La dominance entre allèles S chez les Brassicaceae est contrôlée par un ensemble de petits ARNs non codants et de leurs séquences cibles. Les relations de dominance qu'ils établissent ont un ensemble de conséquences sur l'accumulation du polymorphisme au locus S lui-même mais également dans les régions immédiatement liées. L'idée du projet a été d'étudier 1) les critères d'appariement selon lesquels les petits ARNs non-codants provoquent le silencing transcriptionnel, 2) la diversité des petits ARNs, de leurs précurseurs et de leurs cibles en populations naturelles afin de déterminer si les contraintes fonctionnelles qu'ils subissent s'apparentent à celles qui pèsent en général sur les miRNAs et enfin 3) la diversité des séquences flanquantes, afin de déterminer d'une part l'ampleur du pic de polymorphisme attendu en raison de la sélection balancée et d'autre part si on peut détecter un fardeau de mutations délétères spécifique à chaque allèle le long de la hiérarchie de dominance. / The dominance between S-alleles in the Brassicaceae is controlled by a set of small non-coding RNAs and their cognate targets. These dominance relationships have important consequences on the polymorphism accumulated at the S-locus itself but also at the flanking regions. The aim of the project was to study 1) the base-pairing criteria by which the small non-coding RNAs transcriptionally silence their target gene, 2) the diversity of these small RNAs, of their precursors and targets in natural populations in order to determine if the selective constraint they undergo is similar to what we know for other miRNAs genes in the genome, and finally, 3) the diversity of the flanking regions, to determine the size of the predicted peak of polymorphism peak caused by balancing selection, test whether genes in these regions show evidence of the predicted sheltered load and whether polymorphisms at these genes are specifically associated with S-alleles.

Près de 8% du génome humain est constitué de séquences d'origine rétrovirale. Ces séquences nommées HERVs (Human Endogenous RetroVirus) représentent des vestiges d'intégrations rétrovirales ancestrales qui font maintenant partie de notre génome. Certaines de ces séquences sont toujours aptes à produire des protéines typiques aux rétrovirus, telles que les protéines de l'enveloppe ou certaines protéines régulatrices. La présence des HERVs dans le génome humain peut se révéler être associée à divers phénomènes biologiques, favorisant ainsi l'idée qu'une corrélation entre ces rétrovirus endogènes et certaines pathologies, telles que la sclérose en plaque, la schizophrénie ou encore la pré-éclampsie pourrait exister. Cependant, il a été suggéré qu'une protéine d'enveloppe appartenant à une séquence d'HERV, nommée Syncytine-l, pourrait participer au développement du placenta. La fonction de cette dernière serait de provoquer des événements de fusion cellulaire entre les cellules cytotrophoblastiques du placenta, permettant la formation de la structure cellulaire nommée syncytiotrophoblaste. Cependant, d'autres protéines d'enveloppe d'HERVs découvertes récemment, telle que la Syncytine-2, pourraient aussi participer à ces événements fusogéniques de façon équivalente, voir plus importante que la Syncytine-l. L'étude menée ici a tout d'abord eu pour but d'approfondir et de présenter des mécanismes possibles de régulation du gène Syncytine-l ainsi que d'un autre gène env d'HERVs, soit la Syncytine-2, possiblement impliquée dans les événements fusogéniques des cellules trophoblastiques. D'abord, des expériences de 5'/3' RACE ont permis de caractériser les extrémités du transcrit Syncytine-2. L'expression de ces enveloppes rétrovirales a été ensuite étudiée en utilisant la technique RT-PCR. En effet, l'ARN total a été extrait de différentes lignées cellulaires de choriocarcinomes trophoblastiques (BeWo, Jar et JEG-3), stimulées ou non avec les agents activateurs, forskoline (un activateur de l'adénylate cyclase) et bpV[pic] (un inhibiteur de phosphotyrosine phosphatase) dont l'impact dans les événements de fusion a été étudié parallèlement. D'autres amplifications par RTPCR, utilisant l'ARN de cellules primaires humaines placentaires, ont été envisagées, afin de mettre en évidence l'expression de ces gènes dans un contexte plus représentatif du placenta. D'autre part, une étude des différentes activités promotrices a été réalisée à l'aide de différents clonages des régions LTR-5' de ces deux gènes dans un vecteur rapporteur de la luciférase. Dans un second temps, il s'agissait d'étudier l'implication fonctionnelle de ces deux protéines d'enveloppe d'HERVs, au cours de la syncytialisation des trophoblastes, par différentes expériences de fusion en présence d'inhibiteurs de l'expression de ces enveloppes rétrovirales telles que des molécules d'ARN Interférents. Enfin, leur localisation cellulaire a été mise en évidence au travers de la microscopie confocale. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : HERV, Rétrovirus endogène, Env, Syncytine-1, Syncytine-2, Placenta, Trophoblaste, Fusion, Syncytium, Expression, Transcription, LTR, Localisation, siRNA.

Ce mémoire présente deux tests génétiques permettant l'identification de gènes reliés à une maladie par l'intermédiaire des études d'association et de liaison génétique. Le premier test, le TDT (Transmission Test for Linkage disequilibrium), est très couramment utilisé et s'applique aux caractères binaires. Le second test, le QTDT est relativement nouveau et s'applique aux caractères mesurés sur une échelle continue. On commence par donner des notions théoriques de ces deux tests, en particulier des notions élémentaires de génétique quantitative. Par la suite, ces deux tests sont appliqués à des données réelles, des enfants atteints du TDA/H (trouble du déficit de l'attention, avec ou sans hyperactivité), et leurs résultats sont comparés. Les données comprennent des variables explicatives environnementales et génétiques. Les phénotypes (variables expliquées) sont des scores de comportement de l'enfant, qui varient sur une échelle continue. On montre que les résultats des deux tests sont similaires; le gène étudié n'est ni associé, ni lié au trouble étudié. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Déséquilibre de liaison, Test du TDT, Test du QTDT, TDA/H.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 février 2024) / La cellulose d'origine bactérienne est un matériau unique, dont les propriétés la rendent intéressante pour plusieurs domaines. En effet, la finesse de ses fibres, leur degré d'organisation cristalline, ainsi que l'absence de lignine, pectine, et d'hémicellulose en font une substance plus absorbante, résistante et biocompatible que le la cellulose végétale, ce qui la rend plus appropriée pour des applications médicales et optoélectroniques. Cependant, la production de cellulose bactérienne à échelle industrielle rencontre plusieurs obstacles, tels que la perte spontanée de la production de cellulose au cours de la culture des bactéries productrices, ainsi qu'un rendement qui est économiquement non rentable. De plus, les outils de biologie moléculaire adaptés aux souches productrices de cellulose sont limités ce qui restreint les essais de manipulation génétique ayant pour but d'augmenter leurs productivités de cellulose. Dans cette étude, nous démontrons que l'insertion de l'élément transposable IS*1032* dans un site spécifique situé à la base 502 dans le gène *bcsA* chez *Komagataeibacter rhaeticus* iGEM entraîne l'interruption de la production de cellulose dans au moins 12% des mutants cellulose négatif (Celˉ). Une analyse par qPCR a permis d'estimer le nombre de copies de cet élément par cellule à 16 ± 2 copies. Nous proposons une stratégie pour bloquer l'insertion de l'élément transposable IS*1032* en modifiant le site d'insertion de cet élément sur BcsA. Cela était effectué en se basant sur une analyse *in silico* des effets d'une substitution de l'acide aminé présent sur le site d'insertion tout en vérifiant que la structure 3D de la protéine BcsA ne soit pas déformée. Des essais préliminaires suggèrent que l'expression de la protéine modifiée chez un mutant Celˉ pourrait entraîner la réversion à un phénotype Cel⁺ stable. Nous démontrons donc l'efficacité de deux marqueurs de sélection chez *K. rhaeticus*, soit la tétracycline (*tetA*) et la streptomycine (*aadA*). Nous constatons aussi que le glycérol est une source de carbone efficace en milieu minimal pour une surproduction de cellulose chez cette souche bactérienne. / Bacterial cellulose, or BC, is a unique material, whose properties make it interesting for several fields. Indeed, the fineness of its fibers, their degree of organization, as well as the absence of lignin, pectin, and hemicellulose make it a more absorbent, tough and biocompatible substance than plant-based cellulose making it more appropriate for applications in medicine and optoelectronics. However, the industrial production of bacterial cellulose encounters several obstacles, such as the spontaneous loss of cellulose production during cultivation of these bacteria as well as its low yields making the whole production process economically nonviable. In addition, molecular biology tools adapted to cellulose-producing strains are limited, which restricts genetic manipulation trials aiming at increasing their cellulose productivity. In this study, we demonstrate that the insertion of the IS*1032* transposable element into a specific site located at base 502 in the *bcsA* gene in *Komagataeibacter rhaeticus* leads to the interruption of cellulose production in at least 12% of cellulose-negative (Celˉ) mutants. A qPCR analysis allowed us to estimate the number of copies of this element per cell at 16 ± 2 copies. We then propose a strategy to block the insertion of the transposable element IS*1032* by modifying the insertion site of this element on BcsA. This was conducted based on an *in-silico* analysis of the effects of a substitution of the amino acid present in the insertion site while verifying that the 3D structure of the BcsA is not affected. Preliminary experiments suggest that the expression of the mutant BcsA protein in a Celˉ mutant can cause a stable reversion to the Cel⁺ phenotype. We propose new and useful tools for genetic manipulation of *Komagataeibacter rhaeticus*. We also demonstrate the efficiency of two selection markers in *K. rhaeticus*, namely tetracycline (*tetA*) and streptomycin (*aadA*). We report that glycerol is an efficient carbon source to be used in minimal medium for high cellulose production in this bacterial strain.

Le soja est une culture d'importance mondiale qui doit son succès à ses multiples avantages notamment nutritionnels. Mais face aux changements climatiques actuels, le soja va devoir faire face de multiples stress dont le stress hydrique auquel il est particulièrement sensible. Pour cela, il est important de développer des variétés dotées d'un système racinaire performant pour permettre au soja d'avoir accès à l'eau et aux nutriments nécessaires à sa croissance. Précédemment, au sein de notre laboratoire, Seck *et al.* (2020) ont mis en avant l'existence d'un SNP significativement associé à la longueur racinaire à proximité duquel se trouve le gène *Glyma.03g065700* appartenant à la famille GRAS. Chez *A. thaliana*, l'inactivation de deux gènes appartenant à cette même famille a entrainé l'apparition d'un phénotype à racine courte. Nous avons décidé de procéder à l'inactivation du gène *Glyma.03g065700* en émettant l'hypothèse suivante : l'inactivation du gène candidat à l'aide de la technologie CRISPR nous permettra de savoir si ce gène contribue à déterminer la longueur des racines chez *Glycine max*. Pour obtenir des racines transgéniques, nous avons utilisé *Agrobacterium rhizogenes* comme transporteur de la technologie CRISPR en vue de l'intégration des séquences génétiques requises (Cas9, ARNg et gène rapporteur *RUBY*) au sein du génome de la plante. Le phénotypage a permis l'observation de différents phénotypes : racines longues, racines courtes et zones colorées. Les résultats de l'analyse moléculaire par séquençage Illumina de l'ADN racinaire nous montre que la majorité des racines présentaient une inactivation d'un seul allèle du gène d'intérêt. Et, lorsque l'inactivation des deux allèles est présente, le phénotype observé correspond à une racine longue. Ces résultats suggèrent que *Glyma.03g065700* n'a pas d'impact sur la longueur de la racine principale mais il serait intéressant d'étudier le rôle qu'il pourrait avoir au niveau des racines secondaires et en condition de stress hydrique. / Soybean is a globally important crop, whose success is largely due to its numerous benefits, particularly nutritional ones. However, in the face of climate change, soybean will need to cope with multiple stresses, including water stress, to which it is very sensitive. Therefore, it is crucial to develop varieties with an efficient root system to enable soybean plants to access the water and nutrients necessary for their growth. Previously, in our laboratory, Seck *et al.* (2020) highlighted the existence of a SNP significantly associated with root length, near which the gene *Glyma.03g065700* belonging to the GRAS family is located. In *A. thaliana*, the inactivation of two genes belonging to this same gene family resulted in a short root phenotype. We decided to inactivate the *Glyma.03g065700* gene, hypothesizing the following: inactivation of the candidate gene using CRISPR technology will allow us to determine if this gene contributes to root length in *Glycine max*. To obtain transgenic roots, we used *Agrobacterium rhizogenes* as a carrier of CRISPR technology within the plant genome, along with the reporter gene *RUBY*. Phenotyping allowed the observation of different phenotypes: long roots, short roots, and colored zones. The results of the molecular analysis following Illumina sequencing of root DNA showed that most of the roots presented inactivation of only one allele of the gene of interest. When both alleles were inactivated, the observed phenotype corresponded to a long root. These results suggest that *Glyma.03g065700* does not impact the length of the main root, but it would be interesting to study the role it could play in secondary roots and under water stress conditions.

L'ovule est la seule cellule capable de remodeler l'information génétique de deux parents en celle d'un nouvel embryon, et ce potentiel s'est hautement conservé au cours de l'évolution. La reprogrammation d'un noyau se produit, pour la majorité des espèces, en absence de transcription. Ainsi. l'ARN et les protéines présentes dans l'ovule au moment de la fécondation constituent tout le matériel nécessaire pour soutenir le développement embryonnaire précoce. Les mécanismes tels que l'arrêt méiotique, la méthylation/déméthylation de l'ADN et les réarrangements épigénétiques sont communs à la majorité des vertébrés. Par contre, certaines différences peuvent être observées dans des processus tels la fécondation et la reconnaissance des gamètes. Ce projet vise à identifier des gènes conservés chez les vertébrés et impliqués dans les mécanismes de reprogrammation, puis d'évaluer l'impact de la surexpression de gènes sélectionnés sur la configuration de la chromatine de cellules humaines. La première étape du projet était d'établir un profil fonctionnel des différences et similitudes observables dans le transcriptome de l'ovule des vertébrés. Pour ce faire, nous avons comparé le transcriptome de l'ovule humain aux transcriptomes spécifiques à l'ovule de souris, de bovin et de xénope via une analyse par biopuce développée au sein de notre laboratoire. Pour la seconde partie de la thèse, nous avons sélectionné des candidats qui ont été surexprimés dans des cellules humaines en culture, et avons évalué leur impact à plusieurs niveaux sur la chromatine. Suite aux résultats obtenus, nous nous sommes concentrés sur l'analyse de gènes pouvant être impliqués dans la déméthylation de l'ADN et avons vérifié si leur coexpression pouvait induire la déméthylation d'ADN dans des fibroblastes humains. Une approche d'immunoprécipitation de chromatine et de séquençage au bisulfite nous a permis d'observer une déméthylation modérée à certains sites spécifiques, confirmant un rôle de ces gènes dans la déméthylation de l'ADN humain. Les travaux présentés dans cette thèse permettent de souligner le potentiel de gènes ovocytaires à reconfigurer la chromatine dans d'autres types cellulaires. Leur caractérisation plus poussée pourrait notamment contribuer à des avancements dans la compréhension et la maîtrise des mécanismes de reprogrammation pour la recherche en reproduction ou en médecine regenerative.

GATA4 est un facteur de transcription essentiel pour le développement et la fonction de plusieurs tissus, incluant les gonades. GATA4 est exprimé sous forme de deux transcrits majeurs présentant des premiers exons distincts non codants, soient l’exon 1a et l’exon 1b. J’ai proposé que l’utilisation de différents promoteurs soit un mécanisme important dans la régulation spatiotemporelle de l’expression de GATA4. Des expériences d’hybridation in situ ont révélé que les transcrits Gata4 1a et 1b sont bien présents au niveau des cellules somatiques du testicule et de l’ovaire au cours du développement. Les résultats in vitro nous ont suggéré que le promoteur 1b est régulé positivement par GATA4. Toutefois, les résultats in vivo ont révélé que le promoteur Gata4 1b est assujetti à une autorégulation négative. Les expériences de co-transfection ont démontré que GATA4 régule sa propre expression en réprimant l’activité transcriptionnelle du promoteur Gata4 1b en interagissant avec FOG2.

L'objectif principal du projet de recherche dont fait l'objet ce mémoire était d'étudier les effets du polymorphisme P73T de la neuromédine-B sur les habitudes et comportements alimentaires. Des femmes pré-ménopausées (N=153) ont été recrutées afin de trouver des homozygotes pour ce variant (N=7) et de les pairer avec des homozygotes sauvages. Notre hypothèse principale était que les sujets T73T ajusteraient moins adéquatement leur apport calorique suivant différentes pré-charges caloriques que les sujets P73P. Nous n'avons pas observé d'effet du polymorphisme sur l'indice de masse corporelle ni les comportements alimentaires. De plus, la compensation calorique des deux groupes n' était pas différente, peut-être en raison du faible nombre de sujets sur lesquels l'étude est basée. D'un autre côté, les sujets T73T avaient des apports habituels en énergie et en glucides (g) plus faibles que les sujets P73P. L'association avec l'apport en glucides disparaissait lorsqu'exprimé en pourcentage de l'apport calorique. Ces résultats suggèrent que le polymorphisme P73T de la neuromédine-β module l'apport calorique sans induire de préférence pour les macronutriments

L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) fait partie d’un regroupement de maladies héréditaires dont le tissu cible est la peau. Cette maladie dermatologique est causée par une mutation dans les gènes KRT5 ou KRT14, laquelle entraîne un problème au niveau de la formation des filaments intermédiaires de la kératine qui composent la peau. Un mésappariement au niveau des kératines 5 et 14 est responsable de l’apparition des symptômes de la maladie incluant la formation de cloques suite au trauma mécanique que subit la peau. Ces cloques entraînent d’importantes douleurs chez le patient, et de l’inflammation et de l’irritation. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible pour soulager les patients atteints de la maladie. Depuis quelques années, les chercheurs utilisent des technologies pour modifier directement l’ADN des patients afin de réparer la mutation responsable de l’apparition des symptômes. Des technologies d’édition du génome telles que CRISPR/Cas9 constituent donc une avenue prometteuse pour le traitement de maladies héréditaires monogéniques comme l’EBS. Cette technologie permet de cibler un endroit précis dans le génome par la combinaison d’un ARN guide simple brin et d’une protéine Cas9. La réparation de l’ADN se fait par l’induction d’une coupure double brin de l’ADN par la protéine Cas9 et sa réparation par un fragment d’ADN donneur double ou simple brin. Ce projet a pour objectif principal de corriger les mutations causant l’EBS chez deux patients possédant des mutations hétérozygotes. Plus spécifiquement, ce projet de maîtrise a pour objectif d’optimiser la méthode permettant l’utilisation de CRISPR/Cas9 dans un contexte d’EBS. La technologie CRISPR/Cas9 a été utilisée sur des cellules HEK293T, permettant de démontrer que la Cas9 est en mesure d’induire une coupure double brin de l’ADN au site ciblé dans l’ADN. Ensuite, il a été démontré que la coupure de la Cas9 jumelée à l’utilisation d’un ADN double ou simple brin permet de réparer la coupure en réalisant de la recombinaison homologue. Le séquençage a permis de confirmer ces résultats. À ce jour, les résultats dans les cellules HEK293T se sont montrés concluants et ont permis d’initier les travaux dans les fibroblastes de patients.

Une étude précédente visant à mieux comprendre le rôle et le contexte cellulaire dans lequel la ribonucléase Dicer (Dcrl) évolue nous a permis d'identifier des protéines pouvant être régulées par un mécanisme post-transcriptionnel impliquant Dcrl et la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) chez Schizosaccharomyces pombe. Parmi ces protéines se trouvaient trois enzymes impliquées dans la voie de la glycolyse. Nous avons tenté de caractériser le mécanisme et l'implication fonctionnelle de leur régulation en effectuant des expériences de FACS combinées à l'utilisation d'un système de gène rapporteur basé sur la « Green fluorescent protein » et en effectuant des tests de croissance, respectivement. La régulation de la voie de la glycolyse ne semble pas nécessaire à la croissance des levures, ce qui suggère la présence de mécanismes compensatoires. L'étude précédente nous avait également permis d'identifier la protéine ribosomale L12 comme interacteur potentiel de Dcrl pouvant être impliqué dans sa régulation. Nous avons tenté de comprendre le rôle de L12 dans cette régulation en confirmant son interaction avec Dcrl et en caractérisant l'aspect fonctionnel de cette interaction en produisant des lignées délétionnelles de L12. La localisation intracellulaire de la protéine L12 nous permet de croire qu'elle pourrait amener Dcrl dans des structures spécifiques du cytosol, où elle pourrait jouer un rôle dans la régulation génique post-transcriptionnelle. Ce rôle demande toutefois à être confirmé.