Spelling suggestions: "subject:"galactosidase"" "subject:"galactosidases""
1 |
Evaluación de la actividad de la enzima lisosomal beta-galactosidasa en muestras de fibroblastos lisados dispuestos sobre papel filtroBetta Morales, Katerina Angélica January 2014 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en
Bioquímica área de Especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular / En los Errores Innatos del Metabolismo (EIM), los cultivos de fibroblastos (FB) a partir de
biopsia de piel, han sido desarrollados con el objetivo de obtener material para la determinación
enzimas deficientes en este tipo de patologías y establecer un diagnóstico definitivo. Este tipo de
diagnóstico es realizado en laboratorios especializados, debido a la complejidad en el manejo y
mantención de los cultivos de FB. El envío de muestras de FB a estos centros debe ser realizado en
condiciones que garanticen la viabilidad de las células durante el trayecto, con el objetivo de
evitar un retraso en el diagnóstico, lo que podría ocasionar daño neurológico irreversible o la
muerte de estos pacientes. Entre los EIM, el grupo de Enfermedades de Depósito Lisosomal (EDL)
han sido ampliamente diagnosticadas mediante análisis enzimático sobre muestras de FB. La
detección de enzimas lisosomales deficientes en muestras de FB permite confirmar el diagnóstico
en este tipo de patologías. El uso de gotas de sangre seca (GSS) en papel filtro ha permitido el
desarrollo de Programas de Pesquisa Neonatal para diversos EIM, ya que se ha demostrado
ampliamente la estabilidad de metabolitos y enzimas en GSS en papel filtro. Además, la toma de
muestra, el transporte y almacenamiento de muestras en este tipo de soporte se ven facilitados.
El objetivo de este estudio fue evaluar la estabilidad de la actividad específica de betagalactosidasa,
enzima lisosomal deficiente en la Gangliosidosis GM1, un tipo de EDL, en muestras
de lisados de FB obtenidos a partir de la línea celular 3T3-L1 y dispuestos en papel filtro. Las
muestras fueron sometidas a distintas condiciones de tiempo y temperatura de almacenaje para
la evaluación de la actividad enzimática.
Las muestras mantenidas a 4°C mostraron estabilidad de la actividad enzimática de betagalactosidasa
hasta al menos los 28 días de almacenaje. Las muestras re-almacenadas a 4°C y -
70°C presentaron una mayor estabilidad de la actividad de beta-galactosidasa, en comparación
con otras temperaturas de re-almacenaje estudiadas / In Inborn Errors of Metabolism (IEM), fibroblasts (FB) cultures from skin biopsy have been
developed in order to obtain material for the determination of deficient enzymes in this type of
pathologies and to establish a definitive diagnosis. This type of diagnosis is performed in
specialized laboratories, due to the complexity of sample handling and FB culture maintenance.
Shipment of FB samples to these centers must be carried out under conditions that guarantee the
viability of the cells during the journey, in order to avoid a delay in diagnosis, which may cause
irreversible neurological damage or death of these patients. Among the IEM, the Lysosomal
Storage Diseases (LSD) group, has been widely diagnosed by enzymatic analysis of FB samples. The
detection of deficient lysosomal enzymes in FB samples allows us to confirm the diagnosis in this
type of pathology. The use of dried blood spots (DBS) on filter paper has allowed the development
of Neonatal Screening Programs for various IEM, because the stability of metabolites and enzymes
in DBS on filter paper has been widely demonstrated. Furthermore, sample collection, transport
and storage of samples in this type of support are facilitated.
The aim of this study was to evaluate the stability of the beta-galactosidase, a lysosomal enzyme
that is deficient in GM1 gangliosidosis, a type of EDL, in fibroblasts lysates obtained from the 3T3-
L1 cell line and collected on filter paper. Samples were studied under different conditions of time
and temperature of storage for the enzymatic activity assessment.
Samples kept at 4°C maintained the stability of enzyme activity for at least 28 days of storage.
Samples stored at 4°C and -70°C showed increased stability when are re-stored in these
temperatures.
|
2 |
Anàlisi genètica i molecular de les malalties Gangliosidosi GM1 i Morquio BSantamaría Merino, Raúl 07 June 2007 (has links)
En aquesta tesi s'ha realitzat una aproximació genètica i molecular a les malalties Gangliosidosi GM1 i Morquio B. Aquestes dues malalties són causades per mutacions en un únic gen, el gen GLB1. Aquest gen codifica per la proteïna beta-galactosidasa lisosòmica, de manera que mutacions al gen GLB1 alteren la funcionalitat d'aquesta proteïna. Això pot conduir a l'acumulació dels diferents substrats que normalment són degradats per la beta-galactosidasa: el gangliòsid GM1, el queratà sulfat i diferents oligasacàrids proteics. En aquesta tesi es presenten els resultats de la cerca de mutacions en 49 pacients amb Gangliosidosi GM1 i 5 amb Morquio B. Els pacients estudiats provenien bàsicament d'Espanya i d'Argentina. Es van poder identificar 52 mutacions diferents de les que 32 no havien estat descrites prèviament. A més a més, per a la majoria de mutacions identificades es va poder establir una correlació entre la mutació trobada i un fenotip determinat de la malaltia. La mutació R59H va ser la mutació més prevalent a les poblacions analitzades, essent especialment prevalent als pacients d'ètnia gitana, on aquesta va ser l'única mutació descrita. A més a més, en aquests pacients la mutació R59H sempre es va trobar associada a un mateix haplotip, cosa que indicaria un origen únic del canvi R59H dins de la població gitana.Posteriorment, algunes de les mutacions identificades van ser expressades in vitro utilitzant com a sistema d'expressió les cèl.lules COS-7 transfectades amb Lipofectamina. D'aquesta manera es van expressar 15 variants mutades de la beta-galactosidasa. Les variants causants de la forma infantil (la forma més severa) van mostrar una activitat enzimàtica residual nul.la, mentre que 3 variants associades a formes més lleus (el tipus adult i la malaltia de Morquio B) van resultar en activitats residuals amb un rang del 7-15%. Per altra banda, 3 canvis que eren polimòrfics (no patogènics) van ser els que van presentar una activitat enzimàtica residual més elevada, al voltant del 30-60%. Així doncs, es va poder concloure que el sistema d'expressió emprat era un bon sistema per establir correlacions entre les activitats residuals de les variants mutades i el fenotip associat a cadascuna d'elles.Finalment, es van dur a terme una sèrie d'experiments per entendre el mecanisme que regula el procés d'splicing alternatiu del gen GLB1. Aquest gen codifica dues proteïnes diferents (la beta-galactosidasa i l'EBP) gràcies a un mecanisme d'splicing alternatiu. Al transcrit de l'EBP, els exons 3, 4 i 6 són exclosos del transcrit madur. Diferents experiments van mostrar que el mecanisme d'NMD ("Nonsense-mediated decay") s'encarrega d'eliminar les combinacions d'exons errònies, fent que únicament els dos transcrits funcionals romanguin estables a la cèl.lula. Paral.lelament, mitjançant la cotransfecció de plasmidis que codificaven diferents proteïnes SR junt amb un minigèn construït amb els exons implicats en l'splicing alternatiu del gen GLB1, es va poder comprovar que les proteïnes SR tenien la capacitat de modificar la proporció en que es generaven les diferents combinacions d'exons en els transcrits obtinguts a partir del minigèn. Això indicaria que les proteïnes SR, que juguen un paper essencial en el procés d'splicing cel.lular, podrien tenir també una funció en la regulació de l'splicing alternatiu del gen GLB1.
|
3 |
Smart microdevices for nutraceutical-controlled deliveryPoyatos Racionero, Elisa 17 January 2021 (has links)
[ES] La presente tesis doctoral, titulada "Microportadores inteligentes para la liberación controlada de sustancias de interés nutracéutico", se centra en el diseño y evaluación de sistemas híbridos orgánico-inorgánicos para proteger y liberar controladamente compuestos bioactivos. Dichos sistemas están basados en (i) materiales de sílice, principalmente partículas mesoporosas, como soporte inorgánico para almacenar y proteger la carga bioactiva; y (ii) una capa externa de biomoléculas como puerta molecular, que regula la liberación de la carga ante ciertos estímulos.
En el primer capítulo de la tesis se describe el ácido oleico como puerta molecular. Este capítulo se subdivide en tres artículos diferentes, con distintos objetivos. En el primer artículo se emplea por primera vez el ácido oleico como puerta molecular de un soporte mesoporoso, cargado con la molécula modelo rodamina B. El material preparado es capaz de proteger la carga en las condiciones presentes en la boca y en el estómago, e inducir su liberación en el intestino con la acción surfactante de las sales biliares. El sistema se ha empleado para la liberación de vitamina B2, demostrando así la utilidad del diseño para la protección y liberación controlada de nutracéuticos. El segundo artículo evalúa la efectividad de esta puerta molecular en diferentes tipos de partículas mesoporosas de sílice, con diversos tamaños y estructuras de poro (MCM-41, MCM-48, SBA-15 y UVM-7). En todos los sistemas estudiados, la puerta molecular es capaz de mantener protegidas las moléculas cargadas, y liberarlas ante la presencia de sales biliares. El sólido basado en la estructura de UVM-7 se validó in vivo, observándose un retraso en la absorción intestinal de la rodamina gracias a su encapsulación. Por último, el tercer artículo incluido en este capítulo ha estudiado la posibilidad de incorporar puertas moleculares en filosilicatos. Se ha conseguido la protección y liberación controlada de biomoléculas de gran tamaño implicadas en el metabolismo humano (vitamina B12 y hematina) empleando filosilicatos funcionalizados con ácido oleico como puerta molecular.
El segundo capítulo describe por primera vez el uso de la proteína zeína (prolamina de maíz) como puerta molecular. La presencia de la prolamina de maíz inhibe la salida de los compuestos antimicrobianos encapsulados (timol, carvacrol y cinamaldehído) liberándolos en presencia de las enzimas proteolíticas excretadas durante el crecimiento bacteriano. De todos los materiales desarrollados, el sistema cargado con cinamaldehído ha demostrado una inhibición del crecimiento de E. coli superior a la del compuesto libre.
Finalmente, el tercer capítulo estudia la efectividad de la lactosa como puerta molecular para proteger aceites esenciales y liberarlos solo en las condiciones presentes en el intestino. Se han preparado tres materiales diferentes basados en MCM-41, cargados con timol, eugenol y cinamaldehído, y funcionalizados con lactosa para inhibir la salida de los compuestos. La acción enzimática de la lactasa secretada en el intestino es capaz de hidrolizar la puerta molecular en los correspondientes monosacáridos, liberando la carga a lo largo del lumen intestinal. Los microdispositivos diseñados han sido validados in vitro con células Caco-2, donde se ha observado el aumento de la capacidad citotóxica del cinamaldehído y la disminución de la permeabilidad a través del modelo de membrana intestinal gracias a su encapsulación. Finalmente, el microdispositivo cargado con cinamaldehído se ha validado in vivo ratificándose la disminución de la permeabilidad del compuesto y su mayor permanencia en el lumen intestinal.
Así, la presente tesis doctoral ha demostrado la posibilidad de emplear biomoléculas sencillas de grado alimentario como puertas moleculares sobre diversos materiales de sílice. Estos nuevos sistemas han permitido proteger y liberar control / [CA] La present tesi doctoral, titulada "Microportadors intel·ligents per a l'alliberament controlat de substàncies d'interès nutracèutic", se centra en el disseny i avaluació de sistemes híbrids orgànic-inorgànics per a la protecció i alliberament controlat de compostos bioactius. Aquests sistemes estan basats en (i) materials de sílice, principalment partícules mesoporoses, com a suport inorgànic per emmagatzemar i protegir la càrrega bioactiva; i (ii) una capa externa de biomolècules com a porta molecular, que regula l'alliberament d'aquesta càrrega davant de determinats estímuls.
En el primer capítol de la tesi es descriu l'àcid oleic com a porta molecular. Aquest capítol se subdivideix en tres articles diferents, amb objectius diferents. En el primer article s'empra per primera vegada l'àcid oleic com a porta molecular d'un suport mesoporós, carregat amb la molècula model rodamina B. El material preparat és capaç de protegir la càrrega en les condicions presents a la boca i a l'estómac, i induir el seu alliberament a l'intestí amb l'acció surfactant de les sals biliars. El sistema s'ha emprat per a l'alliberament de vitamina B2, demostrant així la utilitat del disseny per a la protecció i alliberament controlat de nutracèutics. El segon article avalua l'efectivitat d'aquesta porta molecular en diferents tipus de partícules mesoporoses de sílice, amb diverses mides i estructures de porus (MCM-41, MCM-48, SBA-15 i UVM-7). En tots els sistemes estudiats, la porta molecular és capaç de mantindre protegides les molècules carregades, i alliberar-les davant la presència de sals biliars. El sòlid basat en l'estructura de UVM-7 es validà in vivo, observant-se un retard en l'absorció intestinal de la rodamina gràcies a la seua encapsulació. Finalment, en el tercer article inclòs en aquest capítol s'ha estudiat la possibilitat d'incorporar portes moleculars en fil·losilicats. S'ha aconseguit la protecció i alliberament controlat de biomolècules de grans dimensions implicades en el metabolisme humà (vitamina B12 i hematina) emprant fil·losilicats funcionalitzats amb àcid oleic com a porta molecular.
El segon capítol descriu per primera vegada l'ús de la proteïna zeïna (prolamina de dacsa) com a porta molecular. La presència de la prolamina de dacsa inhibeix la sortida dels compostos antimicrobians encapsulats (timol, carvacrol i cinamaldèhid) alliberant-los en presència dels enzims proteolítics excretades durant el creixement bacterià. De tots els materials desenvolupats, el sistema carregat amb cinamaldèhid ha demostrat una inhibició de l'creixement d'E. coli superior a la del compost lliure.
Finalment, el tercer capítol estudia l'efectivitat de la lactosa com a porta molecular per protegir olis essencials i alliberar-los només en les condicions presents a l'intestí. S'han preparat tres materials diferents basats en MCM-41, carregats amb timol, eugenol i cinamaldèhid, i funcionalitzats amb lactosa per inhibir l'eixida dels compostos. L'acció enzimàtica de la lactasa secretada a l'intestí és capaç d'hidrolitzar la porta molecular en els corresponents monosacàrids, alliberant la càrrega al llarg del lumen intestinal. Els microdispositius dissenyats s'han validat in vitro amb cèl·lules Caco-2, on s'observà l'augment de la capacitat citotòxica del cinamaldèhid i la disminució de la permeabilitat a través del model de membrana intestinal gràcies a la seua encapsulació. Finalment, el microdispositiu carregat amb cinamaldèhid s'ha validat in vivo ratificant la disminució de la permeabilitat del compost i la seua major permanència al lumen intestinal.
Així, la present tesi doctoral ha demostrat la possibilitat d'emprar biomolècules senzilles de grau alimentari com portes moleculars sobre diversos materials de sílice. Aquests nous sistemes han permès protegir i alliberar controladament diferents nutracèutics, millorant així la seua biodisponibilitat. / [EN] This PhD thesis, entitled "Smart microdevices for nutraceutical-delivery", is focused on the design and evaluation of organic-inorganic hybrid systems for the protection and controlled release of bioactive molecules. These systems are based on (i) silica materials, mainly mesoporous particles, as inorganic support to store and protect the bioactive cargo; and (ii) an outer layer of biomolecules that regulate the payload release triggered by certain stimuli.
In the first chapter of the thesis oleic acid is described as a molecular gate. This chapter is subdivided into three different articles, with different objectives. In the first article, oleic acid is used for the first time as molecular gate of a mesoporous support, loaded with the rhodamine B model molecule. The designed material is capable of protecting the cargo under the conditions present in the mouth and stomach, and inducing its release in the small intestine with the surfactant action of bile salts. The system has been used for the release of vitamin B2, thus demonstrating the validity of the design for the protection and controlled release of nutraceuticals. The second article evaluates the effectiveness of this molecular gate in different types of mesoporous silica particles, with different sizes and pore structures (MCM-41, MCM-48, SBA-15 and UVM-7). In all the systems studied, the molecular gate is capable of keeping cargo molecules protected and releasing them in the presence of bile salts. The solid based on the structure of UVM-7 was validated in vivo, observing a delay in the intestinal absorption of rhodamine thanks to its encapsulation. Lastly, the third article included in this chapter has studied the possibility of incorporating molecular gates onto phyllosilicates. The protection and controlled release of large biomolecules involved in human metabolism (vitamin B12 and hematin) have been achieved using phyllosilicates functionalized with oleic acid as molecular gate.
The second chapter describes for the first time the use of the protein zein (corn prolamine) as a molecular gate. The presence of corn prolamine inhibits the release of encapsulated antimicrobial compounds (thymol, carvacrol and cinnamaldehyde) releasing them in the presence of the proteolytic enzymes excreted during bacterial growth. Among all the materials developed, the cinnamaldehyde-loaded system has shown greater inhibition of E. coli growth than the free compound.
Finally, the third chapter studies the effectiveness of lactose as a molecular gate to protect essential oils and release them only under the conditions present in the intestine. Three different materials based on MCM-41 loaded with thymol, eugenol, and cinnamaldehyde, and functionalized with lactose to inhibit the release of the compounds have been prepared. The enzymatic action of the lactase secreted in the intestine is capable of hydrolyzing the molecular gate into the corresponding monosaccharides, thus releasing the cargo along the intestinal lumen. The designed microdevices have been validated in vitro with Caco-2 cells, where an increase in the cytotoxic capacity of cinnamaldehyde and a decrease in permeability through the intestinal membrane model have been observed thanks to its encapsulation. Finally, the cinnamaldehyde-loaded microdevice has been validated in vivo, confirming the decrease in the permeability of the compound and its greater permanence in the intestinal lumen.
Thus, the present PhD thesis has demonstrated the possibility of using simple food-grade biomolecules as gatekeepers on various silica materials. These new systems have allowed the protection and controlled release of different nutraceuticals, thus improving their bioavailability. / The authors also thank the Electron Microscopy Service at the UPV for support. The authors also thank Prof. Pedro Amorós for his explanations and
guidance on the knowledge of phyllosilicates. / Poyatos Racionero, E. (2020). Smart microdevices for nutraceutical-controlled delivery [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/159247 / TESIS
|
Page generated in 0.1028 seconds