Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Nous avons récemment mis en évidence des neurones GABAergiques jouant un rôle de « hub » dans l'hippocampe immature, orchestrant la synchronisation neuronale via une arborisation axonale dense. Dans ma thèse, j'ai d'abord montré, grâce à des enregistrements électrophysiologiques par paires, que les hubs étaient connectés à de nombreux neurones par des synapses GABAergiques fonctionnelles (Bonifazi et al. 2009). Puis, en utilisant des souris mutantes conditionnelles où les neurones sont marqués en fonction de leur origine embryonnaire, j'ai démontré que les neurones GABAergiques générés le plus tôt formaient une famille de hubs. Ces neurones sont toujours présents chez l'adulte et deviennent des neurones GABAergiques de projection extrahippocampique. Ceci suggère que la fonction de ces neurones serait maintenue, du moins anatomiquement, au stade adulte. / We have recently demonstrated the existence of functional hubs driving network synchronizations in the developing hippocampus. Hubs are a subpopulation of GABAergic neurons displaying widespread axonal projections. During my PhD, using paired electrophysiological recordings, I have shown that hub cells are synaptically connected to a large number of neurons (Bonifazi et al. 2009). Next, using genetic fate mapping approaches, I have demonstrated that early born GABAergic neurons constitute a subpopulation of hub cells. These pioneer hub cells remain into adulthood and develop into GABAergic neurons with an extrahippocampal projection (Picardo et al. 2011). This suggests that hub function may to retained into adulthood, at least structurally.

La leucomalacie periventriculaire est l’une des causes principales d’infirmité motrice cérébrale chez le nouveau-nés prématurés. Notre hypothèse est qu’une inflammation maternelle sensibilise le cerveau immature à des lésions de la substance blanche (SB) et neuronales excitotoxiques. Afin de la tester, des rates Sprague Dawley ont reçu de LPS d’E.coli à 19 et 20 jours de gestation. Les rates témoins ont reçu des injections de PBS. Les rats nouveau-nés ont reçu d’iboténate à P4 puis sacrifiés à P5 et P9. Dans le groupe LPS vs temoin, nous avons montré une aggravation des lésions de la substance blanche caractérisées par une activation microgliale, hypomyélinisation et astrogliose. Une diminution des neurones GABAergiques et dopaminergiques était associée aux lésions de la SB. Nous avons montré une diminution de la liaison des récepteurs dopaminergiques D1 et D2 aux ligands spécifiques. Le LPS potentialise les effets de l’Ibo en majorant les lésions cérébrales macroscopiques et diffuses. / The periventricular leucomalacia is one of the main causes of cerebral palsy in premature infants. This disorder desease is multifactorial. Our hypothesis is that maternal inflammation sensitizes the immature brain to white matter (WM) and neuronal excitotoxic lesions. To test it, Sprague Dawley rats received LPS E. Coli at 19 and 20 days of gestation. The female control have received injections of PBS. The newborn rats received iboténate at P4 and then sacrificed at P5 and P9. In LPS groups vs control groups, immunohistochemical study showed an aggravation of histological lesions of the WM characterized by microglial activation, a hypomyelinisation and astrogliose. A decrease in GABAergic neurons and dopaminergic neurons were associated with WM lesions. Autoradiographic studies also showed a decrease of dopaminergic receptors D1 and D2 binding specific ligands. In this study, we showed that the LPS potentiates the effects of the Ibo by increasing macroscopic and diffuse brain injury.

La mise en place des circuits neuronaux fonctionnels se construit autour d'une grande diversité cellulaire et nécessite l'accomplissement d'une série d'évènements complexes incluant la prolifération, la migration, la différenciation, le guidage axonal, la reconnaissance cellulaire et la synaptogenèse des progéniteurs neuronaux. Dans le cervelet, les interneurones GABAergiques de la couche moléculaire (IGCM) s‘intègrent au cours des deux premières semaines post-natales et se différencient en deux sous-types cellulaires, les cellules en panier (CP) qui innervent le segment initial de la cellule de Purkinje, cellule principale du cervelet, et les cellules étoilées qui innervent l'arbre dendritique de la cellule Purkinje. Bien que ces deux types cellulaires possèdent des morphologies distinctes et innervent des sous-domaines cellulaires spécifiques, aucun marqueur moléculaire ne permet de les discriminer. Depuis près d'un siècle, la controverse existe concernant leur identité et deux théories s'affrontent. La première suggère que ces deux cellules sont des variantes issues d'un même progéniteur et que les différences morphologiques sont dues à un changement progressif de l'environnement cellulaire alors qu'une autre hypothèse suggère que ces deux cellules proviennent de progéniteurs neuronaux différents. Au cours de ma thèse j'ai étudié l'intégration des IGCM au sein de la couche moléculaire (CM) en caractérisant deux étapes clés de la formation des circuits GABAergiques, la migration et l'innervation de leur cible. En utilisant une combinaison de techniques telles que la microscopie bi-photonique et les greffes in vivo de progéniteurs neuronaux, j'ai mis en évidence que durant la première semaine post-natale, les IGCM quittent leur lieu de naissance pour rejoindre la CM en réalisant une seule étape de migration radiale. De manière intéressante certains IGCM accomplissent une étape de migration supplémentaire inédite tangentiellement à la surface piale pendant la deuxième semaine post-natale. Cette nouvelle phase de migration tangentielle des IGCM se déroule au sein de la couche granulaire externe où résident les cellules granulaires pré-migratoires dont les fibres qui expriment TAG-1 jouent un rôle essentiel en tant que support physique et participent à l'établissement des IGCM en mode “inside-out”. De plus, nos résultats suggèrent que seule une sous-population de type cellule étoilée effectuerait cette étape supplémentaire, montrant ainsi une première divergence dans le processus de maturation des IGCM. Par la suite, je me suis intéressée à l'innervation des cellules de Purkinje par les CP nouvellement différenciées. En utilisant des techniques d'immuno-histochimie, j'ai tout d'abord montré que la Neuropiline-1 (NRP1), un des récepteurs de la Sémaphorine-3A, était exprimé au niveau des terminaisons axonales des CP. Enfin, grâce à l'analyse d'un mutant conditionnel pour NRP1, j'ai pu mettre en évidence qu'en plus de son rôle crucial dans le guidage axonal des CP, NRP1 est également impliquée dans l'innervation spécifique du segment initial axonal des cellules de Purkinje en interagissant avec une molécule d'adhésion cellulaire de la famille L1CAM, la Neurofascine. Ces résultats démontrent pour la première fois un rôle de NRP1 dans la transition entre l'étape de guidage avec celle de la reconnaissance cellulaire par les CP. En conclusion, nos résultats suggèrent fortement que les deux sous-types d'IGMC possèdent un programme génétique spécifique leur permettant de s'intégrer de manière unique au sein de la CM. / The establishment of functional neural circuits is built around a large cell diversity and requires the completion of a series of complexe events including proliferation, migration, differentiation, axon guidance, cell recognition and synaptogenesis of neural precursors. In the cerebellum, molecular layer GABAergic interneurons (MLGI) reach their final location during the first two post-natal weeks and differentiate into two cellular subtypes, the basket cells (BC) that innervate the Purkinje cell initial segment and the stellate cells that innervate the dendritic tree of the Purkinje cell, the principal cell of cerebellar cortex. Although these two cell types have distinct morphologies and innervate specific subcellular domains, no molecular marker allows to discriminate between them. For nearly a century, controversy exists concerning their identity and two theories exist. The first one suggests that these two cell types are variants derived from a single progenitor and that morphological divergence is due to a gradual change in the cellular environment while the other hypothesis suggests that these two cell types come from different progenitors. During my thesis, I studied the integration of the MLGI in the molecular layer (ML) characterizing two key steps in the formation of GABAergic circuits, migration and innervation of their target. Using a combination of techniques such as two-photon microscopy and in vivo transplantation of neural progenitors, I highlighted that during the first post-natal week, MLGI leave their birthplace to join the ML by performing a single radial migration step. Interestingly, some MLGI perform an unexpected additional migration step tangentially to the pial surface during the second post-natal week. This new phase of MLGI tangential migration takes place in the external granule cell layer where resident pre-migratory granule cells whose fibers expressing TAG-1 play an essential role as physical support and participate in the establishment of MLGI « inside-out » mode. In addition, our results suggest that only a stellate-like subpopulation would perform this extra step, bringing the first indication of an early divergence during MLGI maturation process. Then, I was interested in the innervation of Purkinje cells by newly differentiated BC. Using immunohistochemistry experiments, I first showed that Neuropilin-1 (NRP1), a Semaphorin-3A receptor, was expressed in the BC axon terminals. Finally, through the analysis of a NRP1 conditional mutant, I brought out that, in addition to its critical implication in axon guidance, NRP1 is also involved in the specific innervation of the Purkinje cell axon initial segment by interacting with a cell adhesion molecule belonging to the L1 family, Neurofascin. These results demonstrate for the first time a role of NRP1 in the transition between the guidance and the cell recognition steps by BC. In conclusion, our results strongly support that the two MLGI subtypes have a specific genetic program allowing them to integrate within the ML in a unique manner.

L'agrégation des canaux sodium (Nav) aux nœuds de Ranvier est une étape importante pour la propagation électrique saltatoire rapide le long des axones myélinisés. L'assemblage des nœuds dépend d'interactions neurones-cellules gliales myélinisantes, les oligodendrocytes dans le système nerveux central (SNC) et les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique (SNP). Bien décrits dans le SNP, les mécanismes cellulaires et moléculaires restent à caractériser dans le SNC. Lors de ma thèse, je me suis focalisé sur les étapes précoces d'assemblage des nœuds dans le SNC. Ce travail montre que des agrégats de protéines nodales (ou pré-nœuds) sont formés le long des axones de neurones GABAergiques avant la myélinisation dans des cultures neurones-glies d'hippocampe et également au cours du développement chez les rongeurs. La formation de pré-nœuds dépend de protéines sécrétées par les oligodendrocytes et de la protéine axonale d'échafaudage, ankyrineG. En outre, la transition des isoformes de Nav le long des axones est régulée par la présence des cellules gliales. Enfin, les pré-nœuds permettent d'accélérer la vitesse de conduction de l'influx nerveux par un facteur 1,5, indépendamment de la myélinisation et du calibre axonal. Globalement, ces résultats renforcent notre connaissance des mécanismes d'assemblage des nœuds de Ranvier dans le SNC et suggèrent une fonction développementale de l'agrégation nodale avant le début de la myélinisation. Si la vitesse de conduction a été décrite comme liée aux propriétés isolantes de la gaine de myéline, les résultats de cette thèse apportent un concept novateur de régulation de la conduction axonale en l'absence de myéline. / The clustering of sodium channels (Nav) at the nodes of Ranvier is an important step in permitting rapid saltatory conduction along myelinated axons. Nodal assembly is neuron-glia dependent, mediated by myelinating oligodendrocytes of the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). While the mechanisms of nodal assembly are currently best characterized in the PNS, cellular and molecular mechanisms underlying their assembly in the CNS are only partially understood. In the core of my PhD dissertation, I focused on the early developmental steps of nodal protein clustering in the CNS and show that clusters of nodal proteins, called prenodes, are detected before myelination along GABAergic axons in hippocampal neuron-glia cultures and also in the developing rodent hippocampus. Prenodal clustering requires extrinsic oligodendroglial secreted proteinaceous factors, and also the intrinsic axonal cytoskeletal scaffolding protein ankyrinG. Furthermore, the transition of sodium channels isoforms is tightly regulated along GABAergic axons during development, but this transition is lost in the absence of the physical presence of glial cells. Lastly, prenodes increase axonal conduction by a factor of 1.5x, independently of myelination and axonal caliber. Taken together, these results further our understanding of CNS nodes of Ranvier assembly mechanisms and the developmental function of nodal clustering prior to myelin ensheathment. While conduction velocity along axons has long been thought to mostly rely on the insulating properties of myelin, these results may shed light on a new concept of axonal conduction in the absence of myelination.

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative déterminée par deux caractéristiques : les plaques extracellulaires composées d’amyloïde-β et l’accumulation intracellulaire de tau hyperphosphorylée, appelée enchevêtrements neurofibrillaires. Malgré le nombre important d’études, la nature de la toxicité des espèces tau hyperphosphorylée et hypophosphorylée reste mal connue. Notre projet de recherche vise à caractériser quel état de phosphorylation de la tau contribue le plus à la toxicité neuronale ainsi que d’identifier les mécanismes sous-jacents. Pour répondre à ces objectifs, nous avons généré des modèles transgéniques de C. elegans exprimant soit une tau hyperphosphorylée humaine (12 glutamates pour mimer l’hyperphosphorylation de la tau trouvée chez des patients Alzheimer), une tau sauvage, ou une tau hypophosphorylée (12 alanines pour mimer l’hypophosphorylation), dans les motoneurones GABAergiques. Ensuite, pour caractériser nos modèles, nous avons mesuré leur comportement principalement avec des tests de locomotion en utilisant le logiciel WormLab. Nos résultats ont montré que la tau phosphorylée est l’espèce la plus toxique car la souche hyperP a montré une perturbation du système locomoteur se traduisant par une neurodégénérescence ainsi que des problèmes développementaux (longueur des vers). Puis nous avons testé certains médicaments utilisés dans des modèles de tauopathies, afin d’identifier des voies biologiques impliquées dans la toxicité de la tau hyperphosphorylée. Pour conclure, nos modèles vont être des outils utiles pour identifier des modificateurs génétiques et pharmacologiques dans la toxicité de la tau. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by two hallmarks: extracellular plaques composed of amyloid-β (Aβ) deposits and intraneuronal accumulation of hyper and abnormal phosphorylated tau, also called neurofibrillary tangles (NFT). Despite many decades of research, the nature hypophosphorylated or hyperphosphorylated Tau toxicity remains ill understood. Our research project aims to characterize which state of Tau phosphorylation contributes to neuronal toxicity and identify the underlying mechanisms. To assess these objectives, we generated transgenic C. elegans models expressing either a human hyperphosphorylated tau (incorporation of 12 glutamate residues to mimic Tau hyperphosphorylation found in AD’s patients) human wild type Tau, or a human hypophosphorylated tau (incorporation of 12 alanine residues to mimic Tau hypophosphorylation) in the GABAergic motoneurons. Then, to characterize our models, we measured their behavior mainly with locomotion’s test using WormLab software. Our results showed that hyperphosphorylation of tau is the most toxic species for our models because hyperP strain showed an impair in the locomotor system translating into neurodegeneration, as well as developmental problems such as worm length. Then we tested some drugs used in taupathies C. elegans models to see if we could identify some biological pathways implicated in the toxicity. To conclude, our models may be a useful tool to identify genetic and pharmacological modifiers of tau toxicity.

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Au cours de ma thèse, mes projets de recherche ont visé à mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la spécification des cellules progénitrices dans la rétine du xénope à travers trois projets principaux. Le réseau de régulation qui contrôle la spécification des cellules progénitrices vers les sous-types neuronaux est à ce jour très peu connu. C'est dans ce contexte que j'ai étudié le rôle du facteur de transcription à domaine bHLH, Ascl1, dans la détermination des sous-types rétiniens au cours du développement. Par des approches in vivo de gain et perte de fonction d'Ascl1, des expériences d'épistasie et la recherche de ses cibles transcriptionnelles, j'ai pu mettre en évidence qu'Ascl1 (i) est impliqué dans la genèse des neurones GABAergiques rétiniens, (ii) qu'il est épistatique sur des facteurs glutamatergiques tels que Neurog2, NeuroD1 ou Atoh7, (iii) que son activité GABAergique est conférée par son domaine basique de liaison à l'ADN et (iv) que cette activité implique la régulation directe du facteur de transcription Ptf1a. Ces données ajoutent donc une nouvelle pièce au réseau transcriptionnel gouvernant la spécification des sous-types GABAergiques au cours du développement de la rétine. La mise en place correcte des types et sous-types cellulaires de la rétine nécessite une coordination avec le moment de sortie du cycle cellulaire des progéniteurs rétiniens. Dans ce contexte, j'ai contribué à l'avancée d'un projet visant à étudier le réseau de signalisation contrôlant la prolifération des précurseurs de la rétine. Par des approches in vivo, génétiques et pharmacologiques, cette étude a montré que les voies Wnt et Hedgehog s'antagonisent pour réguler l'activité proliférative des cellules souches et progénitrices rétiniennes. Nos données préliminaires suggèrent que ces voies agissent de façon opposée à la fois sur la sortie et sur la cinétique du cycle cellulaire. Ce travail nous a conduit à proposer un modèle selon lequel ces voies Wnt et Hedgehog réguleraient la balance entre prolifération et différenciation dans la rétine post-embryonnaire. Enfin, dans le but d'élargir nos connaissances sur les réseaux de signalisation et les réseaux transcriptionnels impliqués dans le contrôle de la prolifération et de la détermination cellulaire dans la rétine, j'ai également contribué à la recherche de nouveaux marqueurs spécifiques des différentes populations cellulaires rétiniennes au travers d'un crible à grande échelle par hybridation in situ. De nombreux gènes spécifiquement exprimés dans les cellules souches ou les cellules progénitrices constituent des gènes candidats pour de futures approches fonctionnelles.

La moelle épinière assure la transmission des messages nerveux entre l’encéphale et le reste du corps et assure la coordination des mouvements rythmiques de la locomotion. Elle est constituée d’un grand nombre de types différents d’interneurones et de neurones moteurs, organisés en circuits neuronaux. Les circuits impliqués dans la transmission des informations sensorielles et dans les mouvements des membres sont localisés respectivement dans les parties dorsale et ventrale de la moelle épinière. Les mécanismes moléculaires contrôlant la spécification de ces différents types de neurones dans la moelle épinière restent actuellement mal connus. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée à la famille des gènes Prdm (PR Domain containing methyltransferase). Ces gènes sont conservés évolutivement. Ils codent pour des facteurs de transcription jouant des rôles importants dans le développement embryonnaire et sont fréquemment impliqués dans des maladies chez l’Homme. Ces facteurs sont caractérisés par la présence d’un domaine PR semblable au domaine SET trouvé dans des protéines à activité histone méthyltransférase et d’un nombre variable de doigts à zinc. Je me suis focalisée essentiellement sur les gènes Prdm12 et Prdm13, des gènes exprimés de manière précoce et localisés dans le système nerveux en développement et dont la fonction était totalement inconnue. Nos résultats ont montré que l’expression de Prdm12 dans la partie ventrale de la moelle épinière est dépendante de l’acide rétinoïque et du facteur de transcription Pax6 et que Prdm12 est restreint au domaine p1 via l’action répressive des facteurs de transcription Dbx1 et Nkx6 exprimés dans les domaines de progéniteurs adjacents. Prdm12 fonctionne comme déterminant de la destinée des interneurones V1, des interneurones impliqués dans le contrôle des mouvements de la locomotion et essentiels à la survie des neurones moteurs. Prdm12 agirait en réprimant, probablement directement, l’expression des gènes Dbx1 et Nkx6.1/2, ses domaines PR et ZnF étant tous deux requis pour son activité. Nos données indiquent aussi que Prdm13, qui est exprimé dans la partie dorsale de la moelle épinière, constitue une cible directe du complexe Ptf1a-Rbpj et qu’il est requis en aval de Ptf1a pour une balance correcte des neurones glutamatergiques et GABAergiques. Elles suggèrent que Prdm13 fonctionnerait, au moins en partie, en bloquant l’activité d’autres facteurs proneuraux tels que Ngn2 (Neurog2) ou Ascl1 (Mash1) présents dans la partie dorsale de la moelle épinière et qui induisent une destinée excitatrice glutamatergique. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Caspr2 est une molécule d'adhérence impliquée dans diverses pathologies neurologiques telles que l'autisme et l'encéphalite limbique (EL). Les mécanismes pathogéniques restent inconnus. Caspr2 est associé aux canaux potassiques Kv1.1/1.2 aux juxtaparanoeuds et au segment initial (SI). Dans un premier article publié dans Front. Cell. Neurosci. (2015), nous avons mis en évidence que les autoanticorps anti-Caspr2 issus de patients atteints d'EL ciblent majoritairement les neurones GABAergiques. Caspr2 est localisé au niveau des axones et des terminaisons présynaptiques inhibitrices dans les neurones d'hippocampe en culture. De plus, nous avons généré une chimère Caspr2-Fc soluble qui a permis d’identifier TAG-1 comme récepteur de Caspr2 localisé au niveau du compartiment somato-dendritique postsynaptique. Les neurones incubés avec des IgGs de patients, présentent une densité diminuée des clusters de Géphyrine marqueur des post-synapses inhibitrices. Ces anticorps sont d'isotype IgG4 et reconnaissent le plus communément des épitopes de la région Discoïdine-LaminineG1. Un blocage fonctionnel de Caspr2 au niveau synaptique permettrait de comprendre l'hyperexcitabilité associée à l'EL. Dans un second article en préparation, nous avons étudié la régulation de l’expression de Caspr2 au SI. Nous avons utilisé différentes constructions et identifié les domaines LamineG2-EGF1 extracellulaires de Caspr2 requis pour son expression axonale. De plus, les domaines cytoplasmiques de liaison aux protéines 4.1B et PDZ sont impliqués dans la rétention de Caspr2 et MPP2 au SI. Notablement, l'expression de TAG-1 ou ADAM22 induit des effets opposés sur l'expression de Caspr2 au SI. / Caspr2 is a cell adhesion molecule associated with neurologic diseases, such as autism spectrum disorders and limbic encephalitis. The underlying pathogenic mechanisms are still unknown. Caspr2 is associated with the voltage-gated potassium channels Kv1.1/1.2 localized at the axon initial segment (AIS) and the juxtaparanodes in myelinated axons. In a first paper published in Front. Cell. Neurosci. (2015), we characterized anti-Caspr2 autoantibodies from limbic encephalitis (LE) patients and showed that these autoantibodies preferentially targeted GABAergic neurons. Caspr2 was localized along axons and at the presynaptic terminals of inhibitory neurons in hippocampal cultures. Next, we generated a soluble Caspr2-Fc chimera to identify TAG-1 as a receptor for Caspr2 localized at the somato-dendritic compartment and post-synapses. We determined that neurons displayed decreased synaptic gephyrin clusters when incubated with anti-Caspr2 IgGs from LE patients. The autoantibodies mainly bound the N-terminal Discoidin-LamininG1 domains and were of the IgG4 isotype. They may exert functional blocking activity on inhibitory connections underlying the hyperexcitability linked with LE. In a second article in preparation, we examined the regulated expression of Caspr2 at the AIS using deletion and reporter constructs. We mapped the LamininG2 and EGF1 modules in the ectodomain as implicated in the axonal distribution of Caspr2 and the cytoplasmic motifs for binding to 4.1B and PDZ proteins as implicated in Caspr2 AIS retention together with MPP2. Strikingly, co-expression with TAG-1 and ADAM22 induced opposite effects on AIS Caspr2 distribution.