Els pacients amb malaltia renal crònica (MRC) tenen una alta incidència de càncer i alts nivells de dany genètic degut a diverses causes com ara la inestabilitat genètica, deguda a defectes en la reparació del DNA, l’efecte genotòxic d’algunes toxines urèmiques, la reducció d’antioxidants, i l’estrès oxidatiu causat pel procés de diàlisi. La utilització de noves tècniques de diàlisi i complementar la teràpia amb antioxidants podria ajudar a reduir el dany genètic dels pacients amb MRC i minimitzar les seves conseqüències. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar el dany genètic en pacients amb MRC i avaluar si les diferents tècniques de diàlisi poden modular el dany observat. Per això ens vam proposar realitzar els següents estudis: (I) un estudi transversal avaluant el dany genètic en una població de 373 malalts amb MRC i 179 controls; (II) un estudi longitudinal sobre de l’efecte que pot tenir el temps en hemodiàlisi (HD) en els nivells de dany genètic de 70 pacients amb MRC sotmesos a HD; (III) un estudi longitudinal, en una població de 33 individus, sobre els efectes que produeix el canvi d’HD a hemodiafiltració (HDF) a nivell de dany genètic; (IV) un estudi longitudinal, en una població de 29 individus, sobre l’efecte que produeix en el dany genètic i la capacitat antioxidant el canvi de membranes d’HD de polisulfona (PS) a membranes de PS recobertes de vitamina E (PSE). Els nostres resultats mostren que els pacients amb MRC presenten major dany genètic (valorat com a freqüència de micronuclis, MN) i inestabilitat genòmica (radiosensibilitat). De la mateixa manera hem pogut observar que el temps en HD ajuda a disminuir els nivells de dany en el DNA i incrementa l’habilitat de reparació en els pacients amb MRC. També hem observat que l’HDF és una bona alternativa a l’HD per disminuir els nivells de dany genètic i millorar la capacitat antioxidant dels malalts; però en canvi l’ús de membranes PSE, tot i que redueixen les bases oxidades del DNA, no han demostrat canvis significatius en la capacitat antioxidant ni en la freqüència basal de MN i trencaments del DNA. Les toxines urèmiques, acumulades durant la MRC degut a la reducció del filtrat glomerular, poden estar involucrades tant en l’evolució de la malaltia, com en l’increment de dany genètic dels malalts . Així, aquest ambient urèmic i la inflamació crònica es creu que poden estar involucrats en la reparació de ferides, accentuant el dany renal dels pacients. La fibrosi tubulo-intersticial és el resultat d’una reparació aberrant on el teixit epitelial és substituït per una cicatriu produïda per l’acumulació de matriu extracel·lular. Per a millorar la comprensió dels efectes de les toxines urèmiques en la reparació de les ferides i en el procés fibròtic, un altre objectiu ha estat avaluar in vitro l’efecte de quatre compostos resultants del estrès carbonil (GO, MGO, MDA i HHE) sobre la capacitat de reparar lesions en l’epiteli tubular. Cal emfatitzar que aquest ha estat el primer cop que s’avaluen l’efecte del compostos reactius de carbonil (RCC) en la reparació de ferides en el ronyó. Els nostres resultats mostren que els RCC tenen efectes diferenciats en la reparació de ferides. Mentre el MDA i el GO endarrereixen el tancament de les ferides mitjançant la disrupció de la vimentina i la desciliació de les cèl·lules tubulars, l’HHE i en menor grau el MGO, produeixen canvis morfològics, transcriptòmics i proteics en les cèl·lules tubulars compatibles amb la anomenada transició epiteli-mesènquima (EMT). La lleu disrupció de la vimentina observada després d’aquests tractaments, evitaria un increment en la capacitat de migració propi d’una completa EMT. / The patients suffering from chronic kidney disease (CKD) have high incidence of cancer and genetic damage levels due to several causes such as genetic instability (due to DNA repair defects), genotoxic effect of some uremic toxins, antioxidant reduction and oxidative stress induced by the dialysis process. It is believed that the use the use of new dialysis techniques and supplement the patient’s therapy with antioxidants could help to reduce DNA damage in CKD patients and minimize its consequences. In this context, an important objective of this Thesis was to study the DNA damage of CKD patients and to evaluate whether the different dialysis techniques can modulate de DNA damage observed in the patients. For this, we realized the following studies: (I) a transversal study of the DNA damage in a 373 CKD patients and 179 controls population; (II) a follow up study about the effect of the time in hemodialysis (HD) on the DNA damage levels of 70 patients submitted in HD; (III) a follow-up study, in a 33 patients population, about the effects on DNA damage that produced the switch from HD to hemodiafiltration; (IV) a follow-ip study about the effect on DNA damage and antioxidant capacity that produce the switch from polysulfone HD membrane to vitamin E-coated polysulfone membranes. Our results show that CKD patients had high levels of genetic damage (measured as micronucleus, MN, frequency in peripheral blood lymphocytes) and genomic instability (radiosensitivity). We also observed that the HD helped to reduce DNA damage levels and increased the repair capacity in CKD patients. Our data showed that hemodiafiltration is a good alternative to HD to reduce genetic damage levels and increase the antioxidant capacity of CKD patients. However the use of vitamin E-covered membranes reduced oxidized DNA bases, it failed to reduce antioxidant capacity and the basal frequency of MN and DNA breaks. The glomerular filtration reduction of CKD patients leads to uremic toxins accumulation. These compounds can be involved both in the progression of the disease and in the high levels of DNA damage found in this patients. It has been reported that uremic milieu and chronic inflammation are involved in wound healing and enhanced kidney damage in CKD patients. Tubulo-interstitial fibrosis results from an aberrant wound-healing ability the normal epithelial tissue is substituted for scar tissue caused by accumulation of extracellular matrix proteins. To better comprehend the effect of uremic toxins in wound healing and fibrosis, another objective of this Thesis was to evaluate, in vitro, the effects of four compounds resulting from carbonyl stress (Glyoxal (GO), methylglyoxal (MGO), malonyldialdehyde (MDA) and 4-hydroxy-hexenal (HHE)) on the wound healing capacity of the proximal tubular epithelia. This is the first study that evaluates reactive carbonyl compounds (RCC) effects on renal wound healing. Our findings showed that RCC differentially affects wound healing in renal proximal cells. Our data demonstrated that MDA and GO delay wound closure mediated by vimentin disruption and deciliation. In contrast, HHE treated cells (and MGO in minor degree) exhibited mesenchymal-like phenotype but we hypothesize that minor vimentin disruption observed prevent migration enhancement.

In the present work the regulatory role played by the HLA class I (HLA-I)-specific LILRB1 inhibitory receptor in human macrophages (MΦ) was addressed. In vitro differentiated monocyte-derived M1 and M2 MΦ expressed different LILRB1 levels. We provide experimental evidence supporting that LILRB1-HLA-I interaction regulated the MΦ activation threshold, controlling cytokine secretion under steady state as well as in response to tumor cells and to signaling through activating receptors. On the other hand, our observations support that LILRB1 binding to cells occurred independently of total HLA-I expression levels, correlating with HLA-I dimerization. Such conformational change was detectable in type I IFN-treated MΦ and associated to an enhanced LILRB1-HLA-I interaction, thus providing a potential regulatory mechanism to control MΦ activation / En aquest projecte hem analitzat la participació del receptor inhibidor específic per HLA de classe I: LILRB1, en la regulació de la funció dels macròfags humans (MΦ). Els macròfags M1 i M2 diferenciats in vitro expressen nivells diferents de LILRB1. Aportem evidències experimentals que recolzen el paper de la interacció LILRB1/HLA-I com element regulador del llindar d’activació en la homeòstasi del macròfag, influint en la secreció de citocines en condicions basals així com en resposta a cèl.lules tumorals i a la senyalització de receptors activadors dependents de motius ITAM. D’altra banda, les nostres observacions indiquen que el reconeixement de cèl.lules diana per part de LILRB1 es dóna independentment del nivell d’expressió de les molècules del HLA en la seva superfície, però correlaciona amb la dimerització d’aquestes molècules. Aquest canvi conformacional, detectat en MΦ tractats amb interferons de tipus I, s’associa a un increment de la interacció entre LILRB1 i HLA-I, suggerint un possible mecanisme regulador de l’activació del MΦ.

In many gonochoristic fish, sex is plastic since it can be altered by the influence of environmental factors. In this thesis, using the European sea bass (Dicentrarchus labrax) model, a teleost fish with a polygenic sex determining system influenced by the environment, we have studied the effects of different environmental factors —including food supply, elevated temperatures and presence of estrogens— on growth, sex differentiation and gonadal development of juveniles. Global analysis of gene expression was carried out by a custom-made microarray. We found that, like in mammals, sex determines growth and that the first sex-related differences in growth are established before the appearance of the first molecular markers indicative of sex. Further, the juvenile testis transcriptome is influenced by poor growth during sex differentiation, while proper food supply during juvenile development is able to rescue the testis transcriptome of previously poor-growing individuals. We found that the previously observed masculinization as a result of elevated temperatures is caused by long-lasting effects at the transcriptomic level, by favoring the expression of male-related genes and decreasing that of female-related genes. In contrast, exposure to estrogen negatively affects both male- and female-related genes and pathways. Interestingly, the expression patterns of a suite of genes related to epigenetic regulatory mechanisms of gene expression showed different degrees of dependency to genetic background, developmental time and external influences according to their functional category. / A molts peixos gonocoristes, el sexe és plàstic donat que pot ésser alterat per la influència de factors ambientals. En aquesta tesi, utilitzant el llobarro (Dicentrarchus labrax) com a model, un peix teleosti amb un sistema poligènic de determinació del sexe influït per l'ambient, hem estudiat els efectes de diferents factors ambientals —incloent la disponibilitat d'aliment, temperatures elevades i presència d’estrògens— en el creixement, la diferenciació sexual i el desenvolupament gonadal dels juvenils. L'anàlisi global de l'expressió gènica s'ha realitzat mitjançant un xip d’ADN fet a mida. Hem trobat que, de la mateixa manera que ocorre en els mamífers, el sexe determina el creixement i que les primeres diferències en el creixement vinculades amb el sexe s'estableixen prèviament a l'aparició dels primers marcadors moleculars indicatius del sexe. A més, el transcriptoma de testicles juvenils està influït per un creixement pobre durant la diferenciació sexual, mentre que un subministrament adequat de menjar durant l’etapa juvenil és capaç de rescatar el transcriptoma testicular d’animals amb un pobre creixement previ. Hem trovat que la masculinització observada anteriorment com a resultat de les temperatures elevades està causada per efectes persistents a nivell transcriptòmic, afavorint l'expressió de gens relacionats amb el desenvolupament masculí i disminuint la dels gens relacionats amb el desenvolupament femení. Per contra, l'exposició a estrògens afecta negativament tant als gens relacionats amb el desenvolupament masculí com el femení. És destacable com els patrons d'expressió d'una sèrie de gens relacionats amb la regulació epigenètica de l’expressió gènica mostren graus diferents de dependència a factors genètics, període del desenvolupament i factors ambientals segons la seva categoria funcional.

Genome wide association studies (GWAS) have pointed out ORMDL3 gene as a risk factor for several proinflammatory and autoimmune diseases. The protein encoded by this gene belongs to a family of transmembrane proteins of the endoplasmic reticulum involved in calcium homeostasis and cellular lipid metabolism. The driving force behind this work was the compelling idea of finding out a precise mechanism for the pathological association of this protein. This thesis explores the potential role of ORMDL3 in T lymphocytes focusing on the activation process. Thus, we have demonstrated that calcium signaling and activation of T cells are influenced by the expression levels of ORMDL3. Besides, we have shown that inherited components of our genome modify ORMDL3 expression levels and lymphocyte physiology. Finally, we have characterized the molecular complex formed by ORMDL proteins. Altogether, this work allows a better understanding of the pathophysiology associated to ORMDL3 and its linkage with the immune system. / Estudis d’associació genètica ample han apuntat cap al gen ORMDL3 com a factor de risc per diverses malalties pro-inflamatòries i autoimmunes. La proteïna codificada per aquest gen pertany a una família de proteïnes transmembrana del reticle endoplàsmic involucrada en l’homeòstasi de calci i en el metabolisme lipidic cel•lular. El motiu que ens va impulsar a dur a terme aquest treball era la idea de trobar el mecanisme darrere les associacions a patologia per aquesta proteïna. Aquesta tesis explora el rol potencial d’ORMDL3 en limfòcits T, amb èmfasi al procés d’activació. Així doncs hem demostrat que la senyalització de calci i la activació de cèl•lules T es veu influenciada pels nivells d’expressió d’ORMDL3. A més hem demostrat que components del nostre genoma modifiquen els nivells d’expressió d’ORMDL3 i la fisiologia limfocitària. Per acabar hem caracteritzat el complex molecular de les proteïnes ORMDL. En conjunt, aquest treball permet una millor comprensió de la fisiopatologia associada a ORMDL3 i la seva relació amb el sistema immune

Morphogenesis creates a plethora of complex shapes in plants and animals. We devote this work to the study of Drosophila head involution (HI), a late embryogenetic process, which involves complete rearrangement of the head tissues, internalization of the brain and spreading of the epidermis. We show, for the first time, the complete kinetics of HI with high spatial and temporal resolution. We describe the movements leading to the internalization of the embryonic brain, its “sculpting” by apoptosis, and cell removal by hemocytes. We then focus on the epidermal progression over the head, which can be divided into two phases: rolling and sliding. We show that both phases are powered by a supracelullar actomyosin cable. We also show that the spreading of the epidermis is spatially controlled resulting in segments of equal width being precisely positioned along the AP axis. This positional control is performed by patterned tensile forces along the epidermal layer regulated by hedgehog signaling. Our study reveals a mechanism by which genes involved in body segmentation are also regulating morphogenesis. / La morfogènesi crea una plètora de formes complexes en animals i plantes. Hem consagrat aquest treball a l'estudi de la involució del cap (head involution HI) de Drosophila, un procés embriogenètic tardiu, que implica un complet rearranjament dels teixits del cap, així com la internalització del cervell i la propagació de l'epidermis. Mostrem, pel primer cop, la cinètica completa de HI amb una alta resolució espacial i temporal. Describim els moviments que porten a la internalització del cervell de l'embrió, així com el seu “sculpting” per apoptosi i l'eliminació de cèl.lules pels hemòcits. Seguidament, hem enfocat l'estudi en la progressió de l'epidermis sobre el cap de l'embrió, essent aquest un esdeveniment que es pot dividir en dues fases: rodolament i lliscament. Mostrem que totes dues fases son impulsades per un cable d'actomyosina. També mostrem que la propagació de l'epidermis es troba espacialment controlada, tenint aquest control com a resultat la formació de segments de mateixa amplada posicionats de manera precisa al llarg the l'axis AP. Aquest control posicional és dut a terme per forces tènsils al llarg de la capa epidèrmica regulades per hedgehog. El nostre estudi revela un mecanisme pel qual els gens involucrats en la segmentació troncal regulen al seu torn la morfogènesi

Alternative splicing is an essential regulatory layer of gene expression that expands the coding potential of the genome in multicellular organisms. The spliceosome -the sophisticated machinery involved in intron removal- allows versatile regulation of gene expression programs. The splicing process relies on the dynamic interplay between hundreds of components of the spliceosome, and the steps at which the complex process of the splicing reaction can be regulated remain largely unknown. The main objective of this thesis has been to develop high- throughput approaches to systematically identify novel regulators of alternative splicing, as well as to study the mechanisms by which they modulate splice site choice. We have identified a variety of regulators of Fas/CD95 alternative splicing within and outside of the splicing machinery and provide novel insights into connections between iron homeostasis and alternative splicing regulation. Using computational networks, we carried out a systematic functional analysis of the spliceosome components and their regulatory potential. Our results reveal the extensive regulatory plasticity of core spliceosome components throughout its assembly process. They also identified links between alternative splicing and iron homeostasis, providing a mechanism by which iron modulates alternative splicing through regulation of the RNA binding properties of a Zinc knuckle domain in the SR regulatory protein SRSF7. The results of this thesis highlight the value of high throughput technologies and network analyses to study complex molecular mechanisms, and unveils novel functional connections between the splicing machinery and other cellular processes. / El procesamiento alternativo del pre-ARNm constituye uno de los pilares esenciales en la regulación de la expresión génica y expande la capacidad codificadora del genoma en organismos multicelulares. El Espliceosoma – la maquinaria encargada de la eliminación alternativa de los intrones- permite una regulación multifacética de los programas genéticos en el interior de la célula. El proceso de corte y empalme se sustenta en la interacción dinámica de cientos de componentes del Espliceosoma, y los distintos niveles de regulación de la compleja reacción de splicing permanecen aun sin descubrir. El objetivo principal de esta tesis se ha centrado en el desarrollo de tecnologías sistematicas de alto cribado para identificar reguladores potenciales del procesamiento alternativo del pre- ARNm, así como los mecanismos implicados en su regulación. Hemos identificado una gran variedad de reguladores del procesamiento alternativo de Fas/CD95, tanto componentes esenciales del espliceosoma como factores implicados en otros procesos biologicos, y hemos observado una conexión inédita entre la regulación del splicing alternativo y el proceso de homeostasis modulado por hierro. Mediante el uso de redes computacionales, hemos llevado a cabo un análisis sistemático y funcional de los componentes del Espliceosoma y hemos identificado el potencial regulador de los mismos en la reacción de corte y empalme. Nuestros resultados reflejan una inmensa plasticidad de los factores esenciales del Espliceosoma a lo largo de toda a reacción de ensamblaje. Además, hemos conseguido identificar el mecanismo potencial por el cual la homeostasis del hierro ejerce su función en splicing alternativo a través de la modulación de la actividad de unión a RNA -mediada por un dominio de unión a cinc- en la proteína reguladora de splicing SRSF7. Los resultados de esta tesis enfatizan la relevancia de las tecnologías emergentes de alto cribado y el análisis de redes computacionales en el estudio de complejos mecanismos moleculares, y desvelan nuevas conexiones funcionales entre la maquinaria de splicing y otros procesos celulares.

Entre un 30% i un 80% dels pacients diagnosticats de Leucèmia o de Síndrome Mielodisplàstica (SMD) presenten alteracions citogenètiques que poden variar amb l’edat i el sexe, i cada una d’elles confereixen un pronòstic diferent. D'altra banda, la predisposició genètica de cada individu, l’exposició a factors medi ambientals i l’estil de vida poden influir a l’aparició d’una Leucèmia o SMD. Els objectius de la tesi han estat: 1.- caracteritzar i determinar la freqüència d’alteracions citogenètiques de pacients diagnosticats de diferents tipus de leucèmia i SMD de quatre regions sanitàries diferenciades geogràficament: Barcelonès Nord i Baix Maresme (hospital Germans Trias i Pujol – HGTIP), Tarragonès i Terres d'Ebre (hospitals Verge de la Cinta i Joan XXIII – HVC/HJXXIII), Gironès, Plà de L'Estany i Selva Interior (Hospital Josep Trueta – HJT) i Hospitalet, Prat del Llobregat, Garraf, Anoia i Alt Penedès (Hospital Duran i Reynals – HDiR) entre els anys 1990 i 2009; 2.- Analitzar si existeixen diferències entre les quatre regions sanitàries en els diferents tipus de leucèmia (leucèmia mieloide crònica - LMC, leucèmia mieloide aguda - LMA, leucèmia limfoblàstica aguda - LLA i leucèmia limfàtica crònica - LLC) i SMD respecte: la freqüència del cariotip alterat, els diferents tipus d’anomalia, el grau de complexitat i en la distribució dels grups de risc citogenètics. Pacients, material i mètode: pacients ≥15 anys diagnosticats consecutivament de Leucèmia o SMD entre els anys 1990 i 2009. El diagnòstic es va establir per citologia i immunofenotip. L’estudi citogenètic s’ha realitzat en un sol centre aplicant les tècniques del cariotip i de la hibridació in situ per fluorescència (FISH). El cariotip ha estat mitjançant el cultiu de 24 hores de les cèl·lules immadures en el cas de la LMC, LMA, LLA i SMD, cultiu de 72 hores i estimulació amb phorbol 12-myristate 13-acetate de les cèl·lules de fenotip B en el cas de la LLC. L’anàlisi cromosòmic ha estat segons el patró de bandes G (ISCN 2009). La FISH s’ha aplicat quan era necessari completar l’estudi del cariotip i en tots els casos de LLC. Les sondes de FISH utilitzades han estat: en la LMC Abbot LSI BCR-ABL sonda de dos colors i de dues fusions, en la LMA Abbot LSI CBFB, inv(16), MLL sonda de dos colors, LSI PML/RARA sonda de dos colors i de dues fusions, en la LLA Abbot LSI BCR-ABL sonda de dos colors i de dues fusions, LSI MLL sonda de dos colors i en la LLC Abbot LSI D13S319 / 13q3413q34 / CEP 12 / LSI ATM / LSI TP53. Conclusions: 1. El percentatge de casos amb cariotip alterat en els casos diagnosticats de SMD ha estat del 40,3%, en les LMA del 56,5%, en les LLA del 75,3%,i en el casos diagnosticats de LLC del 77,9% (cariotip més FISH). 2. L’anomalia més freqüent en els pacients diagnosticats de SMD ha estat la deleció 5q, en la LMA la t(15;17)(q22;q12), en la LLA la t(9;22)(q34;q11.2) i en la LLC la trisomia 12 per cariotip i la del(13)(q14) per FISH. 3. El percentatge de casos amb cariotip complex en els pacients diagnosticats de SMD ha estat del 24,4%, en la LMA del 31,1%, en la LLA del 28,5% i en la LLC ha estat del 17,2%. 4. En el grup de pacients menors de 60 anys les anomalies més freqüents que s’han observat de manera estadísticament significativa han estat la t(15;17)(q22;q12), t(8;21)(q22;q22) i inv(16)(p13q22) en el cas de la LMA, i la t(1;19)(q23;p13.3), t(4;11)(q21;q23) i hiperdiploïdia en el cas de la LLA. En el grup de pacients de 60 anys o més grans les anomalies més freqüents que s’han observat de manera estadísticament significativa han estat el cariotip complex en el cas de la LMA i la t(9;22)(q34;q11.2) en el cas de la LLA. 5. En el grup de pacients de sexe femení les anomalies més freqüents que s’han observat de manera estadísticament significativa han estat la deleció 5q en el cas de les SMD i la trisomia 12 en el cas de la LLC. En el grup de pacients de sexe masculí les anomalies més freqüents que s’han observat de manera estadísticament significativa han estat la trisomia8 en el cas de les SMD i les delecions 11q22.3/ATMen el cas de la LLC. 6. Els pacients que han estat diagnosticats en l’Hospital ICO-HGTIP (regió R1, Barcelonès Nord/Baix Maresme) presenten de manera estadísticament significativa en el cas de les SMD, més proporció de cariotips alterats i un percentatge de casos en el grup de risc citogenètic advers superior a la resta de centres. 7. Els pacients que han estat diagnosticats en l’Hospital ICO-HJT (Regió R3, Gironès/Pla de l’Estany/Selva Interior) presenten de manera estadísticament significativa més casos de translocació variant a la t(9;22) en el cas de la LMC i més cariotips complexos en el cas de les SMD que la resta de centres. 8. Els pacients que han estat diagnosticats en els Hospitals HVC/HJXXIII (regió R2, Terres de l’Ebre/Tarragonès) presenten de manera estadísticament significativa en el cas de la LMA un percentatge de casos en el grup de risc citogenètic favorable inferior a la resta de centres. / Between 30% and 80% of patients diagnosed with leukemia or Myelodysplastic Syndromes (MDS) have cytogenetic abnormalities that may vary with age and sex, and each one confers a different prognosis. On the other hand, the genetic predisposition of each individual, exposure to environmental factors and lifestyle may influence the occurrence of leukemia or MDS. The aim of the study was: 1. - Characterize and determine the frequency of cytogenetic abnormalities in patients diagnosed with different types of leukemia and MDS among four geographically distinct health regions: Barcelona Nord and Baix Maresme (Hospital Germans Trias i Pujol - HGTIP), Tarragona and Terres d'Ebre (Hospitals Verge de la Cinta and Joan XXIII - HVC / HJXXIII), Girona, Plà de l’Estany i Selva Interior (Josep Trueta Hospital - HJT) and Hospitalet, Prat de Llobregat, Garraf, Alt Penedès and Anoia (Hospital Duran i Reynals - HDiR ) between 1990 and 2009; 2. - Analyze the differences between the four health regions in different types of leukemia (chronic myeloid leukemia - CML, acute myeloid leukemia - AML, acute lymphoblastic leukemia - ALL and chronic lymphocytic leukemia - CLL) and MDS respect: the frequency of abnormal karyotypes, the different types of anomaly, and the degree of complexity and distribution of the cytogenetic risk groups. Patients, material and methods: Patients ≥ 15 years old consecutively diagnosed of leukemia or MDS between 1990 and 2009. Diagnosis was established by cytology and immunophenotype. The cytogenetic study was conducted in a single center using the techniques of karyotyping and fluorescence in situ hybridization (FISH). The karyotype was 24 hours by culturing of immature cells in the case of CML, AML, ALL and MDS, growing 72 -hour stimulation with phorbol 12 - myristate 13 - acetate on cell phenotype B in the case of CLL. The chromosomal analysis was according to the G banding (ISCN 2009). FISH was applied when necessary to complete the study of the karyotype and in all cases of CLL. The FISH probes used were: the LSI BCR -ABL, LSI CBFB, LSI MLL, LSI PML-RARA, LSI D13S319 / 13q3413q34 / CEP 12 / LSI ATM / LSI TP53 (Abbot). Conclusions: 1. Percentage of cases with abnormal karyotype in MDS has been 40.3 % , 56.5 % in AML, 75.3 % in the ALL and 77 , 9% in the CLL. 2. Anomaly more common in patients diagnosed with MDS has been deletion 5q, in AML t(15,17), in ALL t(9;22) and in CLL del(13)(q14 ). 3. Percentage of cases with complex karyotype in MDS was 24.4 %, AML was 31.1%, ALL was 28.5 % and CLL was 17.2 %. 4. In the group of patients younger than 60 years old the most frequent abnormalities observed were the t(15,17), t(8;21) and inv(16) for AML and t(1,19), t(4,11) and hyperdiploidy in the case of LLA (statistically significant). In the group of patients aged 60 and older the most frequent abnormalities observed were complex karyotype for AML and t(9;22) for LLA (statistically significant). 5. The 5q deletion in cases of MDS and trisomy 12 in cases of CLL are more frequent in the group of female patients (statistically significant). Trisomy 8 in cases of MDS and deletions of 11q22.3/ATM en cases of the LLC are more frequent in the group of male patients (statistically significant). 6. Patients with MDS who have been diagnosed at the HGTIP have higher proportion of altered karyotypes and more cases in the adverse cytogenetic risk group than the other centers (statistically significant). 7. Patients with CML who have been diagnosed at the HJT have more cases of variant translocation t(9,22) and patients with MDS have more complex karyotypes to the other centers (statistically significant). 8. Patients with AML who have been diagnosed in hospitals HVC/HJXXIII have more cases in the favorable cytogenetic risk group below the other centers (statistically significant).

La maduración del fruto es un proceso metabólico y fisiológico complejo, está altamente regulado e influye directamente sobre la calidad organoléptica y su valor económico. Un compuesto importante es el etileno, y en función de su patrón de síntesis los frutos pueden ser divididos en climatéricos y no climatéricos. En los frutos climatéricos ésta hormona vegetal coordina y acelera el proceso de maduración a través de la regulación a nivel transcripcional y traduccional de varios genes. Las rutas de regulación génica tanto dependientes como independientes de etileno coordinan el proceso en ambos tipos de maduración, aunque se conoce mucho menos sobre la maduración no climatérica. La existencia de variedades de melón con ambos tipos de maduración y el avanzado desarrollo de herramientas genéticas y genómicas convierten a esta especie en un buen modelo para el estudio de la maduración del fruto. El QTL eth6.3, objeto de estudio de esta tesis doctoral, fue detectado junto con eth3.5 durante la caracterización de la línea casi isogénica SC3 5 1 (portadora de los dos QTLs), obtenida a partir del cruzamiento entre “Piel de Sapo” (PS) y “Songwhan Charmi” (SC). Ambos QTLs son capaces de inducir una maduración climatérica por separado, pero cuando están juntos interaccionan produciendo un fenotipo climatérico más fuerte. En este trabajo se ha realizado el clonaje posicional de eth6.3 a través del desarrollo de una población de mapeo obtenida a partir de un individuo con alelos de PS en homocigosis para eth3.5 y segregante para eth6.3. El análisis fenotípico de 15 recombinantes en el intervalo del QTL permitió identificar el gen MELO3C016540, miembro de la familia de factores de transcripción tipo NAC en melón, como responsable de eth6.3. Para su validación se buscaron mutantes en una colección de TILLING con fondo climatérico, encontrándose dos familias con mutaciones dentro del dominio NAC que mostraron un retraso en el proceso de maduración respecto a frutos no mutados. El análisis de MELO3C016540 en un panel con 54 variedades de melón, representativas de la variabilidad existente dentro de la especie, reveló una alta conservación en los haplotipos de este gen entre variedades con el mismo tipo de maduración que sugiere un papel central en la regulación de este proceso. Finalmente, también se inició una nueva aproximación para la caracterización de MELO3C016540 mediante el desarrollo de construcciones genéticas para su silenciamiento mediante RNAi en líneas portadoras de eth6.3. De forma complementaria, en la última parte de este trabajo de tesis se ha realizado un estudio transcriptómico del fruto de la línea SC3 5 1 y PS a lo largo de la maduración, observándose una reprogramación genética global entre frutos maduros de las dos líneas. Se encontró expresión diferencial de algunos genes implicados en procesos de maduración climatérica como la biosíntesis y señalización de etileno, el reblandecimiento de la pared celular y la biosíntesis de compuestos aromáticos, así como genes pertenecientes a las familias de factores de transcripción NAC, MADS box, F box y HD zip. En conjunto, este trabajo ha permitido profundizar en el estudio de la regulación de la maduración en melón y comenzar a entender las diferencias entre frutos climatéricos y no climatéricos de esta especie. / Fruit ripening is a complex and highly regulated metabolic and physiological process that has a great influence in the organoleptic quality and economical value of the fruit. Ethylene is the main plant hormone involved in ripening regulation and, depending on its expression pattern, fruits can be classified as climacteric and non-climacteric. In climateric fruits, ethylene coordinates and accelerates ripening through gene regulation at the transcriptional and traslational level. Ethylene-dependent and independent regulation pathways coordinate both kinds of ripening, but much less is known about non-climacteric ripening. The existence of both climacteric and non-climacteric genotypes and the advances in the development of genetic and genomic tools make melon a suitable model for fruit ripening studies. The aim of this doctoral thesis in the study of QTL eth6.3, which was detected along with eth3.5 during the characterization of near isogenic line SC3-5-1 (that harbors both QTLs), obtained from a cross between “Piel de Sapo” (PS) and “Songwhan Charmi” (SC). Both QTLs can induce climacteric ripening on their own, but together they interact producing a stronger climacteric phenotype. This work presents the positional cloning of eth6.3 through the development of a mapping population obtained from an individual with PS homozygous alleles in eth3.5 and segregant in eth6.3. Phenotypic analysis of 15 recombinant lines in the QTL interval allowed the identification of MELO3C016540, a NAC domain transcription factor, as responsible of eth6.3. For validation, a TILLING collection in a climacteric background was screened for mutants. Two families with mutations in the well-conserved NAC-domain showed a delay in ripening when compared with wild-type individuals. The analysis of MELO3C016540 in a collection of 54 melon varieties representing the existing variability within the species revealed that the haplotypes within this gene are highly conserved among varieties that show the same kind of ripening, suggesting a central role in its regulation. Finally, a new approach for the characterization of MELO3C016540 was started by the development of genetic constructions for gene silencing mediated by RNAi in lines harboring eth6.3. Complementarily, a fruit transcriptome study of lines SC3-5-1 and PS during ripening was performed, revealing a global genetic reprogramming between ripe fruits from both lines. Genes involved in climacteric ripening processes like ethylene biosynthesis and signaling, fruit softening, aroma biosynthesis, and transcription factor families NAC, MADS-box, F-box and HD-zip were differentially expressed. In conclusion, this work has contributed to increase the knowledge of melon ripening regulation and to start uncovering the differences between climacteric and non-climacteric fruit ripening.

M. pneumoniae is one of the smallest self-replicating organisms. Many organism wide studies have been performed on M. pneumoniae and provide a wealth of information on the bacteria. However, the genetic tools to manipulate and engineer this microorganism are currently insufficient. Therefore one focus of this project is to extend the genetic toolbox for M. pneumoniae. In parallel, we developed first a proof of concepts study for the use of M. pneumoniae as therapeutical vector. For this purpose the secretome of M. pneumoniae has been investigated to define all secretion signals in this bacterium. This knowledge was used to modify M. pneumoniae to secrete three proteins with therapeutical applications. Further we could show for two of the proteins that they are active after secretion and therefore that M. pneumoniae can be used to engineer therapeutic vectors for treating lungs diseases. / M. pneumoniae es uno de los microrganismos auto-replicativos más pequeños descritos hasta el momento. En nuestro grupo se ha empleado como modelo en Biología de Sistemas y se ha caracterizado a diferentes niveles (genoma, transcriptoma, proteoma...etc). Sin embargo, las herramientas genéticas para manipular y emplear este microorganismo como modelo en Bilogía Sintética, son insuficientes. Por lo tanto, uno de los objetivos de este proyecto es ampliar el repertorio de herramientas moleculares de M. pneumoniae. En paralelo, hemos desarrollado por primera vez una “prueba de concepto” para el uso de M. pneumoniae con finalidades terapéuticas. Con este propósito, primero hemos determinado el secretoma de M. pneumoniae que ha permitido identificar todas las señales de secreción de esta bacteria. Posteriormente, se ha aplicado este conocimiento para obtener cepas de M. pneumoniae capaces de secretar tres proteínas con aplicaciones terapéuticas. Hemos demostrado que dos de las tres proteínas son activas tras la secreción, abriendo nuevas perspectivas en el uso de M. pneumoniae para el tratamiento de enfermedades pulmonares.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / La via de Calcineurina (Cn)- Factor Nuclear de Cèl·lules T Activades (NFAT) ha estat descrita clàssicament com a via de senyalització essencial en el funcionament de les cèl·lules T del sistema immunològic i amb els NFATc com a factor de transcripció clau en la resposta immunitària contra els òrgans trasplantats. Actualment s'usen fàrmacs com la Ciclosporina A i el FK506 per a inhibir la calcineurina i la conseqüent activació de NFAT en teràpies immunosupressores per al tractament del rebuig d'òrgans. Aquests fàrmacs, però, inhibeixen la totalitat d'activitat fosfatasa de la calcineurina de manera que no només la via Cn-NFAT en resulta afectada. Com a conseqüència, el tractament amb aquests fàrmacs porta associat tota una llista d'efectes secundaris indesitjats. La proteïna RCAN3 sencera i/o el pèptid RCAN3178-210 (pèptid derivat de la proteïna RCAN3, aminoàcids 178-210) inhibeixen específicament la via de Cn-NFATc mitjançant competició de RCAN3 amb NFATc per unir-se a calcineurina mitjançant un motiu aminoacídic similar en les dues proteïnes anomenat PxIxIT. RCAN3, per tant, pot ser un regulador específic i, el més important, endogen de la via Cn-NFAT. Donat que els factors de transcripció NFATc estan implicats en varis processos del desenvolupament tumoral (pàncrees, pell, mama), l'objectiu principal d’aquest treball és determinar l’efecte biològic i funcional de la sobreproducció de RCAN3 i del pèptid R3178-210 que conté el motiu PxIxIT com a inhibidor de la via de Cn-NFATc en la progressió tumoral i avaluar la possibilitat d’usar aquesta proteïna o pèptid, o derivats o mimètics d’aquests, en el tractament de la progressió tumoral i metàstasi en el càncer de mama humà triple negatiu (TNBC) usant ratolins com a models ortotòpics d'aquest tipus de càncer. La hipòtesi d'aquest treball és que RCAN3 i el pèptid CIC inhibeixen la progressió tumoral mitjançant la inhibició de la via de Cn-NFATc i serien per se possibles nous agents terapèutics antitumorals. Els resultats indiquen que la sobreproducció de RCAN3, així com el pèptid R3178-210 inhibeixen la translocació dels NFATc a nucli afectant així la transcripció de gens dependents de NFAT (com el gen proangiogènic de la Ciclooxigenasa 2 (cox-2) i el gen proinflamatori de la Interleukina 8 (Il-8)) i el nivell de producció de les corresponents proteïnes (COX-2 i IL-8). En models ortotòpics TNBC, s'ha observat una reducció significativa en el volum dels tumors que sobrexpressen RCAN3 possiblement com a conseqüència d'una alteració en l'angiogènesi tumoral. A més, aquests tumors presenten un increment en l'apoptosi cel·lular i una disminució en el número de cèl·lules en proliferació en comparació amb els tumors control. Els tumors RCAN3 també presenten una reducció en el número de cèl·lules immunitàries infiltrades en el tumor. Aquest resultat es creu que podria ser degut, entre d'altres factors, a l'efecte indirecte de la sobrexpressió de RCAN3 sobre il-8. El TNBC és un càncer que fàcilment crea metàstasis a partir d'una transició epitelio-mesenquimal (TEM) i per això s'han analitzat marcadors que s'associen a la formació de metàstasis com S100A4 i marcadors TEM com la e-cadherina i la vimentina. Els resultats indiquen que els tumors RCAN3, tot i no presentar canvis en les proteïnes epitelio-mesenquimals escollides, presenten una inhibició del marcador premetastàtic S100A4. Respecte als tumors R3178-210, s'han obtingut els mateixos resultats, tot i que amb significances una mica més modestes. Aquest fet reforça el paper clau dels aminoàcids 178-210 de RCAN3 en a la regulació endògena de la via Cn-NFAT i la seva implicació en càncer TBNC. Finalment s'ha realitzat una primera aproximació experimental per utilitzar el pèptid R3178-210 com a eina terapèutica i els resultats preliminars han sigut que, malgrat no observar reducció en el volum tumoral dels animals tractats amb el pèptid, sí que es repeteix l'efecte inhibitori sobre l'angiogènesi. / The members of the human regulators of calcineurin (RCAN) protein family are endogenous regulators of the calcineurin (CN)-cytosolic nuclear factor of activated T-cells (NFATc) pathway activation. This function is due to the presence of a highly conserved aminoacidic motif in RCAN3 protein, which has been shown to compete with NFATc for the binding to CN. As a consequence, RCAN3 is able to inhibit NFATc activation by CN. Very recently, emerging roles for NFATc proteins in transformation, tumour angiogenesis and metastasis have been described in different cancer cell types. In this work, we report that the overexpression of RCAN3 dramatically inhibits tumour growth and tumour angiogenesis in an orthotopic human Triple Negative Breast Cancer mouse model. We also observed a decrease in proliferative cells and an increase in apoptotic cells compared to control tumours. We suggest that RCAN3 exerts these effects in a CN-dependent manner, as mutation of the aminoacidic motif in RCAN3 abolishes the tumour suppressor effect. Moreover, the expression of the R3178-210 peptide, spanning the motif of RCAN3, is able to reproduce all the antitumor effects of RCAN3 full-length protein. Also we show that RCAN3 and the R3178-210 peptide inhibit the CN-NFATc signalling pathway and the induction of the NFATc-dependent gene cyclooxygenase-2 and IL-8. Our work suggests that the R3178-210 peptide possess potent tumour suppressor properties and therefore constitutes a novel lead for the development of potent and specific antitumoral agents. With these results, we've done a first approach using the peptide R3178-210 as a treatment against this disease. We've treated the tumours with the peptide and we've seen that although no changes in tumour volume were observed, the effect on tumour angiogenesis repeated significantly. We propose the targeting of the CN-NFATc pathway in the tumour cells could constitute an effective way to hamper tumour progression by impairing the paracrine network among tumour, endothelial and immune tumour infiltrated cells.