Tesis por compendio de publicaciones / El hámster sirio (Mesocricetus auratus) es un roedor de reproducción estacional en días largos que sufre una fuerte atrofia testicular cuando es sometido a un fotoperiodo corto. La presente tesis doctoral tiene como objetivos, en primer lugar, estudiar las variaciones histomorfométricas que tienen lugar en el testículo durante la regresión testicular debida a fotoperiodo corto así como determinar la importancia que tienen los fenómenos de proliferación y apoptosis en el proceso de atrofia del epitelio seminífero durante este periodo; en segundo lugar, dilucidar si la histoquímica de lectinas “in situ” permite identificar células germinales y/o somáticas en apoptosis durante esta regresión; finalmente, determinar si existe muerte celular de células de Sertoli durante esta regresión y si se produce por apoptosis. Para ello, se utilizaron 50 hámsteres sirios macho jóvenes sometidos a un fotoperiodo de 14:10h luz-oscuridad. Cinco machos se utilizaron como grupo de control mantenidos con el fotoperiodo de 14:10 h de luz-oscuridad. Los otros animales fueron sometidos a un fotoperiodo corto de 8:16h de luz-oscuridad. A las 4, 6, 8, 10 y 12 semanas se sacrificaron nueve animales tratados más un control, se extrajeron sus testículos y se procesaron para su estudio tanto con microscopía de luz (H&E, histoquímica de lectinas y TUNEL e inmunohistoquímica de PCNA y vimentina) como con microscopía electrónica de transmisión (MET). Mediante microscopía de luz se realizaron diversos estudios semicuantitativos. Con ellos y los del tiempo de sacrificio se establecieron tres grupos de regresión: regresión media (MR), regresión fuerte (SR) y regresión total (TR). Se calcularon también los índices de proliferación y apoptosis de las diferentes células germinales y somáticas del epitelio seminífero. Además, se realizaron estudios cuantitativos utilizando un software de análisis de imagen. Mediante la MET se estudiaron los cambios en las células germinales y de Sertoli durante la apoptosis. Durante la regresión testicular debida a fotoperiodo corto se produjo, a nivel celular en el epitelio seminífero, un descenso inicial de la proliferación en espermatogonias y un aumento de la apoptosis de células germinales. Al final de la regresión, se recuperó la actividad proliferativa de espermatogonias aunque la actividad apoptótica continuó afectando principalmente a los espermatocitos. Histomorfométricamente se produjo tanto un descenso del diámetro y volumen tubular como, un acortamiento del túbulo seminífero con un descenso del volumen intersticial. Varias lectinas mostraron afinidad por residuos de glucoconjugados de células germinales en apoptosis: Gal β1,3-GalNAcα1, α-D-manosa, N-acetilgalactosamina y L-fucosa. Además, la lectina PNA mostró afinidad por células de Sertoli que se encontraban en apoptosis. La H&E y las secciones semifinas identificaron células de Sertoli con una morfología alterada siendo algunas TUNEL+ en los grupos MR y SR. Mediante MET se identificaron cambios característicos de la apoptosis en estas células. Por otra parte, durante la regresión testicular, se observaron, con microscopía de luz, espermátidas elongadas fagocitadas por células de Sertoli mayoritariamente en los grupos MR y SR. En conclusión: a) la regresión testicular en el hámster sirio conlleva, tanto un descenso del diámetro y volumen del túbulo seminífero como el acortamiento del túbulo seminífero y un descenso del volumen intersticial. Además, hay un descenso inicial en la proliferación y un incremento en la apoptosis de las células germinales. Al final de la regresión, las actividades proliferativa y apoptótica de las espermatogónias recuperan los valores anteriores a la regresión; b) el uso de la histoquímica de lectinas podría ser una herramienta muy útil para estudiar la apoptosis en el epitelio seminífero debido a la especificidad mostrada; c) hay evidencias morfológicas de la pérdida de células de Sertoli por apoptosis. También algunas espermátidas elongadas son fagocitadas y eliminadas por estas células de Sertoli. / The Syrian hamster (Mesocricetus auratus) is a long-day seasonal breeding rodent which suffers strong testicular atrophy when subjected to a short photoperiod. The present thesis has as objectives: (i) to study the histomorphometrical changes that take place in the Syrian hamster testes during testicular regression due to a short photoperiod and to determine the importance of the phenomena of proliferation and apoptosis in the process of seminiferous epithelium atrophy during this period; (ii) to determine whether “in situ" lectin histochemistry allows the identification of germ and/or somatic cells in apoptosis during this regression; and iii) to determine whether Sertoli cell death occurs during regression and whether it is produced by apoptosis. For this purpose, 50 young Syrian hamsters subjected to a 14:10 h L:D photoperiod were used. Five males were maintained with this 14:10 h L:D photoperiod and used as Control. The other forty five animals were subjected to a short photoperiod of 8:16 h L:D. At 4, 6, 8, 10 and 12 week, nine treated animals plus one control were sacrificed, and their testes were extracted and processed for study both by light microscopy (H&E, lectin and TUNEL histochemistry techniques and PCNA and vimentin immunohistochemistry) and transmission electron microscopy (TEM). Using light microscopy, several semiquantitative studies were carried out. Based on these data and the week when the animals were sacrificed, three regression groups were established: mild regression (MR), strong regression (SR) and total regression (TR). The proliferation and apoptosis indexes of the different germinal and somatic cells of the seminiferous epithelium were calculated. Furthermore, quantitative studies were made using image analysis software. Using TEM the changes suffered by the different germ and Sertoli cells during apoptosis were studied. During testicular regression due to short photoperiod, an initial decrease in spermatogonia proliferation and an increase in germ cell apoptosis were observed at cellular level in the seminiferous epithelium. At the end of regression, the spermatogonial proliferative activity was recovered although the apoptotic activity continued, mainly affecting spermatocytes. Histomorphometrically, a decrease in tubular diameter and volume, shortening of the seminiferous tubules and a decrease in the interstitial volume were observed. Several lectins showed affinity for glycoconjugate residues (Gal β1,3-GalNAcα1, α-D-mannose, N-acetylgalactosamine and L-fucose) of germ cells in apoptosis. Furthermore, the PNA lectin showed affinity for Sertoli cells undergoing apoptosis. H&E and semi-thin sections identified Sertoli cells with a degenerated morphology that were TUNEL+ in the MR and SR groups. Apoptotic changes in the nucleus and cytoplasm of these cells were identified by TEM. Moreover, during testicular regression and using light microscopy, some elongated spermatids were seen to have been phagocytosed by Sertoli cells, mainly in the MR and SR groups. In conclusion: a) testicular regression in Syrian hamster involves both a decrease in seminiferous tubular diameter and volume, and shortening of the seminiferous tubule accompanied by a decrease in interstitial volume. Furthermore, there is an initial decrease in proliferation and an increase in apoptosis involving all germ cells. At the end of regression, the proliferative and apoptotic activities of the spermatogonia recover the values observed prior to regression; b) lectin histochemistry can be considered a very useful tool for studying apoptosis in the seminiferous epithelium because of the specificity it shows; c) there is morphological evidence that some Sertoli cells are lost through apoptosis. Also, some elongated spermatids are phagocytized and eliminated by Sertoli cells.

En el período cercano a la ovulación o periovulatorio el tracto genital femenino ofrece el microentorno necesario para el transporte e interacción de los gametos, hasta culminar con una fecundación exitosa. En la especie bovina, el espermatozoide debe permanecer en el tracto femenino para obtener su capacidad fecundante; las moléculas y mecanismos que participan en dotar de esta capacidad a los espermatozoides, no están del todo esclarecidos. Por ello, es de suma importancia conocer estos mecanismos a fondo para desarrollar nuevas técnicas de reproducción asistida que mejoren la capacidad fecundante del gameto masculino. Nuestros objetivos fueron identificar los diferentes mecanismos moleculares presentes en el tracto genital femenino implicados en el proceso de maduración del espermatozoide, tras su depósito, transporte y permanencia en el periodo previo a la ovulación, así como analizar las similitudes y diferencias en la expresión del transcriptoma y proteoma del útero y oviducto bovino. Para identificar la expresión del transcriptoma y la expresión génica diferencial, utilizamos el análisis de micromatrices. Las muestras de epitelio oviductal, de tejido endometrial y de los fluidos oviductales (FOBs) y uterinos (FUBs) procedieron de seis novillas sincronizadas hormonalmente en la fase periovulatoria. Para la identificación de proteínas contenidas en FOB y FUB utilizamos las técnicas de electroforesis bidimensional, DiGE y espectrometría de masas (MS/MS). Nuestros resultados del análisis de micromatrices, indicaron que un total de 5509 genes son expresados diferencialmente en el oviducto y útero bovino en la fase periovulatoria. Así, también observamos que la expresión génica entre el oviducto y endometrio no es idéntica, si bien tienen una amplia similitud donde comparten expresión de genes que intervienen en sintetizar proteínas relacionadas con la unión, respuesta al estímulo, en los mecanismos de defensa y de protección ante el estrés oxidativo. También se comprobó la existencia de vías específicas para cada uno de los tejidos estudiados. Así, en el oviducto destacan la expresión de genes relacionados con actividad catalítica, del choque térmico y en endometrio destacan la presencia de transcritos relacionados con la adhesión focal y la modificación de la matriz extracelular. Se ha detectado la expresión de hasta 175 genes que intervienen en los procesos de secreción. Identificamos 47 proteínas por MS/MS, procedentes de geles bidimensionales-DiGE, de las cuales 29 son comunes para FOB y FUB. Estas proteínas intervienen en proceso biológicos generales como la comunicación celular, la respuesta al estrés y procesos catabólicos. Observamos que 9 de ellas fueron exclusivas del FOB destacando algunas proteínas de la familia de las anexinas implicadas en los mecanismos de unión, así como en el establecimiento del reservorio oviductal. Otras 5 proteínas fueron identificadas como únicas de FUB involucradas en actividades catalíticas y de glicolisis. / During the period upcoming to ovulation or peri-ovulatory phase, the female genital tract provides the microenvironment required for transport and interaction of gametes, culminating in a successful fertilization. In the bovine species, the sperm must remain in the female tract to obtain fertilizing capacity, the molecules and mechanisms involved in providing this capability to sperm, is not entirely clarified. It is therefore important to investigate these mechanisms thoroughly to develop new assisted reproductive techniques that improve the fertilizing capacity of the male gamete. Our aims were to identify the different molecular mechanisms present in the female genital tract involved in the maturation of sperm, after insemination, transport and permanence in the peri-ovulatory phase and analyze the similarities and differences in the expression of the transcriptome and proteome of bovine uterus and oviduct. To identify transcriptome expression and differential gene expression, we used microarray analysis. The sample of oviductal epithelium, endometrial tissue and oviductal fluids (FOBs) and uterine (FUBs) proceeded from six heifers hormonally synchronized in the peri-ovulatory phase. For the identification of protein contained in FUB and FOB bimensional electrophoresis techniques, DIGE and mass spectrometry (MS / MS) were used. Our results of the microarray analysis indicated that a total of 5509 genes were differentially expressed in the bovine oviduct and uterus in the peri-ovulatory phase. Thus, we also observed that gene expression in the oviduct and endometrium is not identical, have similarity, they share expression of genes involved in synthesizing proteins referring to binding, response to stimuli, mechanisms of defense and protection against oxidative stress. We also confirmed the existence of specific pathways for each of the tissues analyzed. In the oviduct, the expressed gene are related to catalytic activity and heat shock; however, in the endometrium there are gene expression associated with focal adhesion, and modification of the extracellular matrix. Up to 175 genes that are expressed are involved in the secretion pathways. We identified 47 proteins by MS / MS from two-dimensional gels and DiGE. A number of 29 proteins are common between FOB and FUB and are involved in general biological processes as cellular communication, stress response and catabolic processes. We identified 9 proteins that are specific for the FOB. It is important to emphasize the proteins of the annexin family. These proteins are involved in the binding mechanism and in the establishment of the sperm reservoir. Other five proteins were specific for the FUB and are involved in catalytic activities and glycolysis.

Objetivos. Primero: determinación de la susceptibilidad de macrófagos derivados de monocitos activados por citocinas a ser infectados por diferentes cepas del genotipo 1 y 2 de PRRSV. Segundo: evaluación de la modulación de la respuesta inmune por la cepa 2982 de PRRSV-1 en pulmón, tonsila y nódulos linfáticos de credos infectados. Tercero: caracterización de la respuesta inmune inducida por diferentes cepas de PRRSV-1 que varían en virulencia en distintos compartimentos de nódulo linfático mediastínico (Med-LN) de cerdos infectados. Metodología. En el experimento in vitro se seleccionaron monocitos de PBMC de cerdos SPF y se incubaron durante 72 h para permitir la diferenciación en macrófagos. Entonces esas células se estimularon con citocinas durante 24 h: IFN-γ (M1), IL-4 (M2), IFN-β o no estimulados. Después mediante citometría de flujo se evaluó el fenotipo de los diferentes macrófagos (CD16, MHC I, MHC II, CD86, CD16 and CD14). La infección de macrófagos por PRRSV se cuantificó por medición de la nucleocápside mediante citometría de flujo. En el sobrenadante se midió por ELISA IFN-α, TNF-α, and IL-10. Para el primer estudio in vivo 28 cerdos SPF se infectaron intramuscularmente con la cepa 2982 de PRRSV-1 y se eutanasiaron humanitariamente a 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 dpi. Se dejaron 4 animales como grupo control negativo, que se eutanasiaron a los 24 dpi. Los niveles de transcripción de citocinas proinflamatorias (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 y TNF-α) e inmunododuladoras (IL-10 y TGF-β) se midieron mediante RT-qPCR. Para el segundo experimento in vivo 76 lechones SPF fueron aleatoriamente agrupados en 3 grupos de 20 animales para la infección, y los restantes 16 se dejaron como control. Se utilizaron tres cepas de PRRSV-1 con distinta virulencia: LV como prototipo, 215-06 del subtipo 3, y la SU1-bel del subtipo 3. Los animales se eutanasiaron humanitariamente a los 3, 7 y 35 dpi. El folículo y área inter-folicular de Med-LN se tomaron separadamente mediante captura por microdisección láser. Los niveles de transcripción de citocinas (IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-23p19, IL-10 and TGF-β) y de SOCS1 se evaluaron por RT-qPCR. Las poblaciones celulares de Med-LN se evaluaron por inmunohistoquímica. Resultados. Los macrófagos estimulados por citocinas desarrollan diferente fenotipo comparado con macrófagos no polarizados. Los cultivos celulares de macrófagos polarizados por citocinas pueden muestran diferencias importantes entre cepas de PRRSV. Mientras que los macrófagos no polarizados y M2 son sensibles a todas las cepas de PRRSV, el tratamiento de macrófagos con IFNs induce un claro estado antivírico en dichas células con una menor infección y replicación de PRRSV. Sólo los M1 infectados con LVP23 produjeron cierta cantidad de IFN-α. Este tipo de macrófagos representan un flexible modelo in vitro alternativo al empleo de líneas celulares derivadas de mono o a macrófagos alveolares porcinos. El primer estudio in vivo mostró que la cepa 2982 del PRRSV-1 es capaz de evadir el establecimiento de respuesta inmune innata efectiva, permitiendo una expresión génica de IFN- α 1 y TNF-α disminuida, y una respuesta inmune adquirida débil y retardada, por una expresión ineficiente de IL-12 e IFN-γ. El segundo experimento in vivo demostró que PRRSV permanece alojado en Med-LN al menos hasta 35 dpi, y la cepa SU1-bel es la que posee una mayor capacidad de replicación. Las cepas de PRRSV-1 evitaron el establecimiento correcto de la respuesta inmune en cerdos infectados mediante la depleción de células linfáticas y disminución de la expresión de IFN- α y TNF-α en los compartimentos de Med-LN. Finalmente, los resultados sugieren que la inducción de IL-10 por PRRSV con el propósito de retrasar la respuesta inmune del hospedador no es una estrategia común a todos los aislados de PRRSV- / 1. Objectives. First: determination of the cytokine primed monocyte-derived macrophages susceptibility to be infected by different PRRSV-1 and 2 strains. Second: evaluation of the swine immune response modulation by PRRSV-1 2982 strain in lung, tonsil, tracheobronchial and retropharyngeal lymph nodes of infected pigs. Third: characterization of the immune response induced by several PRRSV-1 strains varying in virulence in distinct compartments of mediastinal lymph node (Med-LN) (follicle and inter-follicular areas) of infected pigs. Methodology. For the in vitro experiment, monocytes were isolated from PBMC of SPF pigs and incubated during 72 h to lead the macrophage differentiation. Then, these cells were stimulated during 24 h with cytokines: IFN-γ (M1), IL-4 (M2), IFN-β or no stimulated. After that the phenotype of the different macrophages were evaluated by flow cytometry (CD16, MHC I, MHC II, CD86, CD16 and CD14). Several PRRSV-1 and PRRSV-2 strains were used to infect macrophages. PRRSV infection of macrophages was evaluated by nucleocapsid protein acquisition by flow cytometry. In the supernatant IFN-α, TNF-α, and IL-10 were determined by ELISA. For the first in vivo experiment 28 SPF pigs were infected intramuscularly with PRRSV-1 2982 isolate and were humanely euthanized at 3, 7, 10, 14, 17, 21 and 24 dpi. Four pigs were kept as non-infected control group, being humanely euthanized at 24 dpi. The proinflammatory (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 and TNF-α) and immunomodulatory (IL-10 and TGF-β) cytokines transcript levels were evaluated by means of RT-qPCR. For the second in vivo experiment, 76 SPF piglets were ramdonly allocated in groups of 20 animals for the viral infection and the 16 remaining animals as control group. Three PRRSV-1 isolates varying in virulence were selected in this study: LV as prototype, 215-06 from subtype 1, and SU1-bel from subtype 3. Animals were humanely euthanized at 3, 7 and 35 dpi. Med-LN follicle and inter-follicular areas were separately selected by Laser Microdissection Capture. Cytokines (IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-23p19, IL-10 and TGF-β) and SOCS1 transcript levels were evaluated by means of RT-qPCR. The lymph node cell populations were evaluated by immunohistochemistry. Results. The in vitro experiment showed that stimulated macrophages developed different phenotype compared with non polarized macrophages. Cytokine-primed macrophages cultures can reveal important PRRSV strain differences. Whereas undifferentiated macrophages and M2 are sensitive to all PRRSV strains, IFN-γ and IFN-β treatment of macrophages induced a clear antiviral state in macrophages with reductions in virus infection and replication. Only IFN-α production was detected in the supernatant of M1 infected with LVP23 PRRSV-1 strain. These macrophages represent a flexible in vitro model alternative against monkey cell lines and porcine alveolar macrophages. The first in vivo experiment showed that PRRSV-1 strain 2982 is able to evade the onset of an effective innate immune response, leading to an impaired expression of IFN-α 1 and TNF-α gene expression, and a weak and delayed acquired immune response through an inefficient IL-12 and IFN-γ expression. This experiment showed that PRRSV remains allocated in follicle of lymph node during at least 35 dpi, and SU1-bel showed the higher ability of replication. PRRSV-1 stains showed to avoid the correct innate immune response in infected pigs through lymphatic cell depletion, IFN-α and TNF-α down-regulation in Med-LN compartments. Finally, the IL-10 induction by PRRSV was not a common strategy among the PRRSV-1 to delay of the host immune response.

Tesis por compendio de publicaciones / La inseminación artificial (IA) es una biotecnología ampliamente utilizada en la industria porcina, jugando un papel fundamental en la mejora de la productividad. Idealmente, los programas de IA en porcino, deberían utilizar espermatozoides congelados-descongelados dadas las ventajas adicionales que poseen en comparación con el semen refrigerado, en particular las relacionadas a la bioseguridad y comercio internacional. Sin embargo, los espermatozoides congelados-descongelados se utilizan con poca frecuencia en los programas de IA porcina comerciales debido a su menor eficiencia con respecto al semen refrigerado, ya que se requieren más espermatozoides por dosis de IA alcanzando por lo general peores resultados de fertilidad. La razón biológica de este hecho está relacionada con la gran sensibilidad de los espermatozoides porcinos a la criopreservación. Además, los espermatozoides que sobreviven a dicho proceso, poseen una vida funcional más corta. El principal objetivo de esta Tesis es el de optimizar el protocolo de criopreservación de espermatozoides de porcino con el fin de mejorar la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación. Para ello, se han desarrollado los siguientes estudios. En el primer estudio, se evaluó el impacto de los espermatozoides no funcionales presentes en los eyaculados de porcino sobre la capacidad de los espermatozoides funcionales para soportar el proceso de criopreservación. Para ello, se congelaron 15 fracciones ricas (FR) de 5 machos fértiles con diferentes proporciones de espermatozoides no funcionales (0- muestra de semen nativa, 25, 50 y 75 %). Tras la descongelación, se evaluaron los espermatozoides mótiles y viables que se recuperaron, así como la funcionalidad espermática en términos de fluidez de membrana de plasmática y producción intracelular de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) en condiciones de capacitación in vitro. Además, se evaluó la peroxidación lipídica de la membrana plasmática mediante la medición indirecta de la producción de malondialdehído (MDA). Tanto la motilidad (evaluada mediante sistema CASA) como la viabilidad espermática normalizadas (evaluada mediante citometría de flujo y triple tinción de los espermatozoides con Hoechst 33342, H-42; yoduro de propidio, PI, y aglutinina de cacahuete conjugado con fluoresceína, PNA-FITC) fueron menores (p<0’01) cuanta mayor proporción de espermatozoides no funcionales había en las muestras seminales antes de la congelación, independientemente del verraco. Sin embargo, la magnitud del efecto fue diferente (p<0’01) entre los verracos. Las muestras de semen con la mayor subpoblación de espermatozoides no funcionales antes de la congelación mostraron los mayores (p<0’01) niveles de MDA tras la descongelación. En cuanto a la funcionalidad de los espermatozoides supervivientes a la descongelación, la muestra con 75 % de espermatozoides no funcionales antes de la congelación tuvo una generación intracelular de ROS (evaluada con 5-(y-6) clorometil-20,70-dichlorodihydrofluorescein éster acetil diacetato; CM-H2DCFDA) más alta (p<0’01) y un aumento (p<0’01) de la fluidez de la membrana espermática (Merocianina 540, M540) con respecto a la muestra control. El objetivo del segundo estudio fue determinar si los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen antes y durante la congelación influyen en la capacidad de fertilización in vitro (FIV) de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Usando el mismo diseño experimental que en el estudio anterior, se prepararon y criopreservaron 4 muestras de semen procedentes de 15 FR con las mismas proporciones de espermatozoides no funcionales. Tras la descongelación, las muestras seminales fueron centrifugadas con PorciPureTM. La concentración (evaluada usando un Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) y viabilidad espermática (evaluada del mismo modo que en el estudio anterior) de cada pellet de espermatozoides fueron evaluadas para calcular la cantidad de espermatozoides viables totales en cada muestra de semen tras la centrifugación. La funcionalidad de los espermatozoides, en términos de generación intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear (Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), se evaluó antes y después de la centrifugación con el gradiente de PorciPureTM en condiciones de capacitación in vitro. La capacidad de FIV espermatozoides supervivientes al proceso de criopreservación se evaluó se evaluó de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma) y del desarrollo embrionario. Un total de 1.041 ovocitos madurados in vitro fueron inseminados utilizando un número fijo de espermatozoides viables purificados con PorciPureTM (ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1), independientemente de los diferentes porcentajes de espermatozoides no funcionales de las muestras. El desarrollo embrionario se evaluó a los 2 y 7 días después de la inseminación mediante la tasa de división (porcentaje de ovocitos divididos a 2-4 células/total cigotos putativos cultivados) y la formación de blastocistos (porcentaje de blastocistos/total cigotos putativos cultivados), respectivamente. El número total de células de los blastocistos resultantes se evaluó por tinción de los blastocistos con H-42. Los resultados revelaron que una alta proporción de espermatozoides no funcionales en muestras de semen antes y durante la congelación inducen un aumento (p <0’001) de la generación de intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear en espermatozoides congelados-descongelados. Estos cambios funcionales resultaron en bajas proporciones (p <0’01) de ovocitos penetrados y embriones desarrollados in vitro. En el tercer estudio, se evaluó la eficacia de la selección de espermatozoides usando un gradiente de centrifugación de una sola capa (Single Layer Centrifugation; SLC) antes de la congelación sobre la supervivencia espermática. Para ello, 24 FR recogidas de 24 verracos, se dividieron en 2 grupos en función de sus características seminales iniciales (concentración, morfología, motilidad y viabilidad espermática): estándar (n = 15) y sub-estándar (n = 9). Las muestras seminales de cada FR se dividieron en 2 alícuotas, una permaneció sin tratar (muestras control) y la otra se centrifugó con el gradiente de una sola capa (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 mL de Androcoll-P-Large® (muestras SLC). El rendimiento de espermatozoides totales, motiles (evaluados mediante CASA) y viables (evaluados mediante citometría como se mencionó anteriormente) después de SLC fue mayor (p<0’05) en las muestras estándar que en las sub-estándar. Las muestras de semen fueron criopreservadas. Tras la descongelación, la motilidad y viabilidad espermáticas fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control, independientemente de las características iniciales eyaculado. Además, los espermatozoides descongelados de las muestras SLC fueron más resistentes (p<0’05) a la peroxidación lipídica (Bioxytech MDA - 586 Kit de ensayo) que los de las muestras de control. El tratamiento con SLC también influyó en la funcionalidad de los espermatozoides descongelados bajo condiciones de capacitación in vitro. El porcentaje de espermatozoides viables que mostraron alta fluidez de membrana fue menor (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control. Los espermatozoides descongelados de las muestras SLC generaron menor (p<0’05) cantidad de ROS que los de las muestras control en los eyaculados sub-estándar. El objetivo del cuarto estudio experimental fue el de evaluar la idoneidad y eficacia de SLC, empleando el coloide Androcoll-P-XL®, como un procedimiento de rutina para la selección de los espermatozoides funcionales de los eyaculados de porcino para la criopreservación. Trece FR (una por verraco) se dividieron en tres alícuotas. Dos alícuotas de 15 y 150 mL se centrifugaron (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 y 150 mL (v/v) de Androcoll-P-Large® y Androcoll-P-XL®, respectivamente. La tercera alícuota se mantuvo sin procesa (control). Tras la centrifugación, los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales y con motilidad rápida y progresiva (CASA) fueron mayores (p<0’01) tras en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll -P® utilizado. Sin embargo, el porcentaje de espermatozoides con ADN nuclear fragmentado fue menor (p<0’01) en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll-P® utilizado. Las tasas de recuperación de espermatozoides totales, mótiles, viables y morfológicamente normales oscilaron entre el 20 y 100 %, mientras que los porcentajes de espermatozoides con ADN nuclear intacto oscilaron entre el 60 y 100 %, con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la SLC, las muestras espermáticas fueron criopreservadas. Tras la descongelación, los porcentajes de espermatozoides mótiles, viables y con ADN nuclear intacto, fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en el control con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la descongelación, se inseminaron 679 ovocitos madurados in vitro con un ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1. La SLC también mejoró (p<0’01) la capacidad de FIV de los espermatozoides congelados-descongelados, evaluada de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma). Sin embargo, no hubo ningún efecto de SLC sobre capacidad in vitro de los cigotos putativos para desarrollar a blastocistos. Tras todo lo anteriormente expuesto, podemos concluir que: Los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen de porcino antes de la congelación influyen negativamente en la congelabilidad de los espermatozoides funcionales. Lo cual se evidencia por una reducción en la proporción de espermatozoides funcionales recuperados tras la descongelación y por una menor capacidad fecundante y habilidad para desarrollar embriones in vitro por los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. La selección espermática mediante el gradiente de centrifugación de una sola capa Androcoll-P® utilizado antes de la congelación, mejora la congelabilidad espermática y la capacidad fecundante de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. / Artificial insemination (AI) is extensively used by swine producers worldwide, playing a pivotal role in the improvement of herd productivity. Ideally, swine AI-programs should use frozen-thawed (FT) sperm, given its additional advantages compared to liquid-stored semen, particularly those concerning international trade and biosecurity. However, FT-sperm are infrequently used in commercial swine AI programs because of their lower efficiency with respect to liquid-stored semen; more FT-spermatozoa are required per AI dose to achieve typically lower fertility outcomes. The biological reason for the large number of spermatozoa required per AI dose is related to the high cryosensitivity of boar spermatozoa. In addition, the spermatozoa that survive the cryopreservation process exhibit an impaired and shortened functional lifespan. Therefore, this thesis was designed to optimize the boar sperm cryopreservation protocol in order to improve the sperm survival after thawing. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the impact of non-functional spermatozoa on the cryopreservation success of functional spermatozoa was assessed. Fifteen sperm-rich ejaculate fractions (SREF) collected from 5 fertile boars were frozen (following a standard 0.5-mL straw freezing protocol) with different proportions of induced non-functional sperm (0-native semen sample-, 25, 50 and 75% non-functional spermatozoa). After thawing, the recovery of motile and viable spermatozoa was assessed, and the functional of the spermatozoa was evaluated from plasma membrane fluidity and intracellular reactive oxygen species (ROS) generation upon exposure to capacitation conditions. In addition, the lipid peroxidation of the plasma membrane was assessed by the indirect measurement of malondialdehyde (MDA) generation. The normalized (with respect to a native semen sample) sperm motility (assessed by CASA) and viability (cytometrically assessed after staining with Hoechst 33342, H-42; propidium iodide, PI; and fluorescein-conjugated peanut agglutinin, PNA-FITC) decreased (p<0.01) as the proportion of functional spermatozoa in the semen samples before freezing decreased, irrespective of the semen donor. However, the magnitude of the effect differed (p<0.01) among boars. Moreover, semen samples with the largest non-functional sperm subpopulation before freezing showed the highest (p<0.01) levels of MDA after thawing. The thawed viable spermatozoa of semen samples with a high proportion of non-functional spermatozoa before freezing were also functionally different from those of samples with a low proportion of non-functional spermatozoa. These differences consisted of higher (p<0.01) levels of intracellular ROS generation (assessed with 5-(and-6) chloromethyl-20,70-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester; CM-H2DCFDA) and increased (p<0.01) membrane fluidity (assessed with Merocyanine 540, M540). The objective of the second study was to evaluate the impact of non-functional spermatozoa on the in vitro fertilization (IVF) ability of FT-spermatozoa. Using the same experimental approach as the previous study, 4 sperm semen samples from 15 SREF with the same different proportions of induced non-functional sperm were also prepared and cryopreserved following the protocol indicated above. After thawing, the semen samples were centrifuged with PorciPureTM Bottom Layer. The sperm concentration (measured using a Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) and viability (as indicated in the previous study) of each sperm pellet were assessed to calculate the total viable sperm count in each semen sample. The functionality of the spermatozoa, in terms of intracellular ROS generation and nuclear DNA fragmentation (sperm chromatin dispersion test; Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), was assessed before and after the PorciPureTM centrifugation gradient in sperm samples incubated under capacitating conditions. The IVF ability of cryosurviving spermatozoa was assessed according to oocyte fertilisation (2 pronuclei and a sperm tail inside of the ooplasm) and embryo development. A total of 1,041 in vitro-matured oocytes were inseminated using a fixed number of PorciPureTM-purified viable spermatozoa (viable sperm: oocyte ratio of 300:1), regardless of the differing percentages among the 4 semen samples (native, 25 %, 50 %, and 75 % non-functional spermatozoa). Embryo development was evaluated at 2 and 7 days after insemination by the assessment of the cleavage rate (percentage of oocytes divided to 2–4 cells/total putative zygotes cultivated) and blastocyst formation (percentage of blastocyst/total putative zygotes cultivated), respectively. The total cell number of the resulting blastocysts was evaluated by staining the blastocysts with H-42. The results revealed that high proportions of dead spermatozoa in raw semen samples before and during freezing induce (p<0.001) increased ROS generation and nuclear DNA fragmentation in frozen-thawed spermatozoa. These dysfunctional changes resulted in low ratios (p<0.01) of in vitro penetrated oocytes and healthy developing embryos. The effectiveness of sperm selection using single-layer centrifugation (SLC) prior to freezing on the sperm cryosurvival of boar ejaculates was evaluated in the third study. Twenty-four SREF, collected from 24 boars, were divided into 2 groups according to their initial semen traits: standard (n=15) and substandard (n=9). Semen samples from each SREF were split in 2 aliquots, one remained untreated (control samples) and the other was single-layer centrifuged (500 g for 20 min) using 15 mL of Androcoll-P-Large® (SLC-samples). The yield of total, motile (assessed by CASA) and viable (cytometrically evaluated as mentioned above) sperm after SLC was higher (p<0.05) in standard than substandard semen samples. The semen samples were cryopreserved using a standard 0.5-mL straw freezing protocol. Post-thaw sperm motility and viability were higher (p<0.05) in SLC than in control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Additionally, thawed spermatozoa from SLC samples were more resistant (p<0.05) to lipid peroxidation (BIOXYTECH MDA-586 Assay Kit) than those from control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. The SLC-treatment also influenced the functionality of thawed spermatozoa undergoing an in vitro capacitation process. The percentage of viable sperm showing high membrane fluidity (assessed with M540) was lower (p<0.05) in the SLC than in the control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Thawed viable spermatozoa of SLC samples generated less (p<0.05) reactive oxygen species (assessed with CM-H2DCFDA) than those of control samples in the substandard ejaculates. The objective of the fourth experimental study was to evaluate the suitability and effectiveness of SLC as a routine procedure for selecting boar spermatozoa for cryopreservation. Thirteen sperm rich ejaculate fractions (one per boar) were split into three aliquots. Two aliquots of 15 and 150 mL were SLC-processed (500 g for 20 min) using 15 and 150 mL (v/v) of Androcoll-P-Large® and Androcoll-P-XL®, respectively. The third aliquot remained un-processed as a control. The percentages of spermatozoa that were morphologically normal and showed rapid and progressive motility (assessed by CASA) spermatozoa were higher (p<0.01) and those with fragmented nuclear DNA were lower (p<0.01) after SLC than control semen samples, regardless of the Androcoll-P® used. The recovery rates of total, motile, viable (flow cytometric evaluated after staining with H-42, PI and FITC-PNA) and morphologically normal spermatozoa ranged between 20 and 100% and those with intact nuclear DNA ranged between 60 and 100%, irrespective of the Androcoll-P® used. Thereafter, the semen samples were cryopreserved as mentioned above. Post-thaw percentages of sperm motility, viability and intact nuclear DNA were higher (p<0.05) in SLC-processed than in control semen samples, irrespective of the Androcoll-P® used. SLC-processing also improved (p<0’01) the IVF ability of FT-sperm (679 in vitro matured oocytes inseminated with a viable sperm:oocyte ratio of 300:1 following the same procedure mentioned above), measured as the percentage of penetrated oocytes and the mean number of swollen sperm heads and/or male pronuclei in penetrated oocytes. However, there was no effect of SLC-processing on the in vitro ability of putative zygotes to develop to blastocysts. The results achieved in these four experimental studies have generated the following conclusions: Non-functional spermatozoa present in boar semen samples before freezing negatively influence the cryopreservation of functional spermatozoa by reducing the proportion of recovered surviving spermatozoa after thawing and also by altering the functional and fertilisation ability of the sperm that survive the cryopreservation process. Single Layer Centrifugation prior to freezing improves the boar sperm cryopreservation and post-thaw fertilisation ability of cryosurvival spermatozoa. However, further studies aimed at optimising the yield of SLC procedure are needed.

Tesis por compendio de publicaciones / Los avances tecnológicos en la reproducción porcina han ocurrido, en parte, debido a la creciente comprensión de las ventajas de la utilización de verracos con características superiores en programas genéticos. Tecnologías reproductivas como la criopreservación y la separación espermática mediante citometría de flujo, como método para predeterminar el sexo de la progenie, proporcionan una valiosa herramienta para la mejora genética. Sin embargo, estos procedimientos normalmente tienen un impacto perjudicial sobre la calidad espermática, en cierta medida, atribuida a la dilución que se produce durante el procesamiento, y la consiguiente disminución en la concentración del plasma seminal (PS). Por ello, esta Tesis Doctoral propone una serie de experimentos orientados a mejorar el conocimiento sobre la influencia del PS de porcino en la criopreservación espermática, evaluando la influencia de la incubación antes de la congelación de las muestras espermáticas en su propio PS, proveniente bien del eyaculado completo o bien de alguna de sus fracciones/porciones, sobre la calidad y la funcionalidad espermática tras la descongelación y capacidad de separación de espermatozoides X e Y por citometría de flujo, evaluando la relevancia del PS en la variabilidad observada en la eficiencia del proceso de separación y su posterior repercusión en la calidad y funcionalidad de los espermatozoides separados conservados a 15-17 °C. En su conjunto estos estudios demuestran que la incubación de los espermatozoides de porcino en su propio PS influye sobre la capacidad de dichos espermatozoides para soportar la criopreservación y también la separación espermática en poblaciones X e Y mediante citometría flujo. El PS de la fracción post FRE tendría un efecto negativo sobre la congelabilidad espermática, mientras que la incubación de los espermatozoides en presencia de una alta proporción de PS perjudicaría la eficiencia del proceso de separación. / Technological advances in pig reproduction have occurred in part because of the growing understanding of the benefits of using boars with superior characteristics in genetic programs. Reproductive technologies such as sperm cryopreservation and sperm sex-sorting by flow cytometry as a method to predetermine the sex of offspring provide a valuable tool for the genetic improvement. However, these methods usually have a detrimental impact on sperm quality, to some extent, attributed to the dilution that occurs during processing, and the resulting decrease in the concentration of seminal plasma (PS). Thus, the present Doctoral Thesis proposes a series of experiments aimed to improve the knowledge of the putative effects of porcine SP on sperm cryopreservation by evaluating the influence of holding time of ejaculate sperm before freezing surrounded in their own SP, from either entire ejaculate or some ejaculate specific fractions/portions, on post-thawing sperm quality and functionality and on sperm sex-sorting procedure; by evaluating the relevance of ejaculate SP on inter- and intra-boar variability in sperm sortability and on capability of sex-sorted sperm to tolerate liquid storage at 15-17 °C, assessed according to sperm quality and functionality. Taken together these experiments show that holding boar sperm in their own SP negatively influences their ability to withstand cryopreservation, particularly the SP from post-SRF, and flow-based sex-sorting procedure.

Los objetivos de este estudio fueron: (1) establecer los perfiles concentración plasmática–tiempo y derivar los parámetros farmacocinéticos para marbofloxacino en cabras lactantes tras la administración de fomulaciones IV, SC, SC-P407 y SC-P407-CMC de marbofloxacino; (2) determinar la velocidad y cantidad de penetración de marbofloxacino, así como su eliminación, en la leche de cabra tras la administración de fomulaciones IV, SC, SC-P407 y SC-P407-CMC de marbofloxacino; (3) comparar los parámetros farmacocinéticos obtenidos entre la formulación convencional SC y las formulaciones con P407 (con y sin CMC como aditivo); (4) evaluar el grado de actividad in vitro de marbofloxacino frente a cepas de S.aureus aisladas de leche de cabra mamítica en España, y (5) calcular los marcadores surrogados de eficacia contra cepas de S.aureus aisladas de leche de cabra mamítica en España. Estos parámetros podrían proporcionar información y un entendimiento adicional sobre la farmacología de las fluoroquinolonas en pequeños rumiantes lactantes. METODOLOGÍA: Se utilizaron seis cabras hembras clínicamente sanas de la raza Murciano-Granadina, con pesos entre 49.6 - 68.4 kg en un rango de 2,5 – 3,5 años de edad. Los animales pertenecen a la granja caprina de la universidad de Murcia. A cada animal se le administró una dosis única IV o SC de marbofloxacino a la dosis de 2 mg/kg o de SC-P407 y SC-P407-CMC a la dosis de 6 mg/kg con al menos 15 días de periodo de descanso. Muestras de sangre fueron recogidas antes de inyectar el fármaco (tiempo 0 o pre-tratamiento), y a 0,083, 0,167, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 y 96 horas tras la administración. Muestras de leche fueron ordeñadas inmediatamente antes y después de la administración del fármaco a 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 y 96 horas. Este estudio fue aprobado por el comité bioético de la universidad de Murcia. Las concentraciones en plasma y leche de marbofloxacino fueron medidas mediante HPLC con detección fluorescente, y los perfiles de concentración (plasma o leche) obtenidos frente al tiempo para cada animal, en cada tratamiento, fueron analizados mediante métodos farmacocinéticos. La absorción in vivo de marbofloxacino fue evaluada mediante técnicas de deconvolución numérica. Doce cepas de Staphylococcus aureus, todas aisladas de leche de cabra con mamitis en granjas comerciales españolas fueron evaluadas. Los valores de MIC y MPC fueron obtenidos según los procedimientos recomendados por el CLSI y el método descrito por Blondeau y colaboradores, 2001. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: La semivida plasmática en la fase terminal para marbofloxacino tras la administración IV, SC, SC-P407 y SC-P407-CMC fue de 5.61, 6.89, 15.27 y 16.25 horas, respectivamente. La biodisponibilidad absoluta de marbofloxacino tras la administración de las formulaciones SC, SC-P407 y SC-P407-CMC fue de un 108.98  11.00%, 101.36  15.87% y 78.64  14.47%, respectivamente. La exposición sistémica alcanzada en cabras tras la administración de marbofloxacino en las formulaciones SC-P407 y SC-P407-CMC a la dosis de 6 mg/kg proprociona cinco puntos a considerar. Primero, la tasa de liberación del fármaco alcanzada podría ser adecuada para mantener concentraciones plasmáticas efectivas durante el intervalo de dosificación, en el caso de las formulaciones SC-P407 y SC-P407-CMC, niveles plasmáticos elevados se alcanzaron hasta las 48 horas post-administración. Segundo, estas formulaciones poseen buenos parámetros farmacocinéticos: elevadas semividas plasmáticas en la fase terminal (3 veces superiores a las formulaciones convencionales), buena biodisponibilidad, constantes de absorción bajas y elevados tiempos medios de absorción (que pueden reflejar una cinética del tipo flip-flop). Tercero, el antibacteriano utilizado en este studio posee un buen índice de penetración en leche, con perfiles plasmáticos paralelos a los obtenidos en leche. Cuarto, los resultados obtenidos con las formulaciones testadas con y sin carboxi-metilcelulosa, como aditivo, son consistentes con los marcadores surrogados predichos para obtener una ventana terapéutica efectiva contra cepas de S.aureus con valores de MIC ≤ 0.13 μg/mL. Quinto, la dosificación para alcanzar concentraciones equivalentes a la MPC podría ser efectiva para reducir la selección de subpoblaciones de bacterias mutantes de S.aureus con susceptibilidad reducida a las fluoroquinolonas. Sin embargo, son necesarios estudios adicionales para evaluar, optimizar, y conocer, las dosis y ratios óptimos necesarios para alcanzar marcadores surrogados en cabras lactantes para valores más altos de MIC o MPC y para otros agentes infecciosos. / The objectives of the present study were: (1) to establish the plasma concentration–time profile and to derive pharmacokinetics data for marbofloxacin in lactating goats after IV, SC, SC-P407 and SC-P407-CMC formulations; (2) to determine the rate and extent of marbofloxacin penetration into and elimination from milk after IV, SC, SC-P407 and SC-P407-CMC administrations; (3) to compare the pharmacokinetic parameters between conventional SC and P407 formulations (with or without CMC as an additive); (4) to evaluate the degree of in vitro activity marbofloxacin against S.aureus strains isolated from the milk of goats with clinical mastitis in Spain, and (5) to calculate the surrogate markers of efficacy against S. aureus strains isolated from mastitic goat´s milk in Spain. These parameters will provide additional understanding of fluoroquinolone pharmacokinetics in lactating small ruminants. METHODOLOGY: Six clinically healthy Murciano-Granadina female goats weighing between 49.6 - 68.4 kg and aged from 2.5 - 3.5 years from the Caprine Farm of the University of Murcia were used. Each animal received either a single IV or SC injection of marbofloxacin at a dose of 2 mg/kg or a SC-P407 and SC-P407-CMC administration at a dose of 6 mg/kg with at least a 15-day washout period. Blood samples were collected at 0 (pre-treatment), 0.083, 0.167, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 and 96 h post-dosing. Milk samples were collected immediately before dosing on the day of treatment administration (time 0) and at 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 and 96 h after administration. The study was approved by the Bioethics Committee of the University of Murcia. Plasma and milk concentrations of marbofloxacin were measured by HPLC method with fluorescence detection, and the plasma and milk concentration-time data obtained in each individual animal were analyzed by pharmacokinetics methods. The in vivo marbofloxacin absorption was performed by numeric deconvolution. Twelve strains of Staphylococcus aureus, all isolated from mastitic goat´s milk in Spain, were tested. The MIC and MPC of marbofloxacin was determined using the recommended procedure by CLSI and the method described by Blondeau et al. 2001. RESULTS AND CONCLUSIONS: Plasma terminal half-lives of marbofloxacin after IV, SC, SC-P407 and SC-P407-CMC administration were 5.61, 6.89, 15.27 and 16.25 h respectively. Following SC, SC-P407 and SC-P407-CMC administration of marbofloxacin, the absolute bioavailability was 108.98  11.00%, 101.36  15.87% and 78.64  14.47%, respectively. The systemic exposure achieved in goats following the SC-P407 and SC-P407-CMC administration of marbofloxacin at a 6 mg/kg dose provides five important outcomes. First, the rate of drug release could be adequate to maintain effective plasma concentrations for the duration of the dosage interval, in the case of SC-P407 and SC-P407-CMC formulations, high plasma levels are achieved until 48 hours. Second, these formulations provide good pharmacokinetics parameters: high terminal half-lives (3-fold than the conventional formulation), good bioavailability, slow absortion rate constants and highs mean absortion times (that can reflect flip-flop kinetics). Third, the antibacterial drug used in this study allowed a good penetration in milk, with a concentration-time profile in milk closely paralleled the plasma profile, fourth, results for the formulations tested with or without carboxy-methylcellulose as additive are consistent with the predicted surrogate markers needed for a positive therapeutic outcome for the S.aureus strains tested with MIC ≤ 0.13 μg/mL. Fifth, dosing to achieve MPC concentrations could be effective to reduce the selection of bacterial subpopulations of S.aureus with reduced fluoroquinolone susceptibility. However, further studies are necessary to evaluate, optimize and to know the doses and optimal ratios of the surrogate markers in lactating goats for MIC or MPC values higher and for other infectious agents.

Tesis por compendio de publicaciones / Over the last years, reproductive technologies as artificial insemination (AI) and semen conservation procedures are increasingly demanded in canine species and the optimization of these procedures are the main goal of numerous investigations. On the other hand, the study and development of new technologies applicable to the canine species in the area of reproductive biotechnology is also increasing. In this context, we have considered that the possible application of sex-sorting technology by flow cytometry in combination with other routine reproductive techniques mentioned above, could contribute relevantly to optimize the efficiency of canine breeding. The main objective of this Thesis was to optimize the protocols for chilling and cryopreservation of dog spermatozoa and to design an effective protocol for canine spermatozoa sex-sorting using flow cytometry. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the effects of various rapid cooling rates from room temperature (23 ºC) to 5ºC on sperm quality of chilled and cold-stored (96 h) canine spermatozoa, using a Tris fructose extender with 20% egg yolk was evaluated. For this purpose, sperm rich fraction samples were pooled (experiment 1) or processed individually (experiment 2) and split into different aliquots that were chilled to 5 °C using different cooling rates of 2.25, 0.9, 0.45, and 0.2 (control) °C/min. In the second study, the effects of rapid cooling prior to freezing on frozen-thawed canine sperm quality. For this purpose 2 experiment were carried out. In experiment 1, centrifuged ejaculates from 6 dogs were pooled, split into 4 aliquots and cryopreserved by the Uppsala procedure using different cooling rates (control, 0.2 C/min; rapid, 2.25 C/min) in combination with 2 glycerol addition protocols (fractionated or unfractionated). In experiment 2, centrifuged ejaculates from 4 dogs were processed individually using the same cooling rates described in experiment 1 in combination with an unfractionated glycerol addition protocol. In the third study, 3 the objective was to optimize Hoechst 33342 staining concentrations for the flow cytometric identification and separation of X- and Y-chromosome-bearing canine spermatozoa. Additionally, to determine whether variations between dogs exist that affect the sex-sorting of spermatozoa. Semen samples from six dogs were diluted to 100 × 106 sperm/mL, split into four aliquots, stained with increasing H-42 concentrations (5, 7.5, 10 and 12.5 μL, respectively) and sorted by flow cytometry. The rates of non-viable, percentages of oriented and selected spermatozoa, as well as the average sorting rates (sorted spermatozoa/s), were used to determine the sorting efficiency. The results achieved in these four studies have generated the following conclusions: the use of a rapid cooling rate of 2.25 ºC/min can be an efficient alternative to the use of a slow cooling rate in protocols for chilling canine semen using a TCF 20% egg yolk extender, maintaining optimal values of sperm quality during a long period of cold-storage (96 h). Dog spermatozoa can be cryopreserved using a rapid cooling rate of 2.25ºC/min prior to freezing with the Uppsala method, in combination with a fractionated or unfractionated glycerol addition procedure. Sperm sex-sorting by flow cytometry can be performed successfully in canine samples using between 7.5 and 12.5 μL of H-42. In addition, significant individual differences are evident in the sorting efficiency of canine spermatozoa. / Actualmente, biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial (IA) y procedimientos para la conservación de espermatozoides como la refrigeración y criopreservación son técnicas muy demandadas en la especie canina. Así mismo, la optimización de estos protocolos ha sido y sigue siendo objetivo de la mayoría de investigaciones en el campo de la reproducción canina. Desde un punto de vista práctico, resultaría muy interesante la disminución del tiempo empleado en enfriar las muestras de semen hasta 5 ºC durante los procesos de conservación. Por otra parte, destacar la importancia que supondría en esta especie el desarrollo de nuevas biotecnologías reproductivas. En especial, sería muy interesante poder combinar técnicas utilizadas de forma rutinaria, como la IA y los protocolos de conservación seminal, con otras técnicas reproductivas como la preselección del sexo de la descendencia mediante separación de espermatozoides X e Y por citometría de flujo. Por todo lo mencionado anteriormente, la finalidad principal de esta Tesis fue optimizar los procedimientos de conservación de semen, así como diseñar un protocolo para la separación de espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo en la especie canina. Para lograr este objetivo, los siguientes estudios fueron realizados. En el primer estudio, se evaluó el efecto de diferentes ratios de enfriamiento rápido, desde temperatura ambiente (23 ºC) hasta 5 ºC, sobre la calidad del semen canino refrigerado y conservado durante 96 horas, utilizando un medio de Tris fructosa con un 20% de yema de huevo. Para ello, las fracciones espermáticas procedente de 5 perros fueron agrupadas en un pool (experimento 1) o procesadas individualmente (experimento 2) y divididas en diferentes alícuotas las cuales fueron refrigeradas a 5 ºC utilizando diferentes ratios de enfriamiento de 2,25, 0,9, 0,45 y 0,2 (control) º C/min. En el segundo estudio, se evaluó el efecto de una ratio de enfriamiento rápido antes de la congelación sobre la calidad del semen canino criopreservado utilizando el método Uppsala, en combinación con la adición fraccionada o no de glicerol. Para ello, se llevaron a cabo 2 experimentos. En el experimento 1, las fracciones espermáticas de 6 perros fueron agrupadas en un pool, divididas en cuatro alícuotas y criopreservadas mediante el método Uppsala usando diferentes ratios de enfriamiento (control, 0,2 ºC/min y rápido, 2,25 ºC/min) en combinación con 2 protocolos de adicción del glicerol (fraccionado y no fraccionado). En el experimento 2, las fracciones espermáticas de 4 perros fueron procesadas usando los mismos ratios de enfriamiento que en el experimento 1 en combinación con una adicción no fraccionada de glicerol. En el tercer estudio, el objetivo fue optimizar las concentraciones de Hoechst 33342 (H-42) para la identificación y separación de los espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo y determinar si existen variaciones entre individuos que afecten al proceso de separación espermática en la especie canina. Las fracciones espermáticas de seis perros fueron divididas en cuatro alícuotas y teñidas con concentraciones crecientes de H-42 (5, 7,5, 10 y 12,5 µL, respectivamente). La identificación y separación de espermatozoides X e Y fue realizada mediante citometría de flujo. Se analizaron los porcentajes de espermatozoides no viables, espermatozoides correctamente orientados, espermatozoides seleccionados o separados, así como finalmente la velocidad de separación (espermatozoides separados/s). Tras los resultados de estos estudios, podemos concluir que: Una ratio de enfriamiento rápido de 2,25 ºC/min puede ser utilizada de forma eficiente en protocolos para la refrigeración de semen canino, utilizando un medio tris fructosa con un 20% de yema de huevo, consiguiendo valores óptimos de calidad espermática durante largos periodos de conservación a 5 º C (96 h). Los espermatozoides caninos pueden ser criopreservados mediante el método Uppsala con una adición fraccionada o no de glicerol, utilizando una ratio de enfriamiento rápido de 2,25 ºC/min antes de la congelación. La separación de espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo puede realizarse con éxito en la especie canina utilizando entre 7,5 y 12,5 μL de Hoechst 33342. Además, diferencias entre individuos pueden afectar significativamente a la eficiencia del proceso de separación.

Durante años se ha tratado de simular in vitro el proceso de selección y capacitación espermática que lleva a cabo el tracto genital de la hembra en condiciones fisiológicas, pero los resultados mucho de la selección que ocurre en el oviducto in vivo. El objetivo principal de esta tesis fue: el estudio de las subpoblaciones espermáticas previamente seleccionadas a través de métodos in vitro (por gradientes de Percoll, Capítulo 1; en cultivo de células oviductales, Capítulo 2; y la combinación de ambos sistemas, Capítulo 3), ex vivo (en explantes oviductales, Capítulo 2) e in vivo (en el oviducto de la cerda tras una inseminación artificial, Capítulo 2), y su relación con la funcionalidad y el estado de capacitación, así como su capacidad fecundante. En el Capítulo 1 se analizó la centrifugación mediante gradientes de Percoll como método de selección y capacitación espermática y se evaluó la eficacia en la selección de espermatozoides en función del gradiente utilizado (45/60, 60/75 y 45/90%). En el experimento 1, se analizaron diferentes parámetros espermáticos de las poblaciones obtenidas a través de los 3 grupos experimentales. Los resultados demostraron que al aumentar la diferencia en la densidad del gradiente de Percoll se reduce el número de espermatozoides morfológicamente anormales o con fragmentación del ADN, recuperando principalmente, espermatozoides que han iniciado el proceso de capacitación (95% presentan fosforilación de tirosina en alguna zona). Podemos decir que la separación de espermatozoides mediante gradientes de Percoll se fundamenta en sus diferencias funcionales. En el experimento 2, se emplearon las poblaciones espermáticas en fecundación in vitro para evaluar su capacidad de penetración, y determinar qué gradiente selecciona los espermatozoides más aptos para fecundar y su posible relación con los parámetros estudiados en el experimento 1. Se evaluó el porcentaje de penetración y el número medio de espermatozoides que presentaba cada ovocito. Los resultados mostraron que aquellos espermatozoides obtenidos a partir del gradiente de Percoll más restrictivo (45/90%) dieron lugar a unos mayores niveles de penetración del ovocito. En el Capítulo 2 se estudió el efecto de las células epiteliales del oviducto sobre la capacitación espermática. Se evaluó el estado de capacitación (mediante la distribución de la fosforilación de la tirosina) de los espermatozoides seleccionados mediante células oviductales bajo tres condiciones experimentales: in vitro, ex vivo e in vivo. Los resultados mostraron que existen diferencias entre los espermatozoides unidos o no unidos a las células oviductales, lo que demuestra que este tipo de células seleccionan espermatozoides con bajo grado de fosforilación en tirosina en cualquiera de las condiciones estudiadas. En el Capítulo 3 se estudiaron qué características presentan los espermatozoides para ser seleccionados por las células oviductales y la capacidad de fecundación in vitro de estos espermatozoides doblemente seleccionados [a través de gradientes de Percoll (45/90%) y posteriormente incubados sobre cultivos in vitro de células epiteliales del oviducto]. En el experimento 1 se evaluó la capacidad para fecundar de las dos poblaciones de espermatozoides obtenidas mediante el análisis de diferentes parámetros de fecundación. Los resultados demostraron que los espermatozoides doblemente seleccionados dan mejores resultados de fecundación in vitro, mejorando las tasas de penetración del gameto femenino. En el experimento 2 se analizaron las características funcionales de los espermatozoides. Los resultados indicaron que las células oviductales unen espermatozoides de mayor calidad y realizan su propia selección incluso partiendo de espermatozoides previamente seleccionados. En resumen, los resultados de esta tesis doctoral muestran que las células epiteliales del oviducto son capaces de distinguir aquellos espermatozoides con una capacidad de fecundación superior, lo que en un futuro podría representar un incremento en la eficiencia de los sistemas de reproducción asistida evitando, de este modo, la selección parcialmente subjetiva que existe actualmente en las técnicas convencionales de selección espermática. / For many years, attempts have been made to control sperm selection and capacitation in order to simulate under in vitro conditions, but the results are highly variable and are far from in vivo ones. The aim of this thesis was the study of sperm subpopulations that have been previously selected by different methods: in vitro (Percoll gradients in Chapter 1, oviductal cells culture in Chapter 2 and by combining both in Chapter 3), ex vivo (in oviductal explants, Chapter 2) and in vivo (in the oviduct of the sow after insemination, Chapter 2), and their relationship with functionality, sperm capacitation status and fertilizing capacity. In Chapter 1 centrifugation by Percoll gradients was analysed as a sperm selection and capacitation method, and its efficiency for selecting sperm was evaluated. Three different Percoll gradient combinations (45/60, 60/75 and 45/90%) were used. In experiment 1, several parameters related to sperm function were analysed in the different sperm populations obtained through the three experimental techniques. The results of this experiment showed that as the Percoll gradient increased, the number of morphologically abnormal sperm or sperm with DNA fragmentation is reduced, recovering especially those sperm that have begun the process of sperm capacitation (since 95% of spermatozoa present tyrosine phosphorylation in any of the studied areas). So, we can say that the separation of sperm by Percoll gradients is primarily based on their functional differences. In experiment 2, the different sperm populations were used in an in vitro fertilization system to evaluate the penetration rate and checking which Percoll gradient selects the best sperm for fertilization purposes. The penetration rate and the mean number of spermatozoa found in each oocyte were evaluated. The results showed that spermatozoa obtained from the most restrictive Percoll gradient (45/90%) had higher levels of penetration. In Chapter 2 the capacitation status of sperm selected by the oviductal epithelial cells was evaluated (by measuring levels of tyrosine phosphorylation) under three conditions: in vitro, ex vivo and in vivo. The results showed that the phosphorylation pattern changes when sperm are incubated with the epithelial cells of the oviduct, with differences between sperm bound or unbound to the cells. It was concluded that the epithelial cells of the oviduct are able to select spermatozoa with a low level of tyrosine phosphorylation in any of the studied conditions. In Chapter 3 sperm selected by Percoll gradients (45/90%) were incubated with in vitro cultured oviductal epithelial cells. This incubation resulted in two distinct sperm populations: sperm bound to cells and sperm unbound. The study was divided into two experiments. In experiment 1 the ability of the two populations to fertilize was evaluated using different parameters. The results showed that the doubly selected sperm led to better results in the in vitro fertilization systems, significantly improving penetration rates. In experiment 2 the functional characteristics of sperm from the two populations were analysed. The results indicated that the oviductal epithelial cells bind higher quality sperm according to different functional parameters and perform their own sperm selection. In summary, the results of this thesis show that the oviductal epithelial cells are able to distinguish those sperm with a higher fertilization capacity. In the future this could provide an increase in the efficiency of assisted reproduction systems thereby preventing the partially subjective selection that currently exists in conventional sperm selection techniques.

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo / Los estudios sobre nutrición e incidencia de enfermedades en rumiantes neonatos son escasos, existiendo una serie de enfermedades infecto-contagiosas que afectan a las terneras de reposición. Por este motivo se consideró importante evaluar el efecto de un producto comercial a base de aminoácidos y vitaminas sobre la tasa de crecimiento y el estado sanitario de un grupo de terneras criadas en un sistema pastoril de leche.

El documento digital no refiere asesor / Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Detecta la presencia de Escherichia coli y Salmonella spp. en manos de operarios, antes y durante el proceso de faenamiento de una planta de beneficio bovino para determinar si dicho proceso influye en la contaminación de éstas. Se evalúan las manos de los operarios (n=20) responsables del área de desuello, evisceración, división, lavado, retoque y oreo; mediante la técnica de hisopado en cada una de sus manos, ello se realiza en dos momentos; antes y durante el faenamiento. El hisopo de cada mano fueron transportados en 10ml de agua petonada; luego se inoculan en medios de enriquecimiento para finalmente sembrarlos en medios selectivos como Agar MacConckey y Salmonella-Shigella. Las colonias sopechosas son sometidas a pruebas bioquímicas para su identificación. Determinando que el 35% (7/20) de operarios presentaron E. coli en sus manos antes del faenamiento, mientras para Salmonella spp. todos fueron negativos; sin embargo, durante el faenamiento los casos positivos de E. coli aumentaron a un 50% (10/20) y para Salmonella spp en el 10% (2/20). Además, la mano izquierda resultó ser la más contaminada durante el proceso. A pesar de ello, mediante la prueba de Chi cuadrado de Mc Nemar no revela diferencia significativa (p>0.05) entre la presencia de operarios con manos positivas a estas bacterias en ambos momentos evaluados. / Tesis