O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da utilização da associação do butafosfan e da vitamina B12 (Catosal B12®) na qualidade do sêmen fresco e refrigerado de garanhões. Foram utilizados quatro garanhões divididos aleatoriamente em dois grupos, A e B, cada um com dois garanhões. Um dos grupos serviu como controle e o outro como grupo tratado. Como tratamento utilizaram-se duas aplicações intramusculares de 5 ml /100 kg PV de Catosal por semana. O projeto se dividiu em 4 etapas de 84 dias cada uma. Na primeira etapa o grupo A foi tratado enquanto que o grupo B serviu de controle. Na segunda etapa ambos os grupos deixaram de ser tratados. Na terceira etapa se inverteram os grupos, sendo o B tratado e o A controle. Finalmente na quarta etapa, nenhum dos grupos foi tratado. Imediatamente após a coleta o sêmen foi avaliado e diluído a uma concentração final de 25 x 10 6 de espermatozoides por mililitro. O sêmen fresco e refrigerado a 5ºC foi avaliado quanto a numero total de espermatozoides, motilidade total e progressiva, vigor, morfologia, funcionalidade (HOS test) e integridade de membrana (CFDA/PI staining). Foi realizada ANOVA e as médias pelo teste de Tukey. Não se observaram diferenças significativas entre os grupos tratados e os controles em nenhum dos parâmetros espermáticos avaliados tanto no sêmen fresco quanto no sêmen resfriado. Tampouco foram detectadas interações entre os garanhões para nenhum dos parâmetros observados. O uso prolongado de Catosal intramuscular não teve efeitos negativos e pode ser utilizado com segurança, em garanhões destinados á reprodução. O tratamento intramuscular com Catosal nas doses administradas e recomendadas pelo fabricante, durante 84 dias, não alterou a qualidade do sêmen fresco ou refrigerado por 24 horas dos garanhões jovens e férteis. / The objective of this study was to evaluate the action of butaphosphan, in combination with vitamin B12 (Catosal B12®) on the quality of fresh and cooled stallion semen. Four healthy stallions were randomly assigned to two groups A and B (n=2 per group). One acted as control group and the other one as treatment group. The treatment consisted in two intramuscular applications of 5 ml / 100 kg PV of Catosal per week following the manufacturer’s doses recommendations. The project was divided in 4 stages of 84 days. In the first stage group A was treated while group B was the control. After that both groups were not treated allowing a washout period for the treated group. Then, the groups were reversed, group B was treated and group A acted as a control. Finally in the last 84 days both groups were kept without any treatment. Semen was diluted to 25 million sperm/mL and evaluated for total sperm count, total and progressive sperm motility (light microscopy), membrane integrity (CFDA/PI staining) and membrane functionality (HOS test) at 0 and 24 hours after preservation at 5º C. Data were analyzed by one way ANOVA and means compared by the Tukey test at 5% level of significance. Experimental endpoints were analyzed to compare the values for the treated stallions in the period of time between the sixty and eighty-four days of treatment versus the same stallions without treatment. No significant differences between treatment and control groups were detected for any of the sperm parameter evaluated in this study. No interactions between stallions were detected. Results show that the use of Catosal for 84 days in the given doses does not alter fresh and cooled semen quality of the young and fertile stallions.

Os Triglicerídeos são essenciais para o metabolismo espermático e um alto nível deste está associado com boa qualidade do sêmen. O nível de ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) é considerado um elemento crítico para a capacitação espermática e está associada à motilidade espermática e com maior fluidez de membrana. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da alimentação suplementar de garanhões, com óleo de arroz comercial (Gama-Horse, HT Nutri ®, Brasil), em parâmetros espermáticos. Quatro garanhões com idades variando entre 6 e 30 anos foram utilizados. Os animais tiveram o mesmo manejo durante os 190 dias de tratamento. O experimento foi dividido em três períodos: pré-tratamento (PT) - 30 dias para a estabilização das reservas espermáticas; tratamento (TR) - 80 dias de suplementação com 200 ml de óleo arroz contendo 34% ácido linolêico, 1% ácido linolênico, 1% gama-oryzanol e 660mg/Kg vitamina E; controle (CN) - 80 dias sem suplementação de óleo de arroz. Ejaculados foram coletados duas vezes por semana com uma vagina artificial. As avaliações do sêmen foram realizadas imediatamente após a colheita, sendo avaliados volume, concentração, motilidade total, funcionalidade (HOST) e integridade (CFDA / PI) da membrana e potencial antioxidante total (TRAP). Uma amostra de sangue foi obtida cada 15 dias para avaliar testosterona e estradiol plasmáticos. Para avaliar o efeito da suplementação de óleo de arroz no sêmen os dados dos últimos 20 dias a partir da TR com os últimos 20 dias a partir da CN foram analisados com ANOVA, com uma significância estatística de P < 0,05. A suplementação do óleo de arroz aumentou a concentração (P < 0,01) (TR: 226 x 106/mL; NC: 172 x 106/mL), motilidade total (P < 0,01) (TR: 59%; NC: 42%), HOST (P < 0,02) (TR: 73%; NC: 69%) e TRAP (P < 0,01) (TR: 1,9 nmol Trolox / mg de proteína; CN: 0,98 nmol Trolox / mg de proteína). Não foram observadas diferenças entre os períodos TR e CN em volume, integridade de membrana, testosterona e estradiol. A suplementação oral com o óleo de arroz comercial contendo PUFA e gama-oryzanol aumentou o potencial antioxidante total do sêmen. Além disso, foi detectado uma maior funcionalidade de membrana, provavelmente devido a defesa antioxidante evitando peroxidação lipídica da membrana espermática ou a uma melhoria da fluidez da membrana. / Triglycerides are essential for sperm metabolism and a high level of triglycerides is associated with good semen quality. The level of polyunsaturated fatty acids (PUFA) is considered a critical feature for capacitation and is associated with sperm motility and with increased membrane fluidity. The aim of this experiment was to evaluate the effects of the supplementary feeding of stallions, with commercial rice oil (Gama- Horse, HT Nutri®, Brazil), on sperm parameters. Four stallions with ages ranging between 6 and 30 years were used. The animals had the same management during the 190 days of trial. The experiment was divided in three periods: pre-treatment (PT) - 30 days to sperm reserves stabilization; treatment (TR) - 80 days supplementation with 200 mL rice oil containing 34% linoleic acid, 1% linolenic acid, 1% gamma oryzanol and 660mg/Kg vitamin E; control (CN) - 80 days without rice oil supplementation. Ejaculates were collected twice a week with an artificial vagina. Semen exams were performed immediately after collection, being evaluated volume, concentration, total motility, functionality (HOST) and integrity (CFDA/PI) of membrane and total antioxidant potential (TRAP). A blood sample was obtained each 15 days to evaluate plasma testosterone and estradiol. To evaluate the effect of the rice oil supplementation the semen data from the last 20 days from TR with the last 20 days from CN were analyzed with ANOVA, with a statistical significance from 0.05. The supplementation of rice oil increased concentration (P < 0.01) (TR: 226 x 106/mL; CN: 172 x 106/mL), total motility (P < 0.01) (TR: 59%; CN: 42%), HOST (P < 0.02) (TR: 73%; CN: 69%) and TRAP (P < 0.01) (TR: 1.9 nmol Trolox/mg of protein; CN: 0.98 nmol Trolox/mg of protein). No differences among periods TR and CN were observed in volume, membrane integrity, testosterone and estradiol. Oral supplementation with the commercial rice oil containing PUFA and gamma-oryzanol increased the total antioxidant potential of the semen. In addition, a higher membrane functionality and motility was detected, probably due to antioxidant protection avoiding lipid peroxidation of sperm membrane or to a improved membrane fluidity.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da utilização da associação do butafosfan e da vitamina B12 (Catosal B12®) na qualidade do sêmen fresco e refrigerado de garanhões. Foram utilizados quatro garanhões divididos aleatoriamente em dois grupos, A e B, cada um com dois garanhões. Um dos grupos serviu como controle e o outro como grupo tratado. Como tratamento utilizaram-se duas aplicações intramusculares de 5 ml /100 kg PV de Catosal por semana. O projeto se dividiu em 4 etapas de 84 dias cada uma. Na primeira etapa o grupo A foi tratado enquanto que o grupo B serviu de controle. Na segunda etapa ambos os grupos deixaram de ser tratados. Na terceira etapa se inverteram os grupos, sendo o B tratado e o A controle. Finalmente na quarta etapa, nenhum dos grupos foi tratado. Imediatamente após a coleta o sêmen foi avaliado e diluído a uma concentração final de 25 x 10 6 de espermatozoides por mililitro. O sêmen fresco e refrigerado a 5ºC foi avaliado quanto a numero total de espermatozoides, motilidade total e progressiva, vigor, morfologia, funcionalidade (HOS test) e integridade de membrana (CFDA/PI staining). Foi realizada ANOVA e as médias pelo teste de Tukey. Não se observaram diferenças significativas entre os grupos tratados e os controles em nenhum dos parâmetros espermáticos avaliados tanto no sêmen fresco quanto no sêmen resfriado. Tampouco foram detectadas interações entre os garanhões para nenhum dos parâmetros observados. O uso prolongado de Catosal intramuscular não teve efeitos negativos e pode ser utilizado com segurança, em garanhões destinados á reprodução. O tratamento intramuscular com Catosal nas doses administradas e recomendadas pelo fabricante, durante 84 dias, não alterou a qualidade do sêmen fresco ou refrigerado por 24 horas dos garanhões jovens e férteis. / The objective of this study was to evaluate the action of butaphosphan, in combination with vitamin B12 (Catosal B12®) on the quality of fresh and cooled stallion semen. Four healthy stallions were randomly assigned to two groups A and B (n=2 per group). One acted as control group and the other one as treatment group. The treatment consisted in two intramuscular applications of 5 ml / 100 kg PV of Catosal per week following the manufacturer’s doses recommendations. The project was divided in 4 stages of 84 days. In the first stage group A was treated while group B was the control. After that both groups were not treated allowing a washout period for the treated group. Then, the groups were reversed, group B was treated and group A acted as a control. Finally in the last 84 days both groups were kept without any treatment. Semen was diluted to 25 million sperm/mL and evaluated for total sperm count, total and progressive sperm motility (light microscopy), membrane integrity (CFDA/PI staining) and membrane functionality (HOS test) at 0 and 24 hours after preservation at 5º C. Data were analyzed by one way ANOVA and means compared by the Tukey test at 5% level of significance. Experimental endpoints were analyzed to compare the values for the treated stallions in the period of time between the sixty and eighty-four days of treatment versus the same stallions without treatment. No significant differences between treatment and control groups were detected for any of the sperm parameter evaluated in this study. No interactions between stallions were detected. Results show that the use of Catosal for 84 days in the given doses does not alter fresh and cooled semen quality of the young and fertile stallions.

Os Triglicerídeos são essenciais para o metabolismo espermático e um alto nível deste está associado com boa qualidade do sêmen. O nível de ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) é considerado um elemento crítico para a capacitação espermática e está associada à motilidade espermática e com maior fluidez de membrana. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da alimentação suplementar de garanhões, com óleo de arroz comercial (Gama-Horse, HT Nutri ®, Brasil), em parâmetros espermáticos. Quatro garanhões com idades variando entre 6 e 30 anos foram utilizados. Os animais tiveram o mesmo manejo durante os 190 dias de tratamento. O experimento foi dividido em três períodos: pré-tratamento (PT) - 30 dias para a estabilização das reservas espermáticas; tratamento (TR) - 80 dias de suplementação com 200 ml de óleo arroz contendo 34% ácido linolêico, 1% ácido linolênico, 1% gama-oryzanol e 660mg/Kg vitamina E; controle (CN) - 80 dias sem suplementação de óleo de arroz. Ejaculados foram coletados duas vezes por semana com uma vagina artificial. As avaliações do sêmen foram realizadas imediatamente após a colheita, sendo avaliados volume, concentração, motilidade total, funcionalidade (HOST) e integridade (CFDA / PI) da membrana e potencial antioxidante total (TRAP). Uma amostra de sangue foi obtida cada 15 dias para avaliar testosterona e estradiol plasmáticos. Para avaliar o efeito da suplementação de óleo de arroz no sêmen os dados dos últimos 20 dias a partir da TR com os últimos 20 dias a partir da CN foram analisados com ANOVA, com uma significância estatística de P < 0,05. A suplementação do óleo de arroz aumentou a concentração (P < 0,01) (TR: 226 x 106/mL; NC: 172 x 106/mL), motilidade total (P < 0,01) (TR: 59%; NC: 42%), HOST (P < 0,02) (TR: 73%; NC: 69%) e TRAP (P < 0,01) (TR: 1,9 nmol Trolox / mg de proteína; CN: 0,98 nmol Trolox / mg de proteína). Não foram observadas diferenças entre os períodos TR e CN em volume, integridade de membrana, testosterona e estradiol. A suplementação oral com o óleo de arroz comercial contendo PUFA e gama-oryzanol aumentou o potencial antioxidante total do sêmen. Além disso, foi detectado uma maior funcionalidade de membrana, provavelmente devido a defesa antioxidante evitando peroxidação lipídica da membrana espermática ou a uma melhoria da fluidez da membrana. / Triglycerides are essential for sperm metabolism and a high level of triglycerides is associated with good semen quality. The level of polyunsaturated fatty acids (PUFA) is considered a critical feature for capacitation and is associated with sperm motility and with increased membrane fluidity. The aim of this experiment was to evaluate the effects of the supplementary feeding of stallions, with commercial rice oil (Gama- Horse, HT Nutri®, Brazil), on sperm parameters. Four stallions with ages ranging between 6 and 30 years were used. The animals had the same management during the 190 days of trial. The experiment was divided in three periods: pre-treatment (PT) - 30 days to sperm reserves stabilization; treatment (TR) - 80 days supplementation with 200 mL rice oil containing 34% linoleic acid, 1% linolenic acid, 1% gamma oryzanol and 660mg/Kg vitamin E; control (CN) - 80 days without rice oil supplementation. Ejaculates were collected twice a week with an artificial vagina. Semen exams were performed immediately after collection, being evaluated volume, concentration, total motility, functionality (HOST) and integrity (CFDA/PI) of membrane and total antioxidant potential (TRAP). A blood sample was obtained each 15 days to evaluate plasma testosterone and estradiol. To evaluate the effect of the rice oil supplementation the semen data from the last 20 days from TR with the last 20 days from CN were analyzed with ANOVA, with a statistical significance from 0.05. The supplementation of rice oil increased concentration (P < 0.01) (TR: 226 x 106/mL; CN: 172 x 106/mL), total motility (P < 0.01) (TR: 59%; CN: 42%), HOST (P < 0.02) (TR: 73%; CN: 69%) and TRAP (P < 0.01) (TR: 1.9 nmol Trolox/mg of protein; CN: 0.98 nmol Trolox/mg of protein). No differences among periods TR and CN were observed in volume, membrane integrity, testosterone and estradiol. Oral supplementation with the commercial rice oil containing PUFA and gamma-oryzanol increased the total antioxidant potential of the semen. In addition, a higher membrane functionality and motility was detected, probably due to antioxidant protection avoiding lipid peroxidation of sperm membrane or to a improved membrane fluidity.

Os Triglicerídeos são essenciais para o metabolismo espermático e um alto nível deste está associado com boa qualidade do sêmen. O nível de ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) é considerado um elemento crítico para a capacitação espermática e está associada à motilidade espermática e com maior fluidez de membrana. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da alimentação suplementar de garanhões, com óleo de arroz comercial (Gama-Horse, HT Nutri ®, Brasil), em parâmetros espermáticos. Quatro garanhões com idades variando entre 6 e 30 anos foram utilizados. Os animais tiveram o mesmo manejo durante os 190 dias de tratamento. O experimento foi dividido em três períodos: pré-tratamento (PT) - 30 dias para a estabilização das reservas espermáticas; tratamento (TR) - 80 dias de suplementação com 200 ml de óleo arroz contendo 34% ácido linolêico, 1% ácido linolênico, 1% gama-oryzanol e 660mg/Kg vitamina E; controle (CN) - 80 dias sem suplementação de óleo de arroz. Ejaculados foram coletados duas vezes por semana com uma vagina artificial. As avaliações do sêmen foram realizadas imediatamente após a colheita, sendo avaliados volume, concentração, motilidade total, funcionalidade (HOST) e integridade (CFDA / PI) da membrana e potencial antioxidante total (TRAP). Uma amostra de sangue foi obtida cada 15 dias para avaliar testosterona e estradiol plasmáticos. Para avaliar o efeito da suplementação de óleo de arroz no sêmen os dados dos últimos 20 dias a partir da TR com os últimos 20 dias a partir da CN foram analisados com ANOVA, com uma significância estatística de P < 0,05. A suplementação do óleo de arroz aumentou a concentração (P < 0,01) (TR: 226 x 106/mL; NC: 172 x 106/mL), motilidade total (P < 0,01) (TR: 59%; NC: 42%), HOST (P < 0,02) (TR: 73%; NC: 69%) e TRAP (P < 0,01) (TR: 1,9 nmol Trolox / mg de proteína; CN: 0,98 nmol Trolox / mg de proteína). Não foram observadas diferenças entre os períodos TR e CN em volume, integridade de membrana, testosterona e estradiol. A suplementação oral com o óleo de arroz comercial contendo PUFA e gama-oryzanol aumentou o potencial antioxidante total do sêmen. Além disso, foi detectado uma maior funcionalidade de membrana, provavelmente devido a defesa antioxidante evitando peroxidação lipídica da membrana espermática ou a uma melhoria da fluidez da membrana. / Triglycerides are essential for sperm metabolism and a high level of triglycerides is associated with good semen quality. The level of polyunsaturated fatty acids (PUFA) is considered a critical feature for capacitation and is associated with sperm motility and with increased membrane fluidity. The aim of this experiment was to evaluate the effects of the supplementary feeding of stallions, with commercial rice oil (Gama- Horse, HT Nutri®, Brazil), on sperm parameters. Four stallions with ages ranging between 6 and 30 years were used. The animals had the same management during the 190 days of trial. The experiment was divided in three periods: pre-treatment (PT) - 30 days to sperm reserves stabilization; treatment (TR) - 80 days supplementation with 200 mL rice oil containing 34% linoleic acid, 1% linolenic acid, 1% gamma oryzanol and 660mg/Kg vitamin E; control (CN) - 80 days without rice oil supplementation. Ejaculates were collected twice a week with an artificial vagina. Semen exams were performed immediately after collection, being evaluated volume, concentration, total motility, functionality (HOST) and integrity (CFDA/PI) of membrane and total antioxidant potential (TRAP). A blood sample was obtained each 15 days to evaluate plasma testosterone and estradiol. To evaluate the effect of the rice oil supplementation the semen data from the last 20 days from TR with the last 20 days from CN were analyzed with ANOVA, with a statistical significance from 0.05. The supplementation of rice oil increased concentration (P < 0.01) (TR: 226 x 106/mL; CN: 172 x 106/mL), total motility (P < 0.01) (TR: 59%; CN: 42%), HOST (P < 0.02) (TR: 73%; CN: 69%) and TRAP (P < 0.01) (TR: 1.9 nmol Trolox/mg of protein; CN: 0.98 nmol Trolox/mg of protein). No differences among periods TR and CN were observed in volume, membrane integrity, testosterone and estradiol. Oral supplementation with the commercial rice oil containing PUFA and gamma-oryzanol increased the total antioxidant potential of the semen. In addition, a higher membrane functionality and motility was detected, probably due to antioxidant protection avoiding lipid peroxidation of sperm membrane or to a improved membrane fluidity.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da utilização da associação do butafosfan e da vitamina B12 (Catosal B12®) na qualidade do sêmen fresco e refrigerado de garanhões. Foram utilizados quatro garanhões divididos aleatoriamente em dois grupos, A e B, cada um com dois garanhões. Um dos grupos serviu como controle e o outro como grupo tratado. Como tratamento utilizaram-se duas aplicações intramusculares de 5 ml /100 kg PV de Catosal por semana. O projeto se dividiu em 4 etapas de 84 dias cada uma. Na primeira etapa o grupo A foi tratado enquanto que o grupo B serviu de controle. Na segunda etapa ambos os grupos deixaram de ser tratados. Na terceira etapa se inverteram os grupos, sendo o B tratado e o A controle. Finalmente na quarta etapa, nenhum dos grupos foi tratado. Imediatamente após a coleta o sêmen foi avaliado e diluído a uma concentração final de 25 x 10 6 de espermatozoides por mililitro. O sêmen fresco e refrigerado a 5ºC foi avaliado quanto a numero total de espermatozoides, motilidade total e progressiva, vigor, morfologia, funcionalidade (HOS test) e integridade de membrana (CFDA/PI staining). Foi realizada ANOVA e as médias pelo teste de Tukey. Não se observaram diferenças significativas entre os grupos tratados e os controles em nenhum dos parâmetros espermáticos avaliados tanto no sêmen fresco quanto no sêmen resfriado. Tampouco foram detectadas interações entre os garanhões para nenhum dos parâmetros observados. O uso prolongado de Catosal intramuscular não teve efeitos negativos e pode ser utilizado com segurança, em garanhões destinados á reprodução. O tratamento intramuscular com Catosal nas doses administradas e recomendadas pelo fabricante, durante 84 dias, não alterou a qualidade do sêmen fresco ou refrigerado por 24 horas dos garanhões jovens e férteis. / The objective of this study was to evaluate the action of butaphosphan, in combination with vitamin B12 (Catosal B12®) on the quality of fresh and cooled stallion semen. Four healthy stallions were randomly assigned to two groups A and B (n=2 per group). One acted as control group and the other one as treatment group. The treatment consisted in two intramuscular applications of 5 ml / 100 kg PV of Catosal per week following the manufacturer’s doses recommendations. The project was divided in 4 stages of 84 days. In the first stage group A was treated while group B was the control. After that both groups were not treated allowing a washout period for the treated group. Then, the groups were reversed, group B was treated and group A acted as a control. Finally in the last 84 days both groups were kept without any treatment. Semen was diluted to 25 million sperm/mL and evaluated for total sperm count, total and progressive sperm motility (light microscopy), membrane integrity (CFDA/PI staining) and membrane functionality (HOS test) at 0 and 24 hours after preservation at 5º C. Data were analyzed by one way ANOVA and means compared by the Tukey test at 5% level of significance. Experimental endpoints were analyzed to compare the values for the treated stallions in the period of time between the sixty and eighty-four days of treatment versus the same stallions without treatment. No significant differences between treatment and control groups were detected for any of the sperm parameter evaluated in this study. No interactions between stallions were detected. Results show that the use of Catosal for 84 days in the given doses does not alter fresh and cooled semen quality of the young and fertile stallions.

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

As biotécnicas da reprodução na espécie equina avançaram na última década, tanto em conhecimento agregado por pesquisas como também pela demanda do mercado. No entanto, na espécie equina machos com subfertilidade são diagnosticados frequentemente com elevado número de espermatozoides com alterações morfológica e/ou imóveis. A utilização apenas de células viáveis para realizar o processo de resfriamento busca evitar perda de material (diluente) e produção de metabólitos tóxicos aos espermatozoides viáveis. O objetivo deste estudo foi utilizar a separação espermática (lã de vidro e centrifugação com Androcoll®) pré-resfriamento para incrementar a viabilidade do sêmen de garanhões pôneis refrigerados a 5ºC durante 48h. Os parâmetros motilidade, funcionalidade de membrana (HOST), viabilidade espermática (CFDA/PI), atividade mitocondrial e morfologia espermática foram avaliados no sêmen fresco e refrigerado (24 e 48h). A utilização da filtração por lã de vidro ou Androcoll® pré-resfriamento do sêmen equino selecionou espermatozoides com maior motilidade, funcionalidade de membrana, viabilidade espermática e atividade mitocondrial. Adicionalmente, a filtração por lã de vidro proporcionou refrigerar sêmen com elevado número de células morfologicamente normais sem perdas significativas de espermatozoides pelo processo de filtração. Tanto a técnica de lã de vidro como a centrifugação com Androcoll® mostraram-se eficientes em separar ejaculados com maior viabilidade para o resfriamento. Já a técnica de lã de vidro apresenta-se como uma técnica de baixo custo e de fácil execução para ser aplicada tanto para pequenos, ou grandes volumes de sêmen. / The reproduction biotechnologies in equine species have advanced in the last decade both in aggregate knowledge by research as well as the market demand. However, it in the equine species often with male subfertility where the ejaculate has a high number of sperm with morphological and / or property changes. The use of only viable cells to perform the cooling process seeks to avoid loss of material (diluent) and production of toxic metabolites to viable sperm. The aim of this study was to use the sperm separation (glass and spin wool with Androcoll®) pre-cooling to increase the viability of semen chilled ponies stallions at 5 ° C for 48 hours. We evaluated the motility parameters, membrane functionality (HOST), sperm viability (CFDA / PI), mitochondrial activity and morphology in fresh and chilled semen (24 and 48h). The use of filtration glass wool or Androcoll® pre-cooling of equine semen selected sperm with higher motility, functionality membrane, sperm viability and mitochondrial activity. In addition to filtration through glass wool afforded cooling semen with a high number of morphologically normal cells without significant losses of spermatozoids the filtration process. Both glass wool technique as centrifugation with Androcoll® were efficient in separating ejaculated more viability for cooling. Already glass wool technique presents itself as a low cost and simple technique to be applied to both small or large volumes of semen.

As biotécnicas da reprodução na espécie equina avançaram na última década, tanto em conhecimento agregado por pesquisas como também pela demanda do mercado. No entanto, na espécie equina machos com subfertilidade são diagnosticados frequentemente com elevado número de espermatozoides com alterações morfológica e/ou imóveis. A utilização apenas de células viáveis para realizar o processo de resfriamento busca evitar perda de material (diluente) e produção de metabólitos tóxicos aos espermatozoides viáveis. O objetivo deste estudo foi utilizar a separação espermática (lã de vidro e centrifugação com Androcoll®) pré-resfriamento para incrementar a viabilidade do sêmen de garanhões pôneis refrigerados a 5ºC durante 48h. Os parâmetros motilidade, funcionalidade de membrana (HOST), viabilidade espermática (CFDA/PI), atividade mitocondrial e morfologia espermática foram avaliados no sêmen fresco e refrigerado (24 e 48h). A utilização da filtração por lã de vidro ou Androcoll® pré-resfriamento do sêmen equino selecionou espermatozoides com maior motilidade, funcionalidade de membrana, viabilidade espermática e atividade mitocondrial. Adicionalmente, a filtração por lã de vidro proporcionou refrigerar sêmen com elevado número de células morfologicamente normais sem perdas significativas de espermatozoides pelo processo de filtração. Tanto a técnica de lã de vidro como a centrifugação com Androcoll® mostraram-se eficientes em separar ejaculados com maior viabilidade para o resfriamento. Já a técnica de lã de vidro apresenta-se como uma técnica de baixo custo e de fácil execução para ser aplicada tanto para pequenos, ou grandes volumes de sêmen. / The reproduction biotechnologies in equine species have advanced in the last decade both in aggregate knowledge by research as well as the market demand. However, it in the equine species often with male subfertility where the ejaculate has a high number of sperm with morphological and / or property changes. The use of only viable cells to perform the cooling process seeks to avoid loss of material (diluent) and production of toxic metabolites to viable sperm. The aim of this study was to use the sperm separation (glass and spin wool with Androcoll®) pre-cooling to increase the viability of semen chilled ponies stallions at 5 ° C for 48 hours. We evaluated the motility parameters, membrane functionality (HOST), sperm viability (CFDA / PI), mitochondrial activity and morphology in fresh and chilled semen (24 and 48h). The use of filtration glass wool or Androcoll® pre-cooling of equine semen selected sperm with higher motility, functionality membrane, sperm viability and mitochondrial activity. In addition to filtration through glass wool afforded cooling semen with a high number of morphologically normal cells without significant losses of spermatozoids the filtration process. Both glass wool technique as centrifugation with Androcoll® were efficient in separating ejaculated more viability for cooling. Already glass wool technique presents itself as a low cost and simple technique to be applied to both small or large volumes of semen.