Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular / En los Errores Innatos del Metabolismo (EIM), los cultivos de fibroblastos (FB) a partir de biopsia de piel, han sido desarrollados con el objetivo de obtener material para la determinación enzimas deficientes en este tipo de patologías y establecer un diagnóstico definitivo. Este tipo de diagnóstico es realizado en laboratorios especializados, debido a la complejidad en el manejo y mantención de los cultivos de FB. El envío de muestras de FB a estos centros debe ser realizado en condiciones que garanticen la viabilidad de las células durante el trayecto, con el objetivo de evitar un retraso en el diagnóstico, lo que podría ocasionar daño neurológico irreversible o la muerte de estos pacientes. Entre los EIM, el grupo de Enfermedades de Depósito Lisosomal (EDL) han sido ampliamente diagnosticadas mediante análisis enzimático sobre muestras de FB. La detección de enzimas lisosomales deficientes en muestras de FB permite confirmar el diagnóstico en este tipo de patologías. El uso de gotas de sangre seca (GSS) en papel filtro ha permitido el desarrollo de Programas de Pesquisa Neonatal para diversos EIM, ya que se ha demostrado ampliamente la estabilidad de metabolitos y enzimas en GSS en papel filtro. Además, la toma de muestra, el transporte y almacenamiento de muestras en este tipo de soporte se ven facilitados. El objetivo de este estudio fue evaluar la estabilidad de la actividad específica de betagalactosidasa, enzima lisosomal deficiente en la Gangliosidosis GM1, un tipo de EDL, en muestras de lisados de FB obtenidos a partir de la línea celular 3T3-L1 y dispuestos en papel filtro. Las muestras fueron sometidas a distintas condiciones de tiempo y temperatura de almacenaje para la evaluación de la actividad enzimática. Las muestras mantenidas a 4°C mostraron estabilidad de la actividad enzimática de betagalactosidasa hasta al menos los 28 días de almacenaje. Las muestras re-almacenadas a 4°C y - 70°C presentaron una mayor estabilidad de la actividad de beta-galactosidasa, en comparación con otras temperaturas de re-almacenaje estudiadas / In Inborn Errors of Metabolism (IEM), fibroblasts (FB) cultures from skin biopsy have been developed in order to obtain material for the determination of deficient enzymes in this type of pathologies and to establish a definitive diagnosis. This type of diagnosis is performed in specialized laboratories, due to the complexity of sample handling and FB culture maintenance. Shipment of FB samples to these centers must be carried out under conditions that guarantee the viability of the cells during the journey, in order to avoid a delay in diagnosis, which may cause irreversible neurological damage or death of these patients. Among the IEM, the Lysosomal Storage Diseases (LSD) group, has been widely diagnosed by enzymatic analysis of FB samples. The detection of deficient lysosomal enzymes in FB samples allows us to confirm the diagnosis in this type of pathology. The use of dried blood spots (DBS) on filter paper has allowed the development of Neonatal Screening Programs for various IEM, because the stability of metabolites and enzymes in DBS on filter paper has been widely demonstrated. Furthermore, sample collection, transport and storage of samples in this type of support are facilitated. The aim of this study was to evaluate the stability of the beta-galactosidase, a lysosomal enzyme that is deficient in GM1 gangliosidosis, a type of EDL, in fibroblasts lysates obtained from the 3T3- L1 cell line and collected on filter paper. Samples were studied under different conditions of time and temperature of storage for the enzymatic activity assessment. Samples kept at 4°C maintained the stability of enzyme activity for at least 28 days of storage. Samples stored at 4°C and -70°C showed increased stability when are re-stored in these temperatures.

En aquesta tesi s'ha realitzat una aproximació genètica i molecular a les malalties Gangliosidosi GM1 i Morquio B. Aquestes dues malalties són causades per mutacions en un únic gen, el gen GLB1. Aquest gen codifica per la proteïna beta-galactosidasa lisosòmica, de manera que mutacions al gen GLB1 alteren la funcionalitat d'aquesta proteïna. Això pot conduir a l'acumulació dels diferents substrats que normalment són degradats per la beta-galactosidasa: el gangliòsid GM1, el queratà sulfat i diferents oligasacàrids proteics. En aquesta tesi es presenten els resultats de la cerca de mutacions en 49 pacients amb Gangliosidosi GM1 i 5 amb Morquio B. Els pacients estudiats provenien bàsicament d'Espanya i d'Argentina. Es van poder identificar 52 mutacions diferents de les que 32 no havien estat descrites prèviament. A més a més, per a la majoria de mutacions identificades es va poder establir una correlació entre la mutació trobada i un fenotip determinat de la malaltia. La mutació R59H va ser la mutació més prevalent a les poblacions analitzades, essent especialment prevalent als pacients d'ètnia gitana, on aquesta va ser l'única mutació descrita. A més a més, en aquests pacients la mutació R59H sempre es va trobar associada a un mateix haplotip, cosa que indicaria un origen únic del canvi R59H dins de la població gitana.Posteriorment, algunes de les mutacions identificades van ser expressades in vitro utilitzant com a sistema d'expressió les cèl.lules COS-7 transfectades amb Lipofectamina. D'aquesta manera es van expressar 15 variants mutades de la beta-galactosidasa. Les variants causants de la forma infantil (la forma més severa) van mostrar una activitat enzimàtica residual nul.la, mentre que 3 variants associades a formes més lleus (el tipus adult i la malaltia de Morquio B) van resultar en activitats residuals amb un rang del 7-15%. Per altra banda, 3 canvis que eren polimòrfics (no patogènics) van ser els que van presentar una activitat enzimàtica residual més elevada, al voltant del 30-60%. Així doncs, es va poder concloure que el sistema d'expressió emprat era un bon sistema per establir correlacions entre les activitats residuals de les variants mutades i el fenotip associat a cadascuna d'elles.Finalment, es van dur a terme una sèrie d'experiments per entendre el mecanisme que regula el procés d'splicing alternatiu del gen GLB1. Aquest gen codifica dues proteïnes diferents (la beta-galactosidasa i l'EBP) gràcies a un mecanisme d'splicing alternatiu. Al transcrit de l'EBP, els exons 3, 4 i 6 són exclosos del transcrit madur. Diferents experiments van mostrar que el mecanisme d'NMD ("Nonsense-mediated decay") s'encarrega d'eliminar les combinacions d'exons errònies, fent que únicament els dos transcrits funcionals romanguin estables a la cèl.lula. Paral.lelament, mitjançant la cotransfecció de plasmidis que codificaven diferents proteïnes SR junt amb un minigèn construït amb els exons implicats en l'splicing alternatiu del gen GLB1, es va poder comprovar que les proteïnes SR tenien la capacitat de modificar la proporció en que es generaven les diferents combinacions d'exons en els transcrits obtinguts a partir del minigèn. Això indicaria que les proteïnes SR, que juguen un paper essencial en el procés d'splicing cel.lular, podrien tenir també una funció en la regulació de l'splicing alternatiu del gen GLB1.

[ES] Esta tesis doctoral titulada "Desarrollo y validación de nuevas estrategias senolíticas para la selección y eliminación de células senescentes" se centra en el diseño, síntesis y validación de nanodispositivos y profármacos para eliminar células senescentes, con el objetivo de tratar enfermedades relacionadas con el envejecimiento y el cáncer. En el primer capítulo experimental, presentamos un nanodispositivo para eliminar selectivamente células senescentes explotando la actividad enzimática específica del secretoma senescente. Los resultados mostraron que tras la inducción de senescencia en fibroblastos WI-38 proliferantes con radiación ionizante, las células secretan altos niveles de metaloproteinasa de matriz 3 (MMP-3). Basándose en esto, se cargaron MSNs con navitoclax y se recubrieron con un péptido específico de MMP-3 ( "puerta molecular"), obteniendo NPs(Nav)@MMP-3. Los estudios celulares demostraron una liberación preferencial de la carga en células senescentes en comparación con células proliferantes. Además, el tratamiento de células senescentes con NPs(Nav)@MMP-3 indujo una disminución de la viabilidad celular similar a la del navitoclax, mientras que se observó un efecto protector sobre las células proliferantes. Partiendo de estos resultados en el segundo capítulo experimental describimos una nanopartícula para terapia senolítica mediada por células inmunitarias. Para ello, las nanopartículas recubiertas con el péptido específico de MMP-3 se decoraron con la quimioquina CXCL12 (NPs@CXCL12), potenciando el reclutamiento de células inmunitarias al microambiente senescente. Se verificó la liberación progresiva y específica de la proteína CXCL12 en presencia de MMP-3 mediante ensayos de liberación controlada. Posteriormente, se confirmó la capacidad de las nanopartículas para atraer células T Jurkat a un microambiente senescente mediante ensayos de migración. Los resultados revelaron que las NPs@CXCL12 ejercían un efecto quimiotáctico más significativo que la CXCL12 libre. Además, también se evaluó la capacidad de las células asesinas naturales primarias humanas para eliminar WI-38 senescentes, y se monitorizaron sus trayectorias de migración en respuesta a NPs@CXCL12 o CXCL12 libre utilizando un dispositivo de microfuídica. En el capítulo experimental tres, nos centramos en el diseño de un nanodispositivo dirigido al surfaceoma senescente. En concreto, demostramos que la inducción de la senescencia con palbociclib en células de melanoma humano desarrollaba un fenotipo senescente con sobreexpresión de dipeptidil peptidasa-4 (DPP4).Aquí, se cargaron MSNs con navitoclax, se cubrieron con polietilenglicol que contiene disulfuro ("puerta molecular" sensible a redox) y se funcionalizaron con un anticuerpo contra DPP4. La eficacia de las NPs(Nav)@DPP4-PE en la detección y eliminación de células senescentes se validó in vitro e in vivo utilizando un modelo murino de melanoma senescente inducido por palbociclib. El tratamiento redujo significativamente el crecimiento tumoral y eliminó preferentemente las células senescentes. En el cuarto capítulo experimental, investigamos el potencial de la terapia fotodinámica para la detección y eliminación de células senescentes. Para ello, se sintetizó un fotosensibilizador (compuesto 1) basado en boro-dipirrometeno (BODIPY) activado con ß-galactosidasa asociada a senescencia (SA-ß-gal). El compuesto 1 permanece inactivo hasta que la hidrólisis de la galactosa por la enzima SA-ß-gal restaura la emisión de fluorescencia y la generación de oxígeno singlete. La restauración de la fluorescencia, la capacidad de producir especies reactivas de oxígeno y de matar células senescentes en presencia de luz en el compuesto 1 se demostró en modelos de senescencia inducida por terapia in vitro e in vivo. Además, los estudios revelaron que el compuesto 1 desencadena un potente efecto senolítico tras la irradiación de tumores senescentes en modelos de ratón. / [CA] Esta tesi doctoral titulada "Desenvolupament i validació de noves estratègies senolítiques per a la selecció i eliminació de cèl·lules senescents" se centra en el disseny, síntesi i validació de nanodispositius i profàrmacs per a eliminar cèl·lules senescents, amb l'objectiu de tractar malalties relacionades amb l'envelliment i el càncer. En el primer capítol experimental, presentem un nanodispositiu per a eliminar selectivament cèl·lules senescents explotantl'activitat enzimàtica específica del secretoma senescent. Els resultats van mostrar que després de la inducció de senescència en fibroblasts WI-38 proliferants amb radiació ionitzant, les cèl·lules secreten alts nivells de metaloproteinasa de matriu 3 (MMP-3). Basant-se en això, es van carregar MSNs amb navitoclax i es van recobrir amb un pèptid específic de MMP-3 ("porta molecular"), obtenint NPs(Nav)@MMP-3. Els estudis cel·lulars van demostrar un alliberament preferencial de la càrrega en cèl·lules senescents en comparació amb cèl·lules proliferants. A més, el tractament de cèl·lules senescents amb NPs(Nav)@MMP-3 va induir una disminució de la viabilitat cel·lular similar a la del navitoclax, mentres que es va observar un efecte protector sobre les cèl·lules proliferants. Partint déstos resultats en el segon capítol experimental descrivim una nanopartícula per teràpia senolítica mediada per cèl·lules immunitàries. Per a això, les nanopartícules recobertes amb el pèptid específic de MMP-3 es van decorar amb la quimioquina CXCL12 (NPs@CXCL12), potenciant el reclutament de cèl·lules immunitàries al microambient senescent. Ees va verificar l'alliberament progressiu i específic de la proteïna CXCL12 de la bastida en presència de MMP-3 mitjançant assajos d'alliberament controlat. Posteriorment, es va confirmar la capacitat de les nanopartícules per a atraure cèl·lules T Jurkat a un microambient senescent mitjançant assajos de migració. Els resultats van revelar que les NPs@CXCL12 exercien un efecte quimiotàctic més significatiu que la CXCL12. A més, també es va avaluar la capacitat de les cèl·lules assassines naturals primàries humanes per a eliminar WI-38 senescents, i es van monitorar les seues trajectòries de migració en resposta a NPs@CXCL12 o CXCL12 utilitzant un dispositiu de microfuidica. En el capítol experimental tres, ens centrem en el disseny d'un nanodispositiu dirigit al surfaceoma senescent. En concret, vam demostrar que la inducció de la senescència amb palbociclib en cèl·lules de melanoma humà presentava un fenotip senescent amb sobreexpresión de dipeptidil peptidasa-4 (DPP4). Basant-se en esta troballa, es van carregar MSNs amb navitoclax, es van cobrir amb polietilenglicol que conté disulfur, ("porta molecular" sensible a redox) i es van funcionalitzar amb un anticòs contra DPP4. L'eficàcia de les NPs(Nav)@DPP4-PE en la detecció i eliminació de cèl·lules senescents es va validar in vitro i in vivo utilitzant un model murin de melanoma senescent induït per palbociclib.El tractament va reduir significativament el creixement tumoral i va eliminar preferentment les cèl·lules senescents, com van indicar els biomarcadores de senescència analitzats. En el quart capítol experimental, investiguem el potencial de la teràpia fotodinámica per a la detecció i eliminació de cèl·lules senescents. Per a això, es va sintetitzar un fotosensibilizador (compost 1) basat en bor-dipirrometeno activat amb ß-galactosidasa associada a senescència (SA-ß-gal). El 1 roman inactiu fins que la hidròlisi de la galactosa per SA-ß-gal restaura l'emissió de fluorescència i la generació d'oxigen singlete. La restauració de la fluorescència, la capacitat de produir espècies reactives d'oxigen i de matar cèl·lules senescents en presència de llum en el 1 es va demostrar en models de senescència induïda per teràpia in vitro i in vivo. A més, els estudis van revelar que el 1 desencadena un potent efecte senolítico després de la irradiació de tumors senescents en models de ratolí. / [EN] This PhD thesis entitled "Development and validation of novel senolytic strategies for targeting and eliminating senescent cells" focuses on the design, synthesis, and validation of nanodevices and prodrugs to eliminate senescent cells, to treat diseases related to aging and cancer. In the first experimental chapter, we present a nanodevice to selectively remove senescent cells by exploiting the specific enzymatic activity of the senescent secretome. The results showed that after the induction of senescence in proliferating WI-38 fibroblasts with ionizing radiation, the cells secrete high levels of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3). Based on this, MSNs were loaded with navitoclax and coated with a specific peptide; a substrate of MMP-3 (gatekeeper), yielding NPs(Nav)@MMP-3. Cellular studies demonstrated preferential cargo release in senescent cells compared to proliferating cells. Furthermore, treatment of senescent cells with NPs(Nav)@MMP-3 induced a decrease in cell viability similar to that of free navitoclax, while a protective effect on proliferating cells was observed. Building on these results, in the second experimental chapter, we describe a nanoparticle for immune cell-mediated senolytic therapy. To this end, MSNs coated with the specific peptide MMP-3 were decorated with the chemokine CXCL12 (NPs@CXCL12), enhancing immune cells' recruitment to the senescent microenvironment. First, the progressive and specific release of CXCL12 protein from the scaffold in the presence of MMP-3 was verified by controlled release assays. Subsequently, the ability of the nanoparticles to attract Jurkat T cells to a senescent microenvironment was confirmed by migration assays. The results revealed that NPs@CXCL12 exerted a more significant chemotactic effect than free CXCL12. In addition, the ability of human primary natural killer cells to clear senescent WI-38 was also evaluated, and their migration trajectories were monitored in response to NPs@CXCL12 or free CXCL12 using a microfluidic device. In experimental chapter three, we focused on the design of a nanodevice targeting senescent surfaceome. Specifically, the research proved that the induction of senescence with palbociclib in human melanoma cells developed a senescent phenotype characterized by the up-regulated expression of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4). Based on this finding, MSNs were loaded with navitoclax, capped with disulfide-containing polyethylene glycol (redox-sensitive gatekeeper) and finally functionalized with an antibody that recognized the DPP4 protein. The efficacy of NPs(Nav)@DPP4-PE in detecting and eliminating senescent cells was validated in vitro and in vivo using a mouse model of palbociclib-induced senescent melanoma. Furthermore, treatment of mice with the DPP4-targeted nanoparticle significantly reduced tumor growth, and preferentially removed senescent cells, as indicated by the senescence biomarkers analyzed. In the fourth experimental chapter, we investigated the potential of photodynamic therapy for the detection and eradication of senescent cells. For this purpose, a boron dipyrromethene-based photosensitizer (BODIPY) activated with senescent-associated ß-galactosidase (SA-ß-gal) (compound 1) was synthesized. Compound 1 contains a galactose moiety bound to a BODIPY, so it remains inactive until galactose hydrolysis by the SA-ß-gal enzyme restores fluorescence emission and singlet oxygen generation. The restoration of fluorescence, the ability to produce reactive oxygen species, and to kill senescent cells in the presence of light in compound 1 was demonstrated in models of therapy-induced senescence in vitro and in vivo. Furthermore, studies in palbociclib-induced senescent melanoma mouse models reveal that the galactose-conjugated photosensitizer triggers a potent senolytic effect upon irradiation of senescent tumors. / This research was supported by projects PID2021-126304OB-C41 and PID2021-128141OB-C22 funded by MCIN/ AEI /10.13039/501100011033/ and by EuropeanRegional Development Fund - A way of doing Europe. This study was also supported byGeneralitat Valenciana (CIPROM/2021/007). This research was supported by CIBER(CB06/01/2012), Instituto de Salud Carlos III, and Ministerio de Ciencia e Innovación. Thiswork was also supported by the European Research Council (ERC) via Advanced Grant (101052997, EDISON). B.E-N. is grateful to the Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) for the grant through the project “IFI19/00026”, co-funded by the European Union and the company Senolytic Therapeutics S.L for the support. E.G. is grateful to the Spanish MIU and European Union-Next Regeneration EU for her “Margarita Salas” postdoctoral grant (UP2021-036). / Escriche Navarro, B. (2025). Development and validation of novel senolytic strategies for targeting and eliminating senescent cells [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/214794

[ES] La presente tesis doctoral, titulada "Microportadores inteligentes para la liberación controlada de sustancias de interés nutracéutico", se centra en el diseño y evaluación de sistemas híbridos orgánico-inorgánicos para proteger y liberar controladamente compuestos bioactivos. Dichos sistemas están basados en (i) materiales de sílice, principalmente partículas mesoporosas, como soporte inorgánico para almacenar y proteger la carga bioactiva; y (ii) una capa externa de biomoléculas como puerta molecular, que regula la liberación de la carga ante ciertos estímulos. En el primer capítulo de la tesis se describe el ácido oleico como puerta molecular. Este capítulo se subdivide en tres artículos diferentes, con distintos objetivos. En el primer artículo se emplea por primera vez el ácido oleico como puerta molecular de un soporte mesoporoso, cargado con la molécula modelo rodamina B. El material preparado es capaz de proteger la carga en las condiciones presentes en la boca y en el estómago, e inducir su liberación en el intestino con la acción surfactante de las sales biliares. El sistema se ha empleado para la liberación de vitamina B2, demostrando así la utilidad del diseño para la protección y liberación controlada de nutracéuticos. El segundo artículo evalúa la efectividad de esta puerta molecular en diferentes tipos de partículas mesoporosas de sílice, con diversos tamaños y estructuras de poro (MCM-41, MCM-48, SBA-15 y UVM-7). En todos los sistemas estudiados, la puerta molecular es capaz de mantener protegidas las moléculas cargadas, y liberarlas ante la presencia de sales biliares. El sólido basado en la estructura de UVM-7 se validó in vivo, observándose un retraso en la absorción intestinal de la rodamina gracias a su encapsulación. Por último, el tercer artículo incluido en este capítulo ha estudiado la posibilidad de incorporar puertas moleculares en filosilicatos. Se ha conseguido la protección y liberación controlada de biomoléculas de gran tamaño implicadas en el metabolismo humano (vitamina B12 y hematina) empleando filosilicatos funcionalizados con ácido oleico como puerta molecular. El segundo capítulo describe por primera vez el uso de la proteína zeína (prolamina de maíz) como puerta molecular. La presencia de la prolamina de maíz inhibe la salida de los compuestos antimicrobianos encapsulados (timol, carvacrol y cinamaldehído) liberándolos en presencia de las enzimas proteolíticas excretadas durante el crecimiento bacteriano. De todos los materiales desarrollados, el sistema cargado con cinamaldehído ha demostrado una inhibición del crecimiento de E. coli superior a la del compuesto libre. Finalmente, el tercer capítulo estudia la efectividad de la lactosa como puerta molecular para proteger aceites esenciales y liberarlos solo en las condiciones presentes en el intestino. Se han preparado tres materiales diferentes basados en MCM-41, cargados con timol, eugenol y cinamaldehído, y funcionalizados con lactosa para inhibir la salida de los compuestos. La acción enzimática de la lactasa secretada en el intestino es capaz de hidrolizar la puerta molecular en los correspondientes monosacáridos, liberando la carga a lo largo del lumen intestinal. Los microdispositivos diseñados han sido validados in vitro con células Caco-2, donde se ha observado el aumento de la capacidad citotóxica del cinamaldehído y la disminución de la permeabilidad a través del modelo de membrana intestinal gracias a su encapsulación. Finalmente, el microdispositivo cargado con cinamaldehído se ha validado in vivo ratificándose la disminución de la permeabilidad del compuesto y su mayor permanencia en el lumen intestinal. Así, la presente tesis doctoral ha demostrado la posibilidad de emplear biomoléculas sencillas de grado alimentario como puertas moleculares sobre diversos materiales de sílice. Estos nuevos sistemas han permitido proteger y liberar control / [CA] La present tesi doctoral, titulada "Microportadors intel·ligents per a l'alliberament controlat de substàncies d'interès nutracèutic", se centra en el disseny i avaluació de sistemes híbrids orgànic-inorgànics per a la protecció i alliberament controlat de compostos bioactius. Aquests sistemes estan basats en (i) materials de sílice, principalment partícules mesoporoses, com a suport inorgànic per emmagatzemar i protegir la càrrega bioactiva; i (ii) una capa externa de biomolècules com a porta molecular, que regula l'alliberament d'aquesta càrrega davant de determinats estímuls. En el primer capítol de la tesi es descriu l'àcid oleic com a porta molecular. Aquest capítol se subdivideix en tres articles diferents, amb objectius diferents. En el primer article s'empra per primera vegada l'àcid oleic com a porta molecular d'un suport mesoporós, carregat amb la molècula model rodamina B. El material preparat és capaç de protegir la càrrega en les condicions presents a la boca i a l'estómac, i induir el seu alliberament a l'intestí amb l'acció surfactant de les sals biliars. El sistema s'ha emprat per a l'alliberament de vitamina B2, demostrant així la utilitat del disseny per a la protecció i alliberament controlat de nutracèutics. El segon article avalua l'efectivitat d'aquesta porta molecular en diferents tipus de partícules mesoporoses de sílice, amb diverses mides i estructures de porus (MCM-41, MCM-48, SBA-15 i UVM-7). En tots els sistemes estudiats, la porta molecular és capaç de mantindre protegides les molècules carregades, i alliberar-les davant la presència de sals biliars. El sòlid basat en l'estructura de UVM-7 es validà in vivo, observant-se un retard en l'absorció intestinal de la rodamina gràcies a la seua encapsulació. Finalment, en el tercer article inclòs en aquest capítol s'ha estudiat la possibilitat d'incorporar portes moleculars en fil·losilicats. S'ha aconseguit la protecció i alliberament controlat de biomolècules de grans dimensions implicades en el metabolisme humà (vitamina B12 i hematina) emprant fil·losilicats funcionalitzats amb àcid oleic com a porta molecular. El segon capítol descriu per primera vegada l'ús de la proteïna zeïna (prolamina de dacsa) com a porta molecular. La presència de la prolamina de dacsa inhibeix la sortida dels compostos antimicrobians encapsulats (timol, carvacrol i cinamaldèhid) alliberant-los en presència dels enzims proteolítics excretades durant el creixement bacterià. De tots els materials desenvolupats, el sistema carregat amb cinamaldèhid ha demostrat una inhibició de l'creixement d'E. coli superior a la del compost lliure. Finalment, el tercer capítol estudia l'efectivitat de la lactosa com a porta molecular per protegir olis essencials i alliberar-los només en les condicions presents a l'intestí. S'han preparat tres materials diferents basats en MCM-41, carregats amb timol, eugenol i cinamaldèhid, i funcionalitzats amb lactosa per inhibir l'eixida dels compostos. L'acció enzimàtica de la lactasa secretada a l'intestí és capaç d'hidrolitzar la porta molecular en els corresponents monosacàrids, alliberant la càrrega al llarg del lumen intestinal. Els microdispositius dissenyats s'han validat in vitro amb cèl·lules Caco-2, on s'observà l'augment de la capacitat citotòxica del cinamaldèhid i la disminució de la permeabilitat a través del model de membrana intestinal gràcies a la seua encapsulació. Finalment, el microdispositiu carregat amb cinamaldèhid s'ha validat in vivo ratificant la disminució de la permeabilitat del compost i la seua major permanència al lumen intestinal. Així, la present tesi doctoral ha demostrat la possibilitat d'emprar biomolècules senzilles de grau alimentari com portes moleculars sobre diversos materials de sílice. Aquests nous sistemes han permès protegir i alliberar controladament diferents nutracèutics, millorant així la seua biodisponibilitat. / [EN] This PhD thesis, entitled "Smart microdevices for nutraceutical-delivery", is focused on the design and evaluation of organic-inorganic hybrid systems for the protection and controlled release of bioactive molecules. These systems are based on (i) silica materials, mainly mesoporous particles, as inorganic support to store and protect the bioactive cargo; and (ii) an outer layer of biomolecules that regulate the payload release triggered by certain stimuli. In the first chapter of the thesis oleic acid is described as a molecular gate. This chapter is subdivided into three different articles, with different objectives. In the first article, oleic acid is used for the first time as molecular gate of a mesoporous support, loaded with the rhodamine B model molecule. The designed material is capable of protecting the cargo under the conditions present in the mouth and stomach, and inducing its release in the small intestine with the surfactant action of bile salts. The system has been used for the release of vitamin B2, thus demonstrating the validity of the design for the protection and controlled release of nutraceuticals. The second article evaluates the effectiveness of this molecular gate in different types of mesoporous silica particles, with different sizes and pore structures (MCM-41, MCM-48, SBA-15 and UVM-7). In all the systems studied, the molecular gate is capable of keeping cargo molecules protected and releasing them in the presence of bile salts. The solid based on the structure of UVM-7 was validated in vivo, observing a delay in the intestinal absorption of rhodamine thanks to its encapsulation. Lastly, the third article included in this chapter has studied the possibility of incorporating molecular gates onto phyllosilicates. The protection and controlled release of large biomolecules involved in human metabolism (vitamin B12 and hematin) have been achieved using phyllosilicates functionalized with oleic acid as molecular gate. The second chapter describes for the first time the use of the protein zein (corn prolamine) as a molecular gate. The presence of corn prolamine inhibits the release of encapsulated antimicrobial compounds (thymol, carvacrol and cinnamaldehyde) releasing them in the presence of the proteolytic enzymes excreted during bacterial growth. Among all the materials developed, the cinnamaldehyde-loaded system has shown greater inhibition of E. coli growth than the free compound. Finally, the third chapter studies the effectiveness of lactose as a molecular gate to protect essential oils and release them only under the conditions present in the intestine. Three different materials based on MCM-41 loaded with thymol, eugenol, and cinnamaldehyde, and functionalized with lactose to inhibit the release of the compounds have been prepared. The enzymatic action of the lactase secreted in the intestine is capable of hydrolyzing the molecular gate into the corresponding monosaccharides, thus releasing the cargo along the intestinal lumen. The designed microdevices have been validated in vitro with Caco-2 cells, where an increase in the cytotoxic capacity of cinnamaldehyde and a decrease in permeability through the intestinal membrane model have been observed thanks to its encapsulation. Finally, the cinnamaldehyde-loaded microdevice has been validated in vivo, confirming the decrease in the permeability of the compound and its greater permanence in the intestinal lumen. Thus, the present PhD thesis has demonstrated the possibility of using simple food-grade biomolecules as gatekeepers on various silica materials. These new systems have allowed the protection and controlled release of different nutraceuticals, thus improving their bioavailability. / The authors also thank the Electron Microscopy Service at the UPV for support. The authors also thank Prof. Pedro Amorós for his explanations and guidance on the knowledge of phyllosilicates. / Poyatos Racionero, E. (2020). Smart microdevices for nutraceutical-controlled delivery [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/159247