que pour l’autophagie. Cette protéine est responsable de la liaison entre les protéines destinées à être dégradées avec l’UPS. Il a été démontré dernièrement in vitro et in vivo que la mutation d’UBQLN2 est liée à l’agrégation de TDP-43. Cependant, le mécanisme exact de ce phénomène reste grandement incompris et nécessite encore beaucoup d’attention et de travail. Dans ce mémoire, nous avons utilisé pour notre étude des cellules en culture afin de surexprimer les formes natives et mutantes d’UBQLN2 humain (hUBQLN2) pour étudier l’effet d’UBQLN2 sur la protéine TDP-43. Notre équipe a réussi à démontrer dernièrement dans les cellules de neuroblastome de souris (Neuro2a) que la surexpression de l’UBQLN2 entraînait une délocalisation de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme en plus de son accumulation anormale dans des agrégats. De plus, l’effet synergique entre les formes mutées de TDP-43 et UBQLN2 a également été démontré dans un modèle murin dans notre article paru en 2018 comme quoi la mutation d’UBQLN2 influence grandement la protéinopathie de TDP-43. À la suite de ces constats, nous avons orienté nos études sur le phénomène synergique entre UBQLN2 et TDP-43 qui est encore grandement méconnu. Pour ce faire, une analyse complète et exhaustive de la littérature a été effectuée afin de bien comprendre la mutation UBQLN2 et consiste en la première revue littéraire couvrant la totalité des ouvrages publiés sur la mutation d’UBQLN2 dans la SLA. Par la suite, nous avons convenu d’étudier l’effet de la mutation d’UBQLN2P497H sur le transport nucléo-cytoplasmique dans les cellules Neuro2a ainsi que dans les tissus de souris transgéniques. Les souris utilisées sont les mêmes que pour l’article Picher-Martel et al., 2018, soit des souris simple transgénique UBQLN2P497H et TDP-43G348C ainsi que la première souris double transgénique arborant UBQLN2P497H/TDP-43G348C. Les souris doubles transgéniques se sont avérées très intéressantes. En effet, elles ont développé les caractères typiques retrouvés chez les patients SLA/DFT avec une perte motoneuronale accompagnée de dégénérescence axonale, atrophie musculaire, gliose, trouble moteur ainsi que cognitif en plus d’agrégations cytoplasmique de TDP-43 importantes. À l’aide de ce modèle unique nous avons approfondi notre compréhension des déficits observés au niveau du transport nucléo-cytoplasmique, déficit grandement observé chez les patients SLA. Nous avons observé que le transport nucléo-cytoplasmique était davantage et significativement altéré dans les cellules co-transfectées avec les gènes encodant pour les deux protéines mutées plutôt que transfectées avec une seule. Nous avons également observé pour les souris double transgéniques comparées aux souris simples pour l’une ou l’autre de ces protéines. Nos résultats suggèrent donc que la mutation d’UBQLN2 exacerbe significativement la protéinopathie de TDP-43 et engendre une perturbation importante du transport nucléo-cytoplasmique ainsi que des complexes du pore nucléaire. En conclusion, ce mémoire démontre un rôle important de la mutation d’UBQLN2 sur TDP-43 et leur grande affinité à augmenter les déficits du transport nucléo-cytoplasmique. Ceci suggère donc qu’UBQLN2 et TDP-43 sont intimement liés et peuvent jouer un rôle synergique dans la physiopathologie de la SLA. Le modèle murin double transgénique pourra indubitablement être utilisé en laboratoire afin de tester de nouvelles approches thérapeutiques.

La famille des facteurs de transcription NFI comprend les isoformes NFI-A, -B, -C et -X, qui peuvent agir comme activateurs ou répresseurs de la transcription génique. Récemment, nous avons démontré le rôle répresseur de NFI dans la transcription du gène encodant la sous-unité α5 de l'intégrine α5βl. Dans cette étude, nous avons démontré que la suppression de certains isoformes du facteur de transcription NFI altère l'expression du gène α5 dans une lignée particulièrement agressive de mélanome uvéal humain (T97). Nous avons démontré que la diminution de l'expression de certains isoformes permet l'augmentation significative l'expression de l'intégrine α5β1 à la surface des cellules de la lignée T97. Nous avons également identifié quelques protéines qui intéragissent in vitro avec NFI et qui pourraient ainsi modifier ses propriétés modulatrices en regard du gène de α5β1.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Bien que l’on attribue généralement un effet néfaste à l’instabilité génomique, pour le parasite Leishmania, elle s’avère pourtant bénéfique. De façon étonnante, ce protozoaire possède la capacité de remanier le nombre de copies de ses gènes pour s’adapter à son environnement et résister aux drogues utilisées contre lui. La présence de séquences répétées identiques près des gènes essentiels à sa survie permet une recombinaison homologue (RH) efficace et entraîne subséquemment la formation d’une copie extrachromosomique supplémentaire du gène ciblé. Ce phénomène de réarrangement génique induit la formation d’amplicons circulaires ou linéaires et est, entre autres, responsable de la résistance aux agents thérapeutiques. À l’heure actuelle, les enzymes impliquées dans ce processus sont peu connues et l’émergence d’un nombre croissant de cas d’infections réfractaires aux traitements favorise l’étude des protéines médiant la RH dans des conditions de résistance. Il a été récemment montré que la formation d’amplicons circulaires est compromise en l’absence du gène LiRad51, mais n’est toutefois pas abolie. Cette observation suggère l’implication d’autres acteurs dans ce processus, alors que le mécanisme par lequel les amplicons linéaires sont formés demeure inconnu. Cette thèse présente la caractérisation biochimique et cellulaire des protéines clés de la RH impliquées dans l’amplification génique chez le parasite Leishmania infantum. Plus précisément, le rôle de LiBrca2, en tant que médiateur de LiRad51, est tout d'abord démontré en raison de son implication essentielle dans la localisation nucléaire de LiRad51 et dans la stimulation d’invasion de brins effectuée par la recombinase. De façon similaire, les paralogues de LiRad51 peuvent, possiblement grâce à leur capacité de lier et d’apparier de l’ADN, eux aussi, stimuler LiRad51 pour l’invasion d’un ADN simple-brin dans un duplex homologue. L’inactivation génique pour l’un d’entre eux (LiRad51-4) a montré un rôle considérable sur l'amplification circulaire, malgré le fait qu’aucune activité d’invasion n’a pu être observée en l’absence de LiRad51. Enfin, en accord avec son rôle bien établi chez l’humain, cette étude confirme que la protéine LiMre11 possède une activité exonucléase et qu’elle serait impliquée dans la production d’amplicons linéaires. Ces résultats mettent en évidence le potentiel thérapeutique des protéines de la réparation de l’ADN, domaine de recherche prometteur pour mieux lutter contre la leishmaniose. / Genomic instability is usually known as a harmful hallmark, although in the parasite Leishmania this represents a beneficial feature. Surprisingly, this protozoan takes advantage of its ability to reorganize its genome for adapting itself to different environments as well as for drug resistance. In fact, the presence of identical repeats near essential genes allows homologous recombination (HR) between them, and subsequently causes the formation of an additional extrachromosomally copy of the targeted gene. This phenomenon of gene rearrangement induces circular or linear amplicons which leads to drug resistance. However, little is known about the enzymes involved in this process. In addition, the increasing number of infection cases refractory to treatment promotes the study of proteins mediating HR in these circumstances. It has been shown recently by gene inactivation that LiRad51 recombinase plays an important role in circular amplicon formation but was not essential. This observation suggested the presence of other players involved in this process while the mechanism by which linear amplicons are formed is still unknown. This thesis presents biochemical and cellular characterization of key HR proteins involved in extrachromosomal DNA amplification. We first determine the role of LiBrca2 as a mediator of LiRad51. In particular, LiBrca2 is involved in LiRad51 nuclear localisation and stimulates the homology search performed by the recombinase. Secondly, we show evidence that the LiRad51 paralogs help LiRad51 to promote HR through their capacity to bind and anneal DNA. Similary to LiBrca2, they can stimulate LiRad51 to invade a resected DNA double-strand break in an undamaged template to form a D-loop structure. However, they cannot perform this key step on their own. We succeed to inactivate one paralog (LiRad51-4) and provide insights on circular gene amplification. Finally, we show that LiMre11 harbors both DNA binding and exonuclease activities while inactivation of this gene led to a reduction of linear amplicon formation after drug selection. These results highlight a novel LiMre11-dependent pathway used by Leishmania to amplify stochastically portions of its genome. The relevance of DNA repair for drug resistance and its potential as a drug target represent a promising area of research for future treatments of leishmaniasis.