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Los receptores de neurotransmisores son elementos clave en la comunicación neuronal. Conforman proteínas integrales de membrana especializadas que median respuestas de tipo excitatoria y/o inhibitoria. Estos receptores, junto a enzimas y proteínas que modulan el metabolismo del neurotransmisor, constituyen verdaderos sistemas organizados para una transmisión de la información correcta y eficaz. Los recep-tores de neurotransmisores pertenecientes a la familia Cys-loop, son canales iónicos activados por ligando. A esta familia pertenecen los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRn), los receptores ionotrópicos de GABA, los receptores de sero-tonina tipo 3 (5HT3), los receptores de glicina (Gly-R) y los receptores de zinc. Estos receptores también han sido identi-ficados en otros tejidos, por ejemplo epitelio respiratorio, pán-creas, endotelio y células inmunes. Existen trabajos que pos-tulan que estos sistemas no-neuronales ejercen una actividad moduladora de procesos celulares tales como diferenciación, migración y proliferación. Sin embargo la función de estos sistemas aún no está completamente esclarecida. El objetivo de esta tesis es identificar y caracterizar dos sistemas de neurotransmisores en linfocitos humanos: el sistema colinér-gico y el sistema GABAérgico. En primer lugar determinamos la participación del AChRn α7 durante la activación de linfocitos T estimulados con un mitógeno (PHA). Establecimos que durante este proceso aumenta la producción del neurotrans-misor ACh, así como también los niveles de ARN mensajero (ARNm) y de proteína del receptor α7. Además, demostramos que la modulación de dicho receptor por agonistas y anta-gonistas específicos, inhibe y potencia la proliferación de estas células, respectivamente. En segundo lugar caracteri-zamos la presencia de un sistema GABAérgico completo en linfocitos humanos, similar al descripto en neuronas. Deter-minamos la presencia de enzimas y proteínas que llevan a cabo la síntesis, transporte y catabolismo del neurotransmisor GABA, así como también la presencia y actividad de transpor-tadores de membrana y de receptores ionótropicos de GABA. Al evaluar este sistema durante el proceso de activación, observamos que existe un aumento tanto de los componentes GABAérgicos como de la actividad de los transportadores y receptores, respecto a las células no estimuladas. También observamos que la activación de los receptores por el propio neurotransmisor o por agonistas específicos como muscimol, provoca una disminución de la proliferación inducida por el mitógeno. Por último, evaluamos la propiedad de plasticidad de estos receptores no neuronales, utilizando como estímulo la exposición a GABA. Se observaron cambios en la expresión del ARNm y en las proteínas de las subunidades de los recep-tores. Se determinó que durante la exposición al neurotrans-misor se activa la vía de Akt. Esta proteína fosforila las subunidades de los receptores de GABA ocasionando una mayor expresión de los mismos en membrana. Estos cambios se corroboraron al detectar un mayor porcentaje de células que responden electrofisiológicamente a la aplicación de GABA. El trabajo desarrollado en esta tesis aporta nuevos datos acerca de las propiedades y funciones de los sistemas neuro-nales presentes en linfocitos. Nuestros resultados podrían ser de gran utilidad para el diseño de nuevos tratamientos farma-cológicos que actúen sobre estos sistemas, presentando nuevas alternativas en la modulación de la respuesta inmune. / Neurotransmitter receptors are key elements in neuronal communication. They are transmembrane proteins specialized in mediating both excitatory and/or inhibitory responses. These receptors, as well as the enzymes and proteins that are responsible for neurotransmitter metabolism, form orga-nized systems for an efficient and appropriate neuronal transmission. Neurotransmitter receptors that belong to the Cys-loop family are ligand-gated ion channels. Nicotinic acetylcholine receptors (nAChR), ionotropic GABA receptors, serotonin type 3 receptors (5HT3), glycine receptors (Gly-R) and zinc receptors are members of this family. The presence of these receptors has been reported in non-neuronal tissues, such as respiratory epithelium, pancreas, endothelium and immune cells. Previous studies have proposed that these non-neuronal systems are involved in different cellular processes like migration, differentiation and proliferation. However, little is known about their functional role. The aim of this thesis is to identify and characterize two neurotransmitter systems in human lymphocytes: the cholinergic system and the GABAer-gic system. Firstly, we have determined the participation of the α7 nAChR in mitogen (PHA)-induced T cell activation. We have established that ACh synthesis as well as a7 messenger RNA (mRNA) and receptor levels increase during lymphocyte activation. We have also demonstrated that α7 nAChR modu-lation by specific agonist and antagonist drugs, inhibits and stimulates lymphocyte proliferation, respectively. Secondly, we have characterized the presence of a complete, neuronal-like GABAergic system in human lymphocytes. We have determined the presence of enzymes and proteins responsible for the synthesis, transport and degradation of the neuro-transmitter GABA, and the presence of membrane transporters and ionotropic GABA receptors. We have also observed an increase in these GABAergic elements and in their activity during lymphocyte activation. In addition, we have detected a decrease in mitogen-induced proliferation produced by the activation of ionotropic GABA receptors with GABA and the specific agonist, muscimol. Finally, we have studied the plas-ticity of these non-neuronal receptors during GABA exposure. We have detected changes in the mRNA and protein levels of GABA receptor subunits. We have also observed an increase in the activation of the Akt pathway during GABA incubation, which leads to GABA receptor subunit phosphorylation, resul-ting in a higher receptor expression in the cell membrane. These changes correlate with the detection of a higher number of cells showing electrophy-siological activity during GABA exposure. Findings from these Ph. D. thesis provide new data about the properties and functions of the neurotrans-mitter systems present in immune cells. Our results could be useful tools for the design of new pharmacological treatments targeting on these systems, to finally introduce alternatives for the modulation of the immune response.

L’objectif de notre étude est d’améliorer la connaissance des réseaux neuronaux responsables de la régulation du sommeil paradoxal (SP). Dans ce but, nous avons combiné des techniques de polysomnographie, de neuroanatomie fonctionnelle, de pharmacologie et de traçage de voies nerveuses. Nous avons ainsi mis en évidence une population de neurones GABAergiques à la jonction entre la substance grise périaqueductale ventrolatérale et la partie dorsale du noyau profond du mésencéphale (vlPAG/dDpMe), capable de bloquer l’entrée en SP. Nous avons également démontré l’existence de nombreuses populations de neurones GABAergiques pontiques activés au cours du SP. De plus, nos travaux ont révélé la présence de nombreux neurones GABAergiques, dont les neurones à MCH, actifs en SP dans plusieurs régions hypothalamiques. Enfin, nous avons établi une cartographie des neurones à MCH et à Hcrt envoyant des projections sur les neurones histaminergiques du noyau tubéromammillaire ventral (VTM), promoteurs de l’éveil. L’ensemble de notre travail de thèse a permis d’affiner le modèle des réseaux neuronaux impliqués dans la régulation du SP, particulièrement en confirmant le rôle du GABA dans ces mécanismes de régulation / The aim of our study is to improve the knowledge of the neural networks responsible for paradoxical sleep (PS) regulation. To this end, we combined polysomnographic recordings, functional neuroanatomy, pharmacology and tract-tracing of nervous pathways. We thus highlighted a population of GABAergic neurons at the junction between the ventroleral periaqueductal gray and the dorsal part of the deep mesencephalic nucleus (vlPAG/dDpMe), able to gate PS genesis. We also showed the existence in the pons of several GABAergic neurons populations activated during PS. Moreover, our work revealed the presence of a large number of GABAergic neurons including the MCH neurons, activated in PS in several hypothalamic areas. Finally, we mapped the MCH, Hcrt neurons that send projections to the wake-promoting histaminergic neurons of the ventral tuberomammillary nucleus (VTM). Our thesis work made it possible to refine the model of neural networks involved in PS regulation, particularly by confirming the role of GABA in these mechanisms of regulation.

The GABAergic system in adult sensory cortex is affected by sensory deprivation, but little is known about how this predominant inhibitory system is affected during ontogeny. The present study investigates developmental effects of whisker trimming on GABAa receptors in rat barrel cortex. Rats trimmed for 6 wk beginning at birth and adulthood showed similar decreases in [3H]muscimol binding in deprived relative to non-deprived barrels, suggesting absence of a critical period.

Introduction: L'injection ip de lipopolysaccharide (LPS) d'E.coli à la rate gestante aboutit à un phénotype cognitivo-comportemental de pathologies neuropsychiatriques chez la progéniture mâle. L'objectif principal était de vérifier l'hypothèse d'une atteinte structurelle et d'un déséquilibre entre excitation et inhibition dans l'hippocampe. L'objectif secondaire était de dégager des stratégies thérapeutiques ciblées.Méthodes: 500 μg/kg de LPS d'E.coli de sérotype O55:B5 ou 2 ml/kg de sérum physiologique étaient injectés ip à la rate au 19e jour de gestation. La progéniture mâle était étudiée à différents stades du développement. L'étude structurelle reposait sur de l'immunohistochimie, l'étude fonctionnelle sur des enregistrements électro-physiologiques de l'activité des cellules pyramidales de l'aire CA1. L'effet protecteur de la N-acétylcystéine (NAC) donnée po à la rate gestante après l'injection de LPS était testé. Résultats: Les animaux soumis à un stress prénatal par le LPS présentaient une désorganisation durable de la couche pyramidale de l'aire CA3, un déficit transitoire de neurones exprimant la reeline, une altération de la dépression à long terme des synapses glutamatergiques (LTDe) liée à un déficit des récepteurs NMDA et du système GABAergique. Un inhibiteur de la recapture du GABA parvenait à corriger les anomalies de la LTDe. La NAC prévenait les anomalies cyto-architecturales.Conclusion: Cette thèse confirme l'impact d'un stress immuno-inflammatoire maternel sur la structure et la fonction hippocampique. Elle démontre l'intérêt d'un traitement prénatal par la NAC et de la modulation du tonus GABAergique pour corriger les troubles cognitifs associés. / Introduction: A late gestational exposure to lipopolysaccharide (LPS) leads to a behavioral and cognitive phenotype of neuropsychiatric disorders in male offspring. The main goal was to test the hypothesis of structural damage and imbalance between excitation and inhibition in the hippocampus. The secondary goal was to identify targeted therapeutic strategies.Methods: Pregnant rats were ip injected with either 500 μg/kg LPS from E.coli O55:B5 or 2 ml/kg saline vehicle on gestational day 19. Male offspring were studied at different developmental stages. The structural study was based on immunohistochemistry, the functional study on electrophysiological recordings of the activity of pyramidal cells in the CA1 area. The protective effect of N-acetylcysteine (NAC) given to pregnant rats after LPS injection was tested.Results: In male offspring, LPS induced late gestational immune challenge led to sustainable disarray of the pyramidal layer in the CA3 area, transient deficit of reelin expressing neurons, impaired long term depression of glutamatergic synapses (LTDe), due to NMDA receptor and GABAergic system dysfunction. An inhibitor of GABA reuptake completely restored plasticity lost after prenatal stress. NAC prevented cyto-architectural abnormalities.Conclusion: This thesis confirms the impact of a late prenatal immune challenge on hippocampal structure and function. It demonstrates that prenatal treatment with NAC and GABAergic tone modulation are valuable therapeutic strategies for the cognitive impairment associated with prenatal immune challenge.

La locomotion implique l'activité coordonnée de réseaux d'interneurones spinaux inhibiteurs et excitateurs qui génèrent le rythme et le pattern de la décharge des motoneurones et de la contraction musculaire. La maturation de la transmission inhibitrice au niveau des motoneurones chez le rat se produit durant la période périnatale. Dans cette fenêtre temporelle, les projections provenant du tronc cérébral commencent à envahir l'élargissement lombaire de la moelle épinière. Nous avons étudié les effets du blocage de la mise en place des afférences supraspinales dans la moelle lombaire par transection complète de la moelle épinière (SCT) à la naissance (P0), sur l'expression des sous-unités des récepteurs GABAA et glycine (RcGABAA et RcGly) au niveau des motoneurones lombaires. Nous concluons en une plasticité différentielle des récepteurs de l'inhibition en réponse à une section spinale néonatale. La première étape de notre seconde étude était d'évaluer les modifications de la transmission synaptique inhibitrice sur des motoneurones lombaires innervant des muscles fléchisseurs et extenseurs après SCT complète chez des rats adultes. Une étude longitudinale a montré une évolution différentielle de l'expression des RcGly et des RcGABAA au cours des mois qui suivent la lésion mais qui est a peu près identique sur les Mns fléchisseurs et extenseurs. Nos résultats montrent que chez les rats avec SCT, l'entrainement permet d'acquérir une « locomotion spinale » qui résulte d'interactions dynamiques entre un programme moteur dans la moelle sous lésionnelle, et des feedback proprioceptifs. / Maturation of inhibitory postsynaptic transmission onto motoneurons in the rat occurs during the perinatal period, a time window during which pathways arising from the brainstem reach the lumbar enlargement of the spinal cord. There is a developmental switch in miniature IPSCs (mIPSCs) from predominantly long-duration GABAergic to short-duration glycinergic events. We investigated the effects of a complete neonatal [postnatal day 0 (P0)] spinal cord transection (SCT) on the expression of Glycine and GABAA receptor subunits (GlyR and GABAAR subunits) in lumbar motoneurons. In P7 animals with neonatal SCT (SCT-P7), the GlyR densities were unchanged compared with controls of the same age, while the developmental down regulation of GABAAR was prevented. After spinal cord injury, the disruption of flexion/extension and left-right alternations is largely attributed to a deterioration of the inhibitory circuitry below the lesion, but most of the cellular mechanisms are still unknown. Our aim of this was to measure the alteration of the GABA and glycinergic synaptic transmission on lumbar motoneurons (Mns) after spinal cord transection (SCT) in the adult rat, and evaluate the benefit of manual training and stepping recovery on the inhibitory networks. All in all our results show that, the presynaptic and postsynaptic components of the glycinergic synapses are relatively preserved on lumbar Mns. We developed a manual training procedure, based on daily alternate phases of imposed stepping and free walking in enriched environment. Pharmacological treatment with 5-HT2 receptor agonists allowed a standing recovery and alternate stepping.

Le co-transporteur potassium-chlorure 2, KCC2, contrôle la concentration intracellulaire des ion chlorure (Cl-) dans les neurones matures et régule ainsi la force inhibitrice de l'acide γ-amino butyrique (GABA) et de la glycine, principaux neurotransmetteurs inhibiteurs du système nerveux central. Plusieurs troubles neurologiques sont associés à une diminution de l'expression de KCC2, qui se traduit par l'hyperexcitabilité du réseau neuronal. L'objectif de ce travail de thèse était d'identifier et caractériser les éléments structuraux de la protéine qui sont impliqués dans la régulation de son activité d'un point de vue physiologique et pathologique. J'ai développé de nouvelles approches pour enregistrer l'activité de transporteur d'ions ainsi que l'expression membranaire de KCC2. Ces outils m'ont permis de caractériser de nouveaux éléments structuraux qui régulent le fonctionnement de cette protéine, à savoir, son insertion dans la membrane plasmique, son internalisation ou encore son activité intrinsèque de transporteur d'ions. Enfin, nous avons montré que deux mutations (R952H et R1049C), identifiées chez des patients atteints d'épilepsie idiopathique généralisée (EIG), entrainent la diminution de l'expression membranaire de la protéine et de sa fonction de transporteur de Cl- in vitro. Nos résultats changent la vision actuelle du rôle fonctionnel des régions de KCC2, soulignent l'importance d'étudier l'expression membranaire de la protéine, conjointement à son activité de transporteur, et enfin, démontrent pour la première fois que des mutations sur le gène KCC2, retrouvées chez des patients atteints d'EGI, peuvent perturber le fonctionnement du transporteur. / The potassium chloride co-transporter 2, KCC2, controls the intracellular chloride (Cl-) concentration in mature neurons and thus regulates the inhibitory forces of γ-amino butyrique (GABA) and glycine, the major inhibitory neurotransmitters in the central nervous system. Several neurological disorders are associated with down-regulation of KCC2 expression, resulting in hyperexcitability of neural network. The aim of this thesis was to identify and characterize the structural elements of the protein involved in the regulation of its activity under physiological and pathological conditions. I developed new approaches to record ion-transport activity and membrane expression of KCC2. These tools allowed me to characterize new structural elements regulating the functioning of the protein, namely insertion into plasma membrane, internalisation or intrinsic activity of ion-transport. Finally, we showed that two mutations (R952H and R1049C) identified in patients with idiopathic generalized epilepsy (IGE), cause the decrease in membrane protein expression and its function of Cl-transporter in vitro. Our results change the current view on the functional role of KCC2 regions, emphasize the importance of studying membrane protein expression, together with its transporter activity, and finally, demonstrate for the first time that mutations in the KCC2 gene found in patients with EGI, may interfere with transporter function.

Les interneurones GABAergiques dans l’hippocampe forment de petites populations diverses de neurones inhibiteurs contrôlant le transfert d’informations dans de larges ensembles de cellules principales. Ils compensent leur infériorité numérique par de vastes arborisations axonales capables de maintenir une libération vésiculaire de GABA à haute fréquence, et d’ajuster précisément la balance entre excitation et inhibition pour différents régimes d’activité du réseau. Les petites synapses centrales contiennent un nombre limité de vésicules synaptiques dont le recyclage par endocytose est essentiel au maintien de la transmission pendant une activité répétée. Le remplissage en GABA de ces vésicules recyclées est dépendant d’un approvisionnement des terminaisons en GABA suffisant pour faire face à la demande de recyclage créée par l’activité. Nos résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes d’adaptation de l’approvisionnement aux besoins imposés par le recyclage vésiculaire selon le régime d’activité, ainsi qu’un couplage direct entre le cycle de neurotransmetteurs et le cycle vésiculaire. Nous montrons que les transporteurs de glutamine sont responsables d’une potentialisation de l’approvisionnement des varicosités en GABA lors d’une activité répétée, probablement par une augmentation du nombre de ces transporteurs à la membrane. En développant et en utilisant des paradigmes expérimentaux nouveaux, nous montrons que la régulation métabolique du cycle vésiculaire passe par une adaptation du pool de vésicules recyclantes à la disponibilité en neurotransmetteurs. La nature du senseur de cette régulation et sa localisation cytosolique ou luminale restent à déterminer / In the hippocampus, GABAergic interneurons represent only 10% of the neuronal population but are able to synchronize the activity of large neuronal networks. They compensate their numerical inferiority by a large axonal arborization to sustain synaptic activity at high frequency and adjust the balance between excitation and inhibition for different regime of activity. Since small central synapses contain a limited pool of vesicles, their recycling by endocytosis is essential to maintain transmission during repeated activity. The filling of recycling vesicles with GABA is dependent on its supply in terminals which should be adjusted to the demand imposed by vesicular recycling. Our results reveal new transporter mechanisms that adapt GABA supply to neuron activity, suggesting a direct coupling between the neurotransmitter and the vesicle cycles. We show that high recycling activity increases GABA supply, probably by increasing the number of glutamine transporters at the membrane. By developing and using FM5-95 and VGAT-pHluorin with a new experimental paradigm, we provide evidence for a metabolic regulation of the vesicle cycle that involves a dynamic adaptation of the recycling pool to the neurotransmitter availability. The nature of the sensor of this regulation and its cytosolic or luminal location remain to be determined.