Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-04T16:13:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2270833 bytes, checksum: 96aab99f6b70bd80954147ae97d70a12 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-04T16:13:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2270833 bytes, checksum: 96aab99f6b70bd80954147ae97d70a12 (MD5) Previous issue date: 2016-09-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo do presente estudo foi determinar o conjunto de fatores que interferem nos estágios iniciais da embriogênese somática de Eucalyptus, tendo por base os seguintes objetivos específicos: 1) verificar o efeito de tipos de explantes, tipos e concentrações de auxinas na indução; tipos de meio de cultura e concentrações de auxina na proliferação de embriões somáticos em explantes juvenis de Eucalyptus grandis x E. urophylla; 2) verificar o efeito de concentrações e fontes de cálcio; concentrações e tempo de efeito de citocinina e poliamina, na indução e desenvolvimento de embriões somáticos em explantes juvenis de Eucalyptus grandis x E . urophylla; 3) verificar o efeito do pulso de auxina em diferentes estágios de desenvolvimento de embriões somáticos em explantes juvenis de Eucalyptus grandis x E . urophylla; 4) estimar a correlação genética entre as características de indução de embriões somáticos, além de estudar o controle genético relacionado às mesmas a fim de averiguar sua utilidade na seleção de genótipos com competência embriogênica de clones híbridos de Eucalyptus. A indução de pró-embriões somáticos de Eucalyptus grandis x E. urophylla pode ser obtida utilizando sementes ou cotilédones como fonte de explantes, e dicamba e picloram como reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura. Para a obtenção de médias mais altas no porcentual de indução de pró-embriões somáticos deve-se utilizar picloram e cotilédones como fontes de explantes. Para a proliferação de pró-embriões somáticos secundários, pode-se utilizar meio de cultura líquido adicionado de picloram. O meio de cultura JADS proporcionou maior calogênese em explantes cotiledonares de Eucalyptus grandis x E. urophylla, quando comparado ao meio de cultura MS. A adição de 28,36 μM de putrescina ao meio de cultura proporcionou maior porcentual de indução de embriogênese somática nesses mesmos explantes. O número de pró-embriões somáticos formados por explante foi superior quando se acrescentou BAP e principalmente putrescina ao meio de cultura se comparado com o meio contendo somente picloram. Acréscimos na concentração de cálcio nos meios MS e JADS não proporcionam melhorias no que se refere à indução de embriogênese somática. Tratamentos com pulso da auxina picloram (207,02 μM) podem ser utilizados como fonte de estresse inicial para aquisição da competência embriogênica em explantes cotiledonares em Eucalyptus grandis x E. urophylla. A indução média de calos embriogênicos foi superior no intervalo de dois dias de pulso de auxina, em relação aos outros dois intervalos testados tanto aos 30 dias, como aos 37 e 44 dias de avaliação. A oxidação dos explantes, quando colocados em meio de indução, pode ser considerada um indício de formação de calos embriogênicos. A presença de pectinas em regiões periféricas de pró-embriões somáticos pode ser vista como marcador de embriogênese somática em explantes cotiledoneres de Eucalyptus gradis x E. urophylla. A característica porcentual de pró-embriões somáticos apresenta controle genético. A correlação genética alta e positiva entre calogênese em média intensidade e indução de pró-embriões somáticos indica que a seleção para a primeira característica resulta em consistentes respostas na segunda. Os híbridos triplos utilizados no presente estudo apresentaram maiores valores genéticos para porcentual de indução de pró- embriões somáticos, quando comparados aos demais híbridos estudados, indicando maior facilidade na indução de embriogênese somática para essa espécie. / The objective of this study was to determine the set of factors that interfere in the early stages of somatic embryogenesis of Eucalyptus, and by the following specific objectives based on: 1) verify the effect of explants types, types and concentrations of auxin in the induction; types of culture media and auxin concentrations on the proliferation of somatic embryos in juvenile explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla; 2) verify the effect of concentrations and sources of calcium; and cytokinin and polyamine concentrations and effect of time, in the induction and development of somatic embryos in juvenile explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla; 3) verify the effect of auxin pulse at different stages of development of embryos in juvenile explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla; 4) estimate the genetic correlation between the somatic embryo induction characteristics, in addition to studying the genetic control related to them to ascertain its usefulness in the selection of genotypes with embryogenic competence of hybrid clones of Eucalyptus. The induction of somatic pro-embryos of Eucalyptus grandis x E. urophylla. can be obtained using cotyledon or seed as a source of explants, dicamba and picloram as growth regulators added to the culture medium. However, to obtain higher means the percentage of somatic pro-embryos induction should be used picloram and cotyledon as source of explants. For the proliferation of secondary somatic pro-embryos may be used a liquid culture medium added picloram. The JADS culture medium showed higher callus formation in cotyledon explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla when compared to MS medium. Addition of 28.36 μM of putrescine to the culture medium provided a higher percentage of somatic embryogenesis induction in these same explants. The number of somatic pro-embryos formed per explant was higher when added BAP and mainly putrescine to the culture medium compared to medium containing only picloram. Increases in calcium concentration in the MS and JADS media does not provide improvements with regard to the induction of somatic embryogenesis. Treatments with pulse auxin picloram (207.02 μM) can be used as a source of initial stress for the acquisition of embryogenic competence in cotyledons and Eucalyptus grandis x E. urophylla. The average of embryogenic callus induction was better in the interval of two days auxin pulse of the two other ranges tested both after 30 days and after 37 and 44 days of assessment. Oxidation of the explants, when placed on induction medium, can be considered a sign of formation of embryogenic callus. The presence of pectin in peripheral regions of somatic pro-embryos can be seen as a marker of somatic embryogenesis in cotyledon explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla. The characteristic percentage of somatic pro-embryos has genetic control. High and positive genetic correlation between callus formation in average intensity and somatic pro-embryos induction indicates that selection for the first feature should lead to consistent responses in the second. Tree-cross hybrids used in this study showed higher genetic values of somatic pro-embryos induction when compared to other hybrids studied, indicating greater ease in inducing somatic embryogenesis in this species.

Orientador: Ricardo Bittencourt. / Dissertação (Mestrado em Engenharia Florestal) - Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal, Centro de Ciências Tecnológicas, Universidade Regional de Blumenau, Blumenau.

O trabalho teve como objetivo otimizar a metodologia de transformação de plantas de Eucalyptus grandis; uma importante espécie florestal amplamente cultivada no Brasil. Foram estudadas a transformação por agrobiobalística de explantes com acúmulo de gemas axilares e do SAAT ('sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation'). Ambas as técnicas causam microferimentos nos explantes aumentando a penetração da Agrobacterium nos tecidos vegetais. Na agrobiobalística o explante é submetido ao bombardeamento com micropartículas seguida por inoculação com a bactéria; enquanto que no SAAT o explante é submetido à sonicação por breves períodos de tempo na presença da bactéria. Os experimentos de transformação foram avaliados pela analise da expressão transitória do gene repórter uidA. Os parâmetros estudados na transformação por agrobiobalística foram: pressão de disparo ( pressão do gás hélio), distância de vôo das micropartículas, estabilidade da expressão do gene uidA e temperatura de co-cultivo. As freqüências mais elevadas da expressão da ß-glucuronidase foram observadas utilizando 1350 PSI de gás hélio, 9,5 cm de distância de vôo dos microprojéteis e temperatura de 26ºC durante o co-cultivo. Para otimizar a transformação de explantes com acúmulo de gemas axilares foi realizado um estudo histológico, o qual permitiu constatar que as áreas meristemáticas estão localizadas na superfície do explante. O meristema é formado pela rediferenciação de células da epiderme e das primeiras camadas do parênquima cortical caracterizando sua origem exógena. A localização histológica do produto da expressão do gene repórter uidA mostrou que esta expressão ocorre apenas em células já diferenciadas, não sendo encontrada durante os tratamentos com células meristemáticas. Para realizar os ensaios com SAAT foi selecionado previamente um clone com características favoráveis à transformação: alta taxa de regeneração, susceptibilidade a agentes seletivos e à transformação por Agrobacterium. A maior taxa de plantas que apresentaram atividade da ß-glucuronidase foram observadas utilizando-se 60 segundos de sonicação; tempos superiores a este causaram um comprometimento da regeneração do explante. A sonicação adicional, após a sonicação preliminar do explante, juntamente com a bactéria, melhora a eficiência do processo de transformação. Os resultados demonstram que o uso de SAAT é viável na transformação de eucalipto com Agrobacterium. / The research project aimed the establishment of a method for genetic transformation of Eucalyptus grandis; an important and widely planted forestry tree in Brazil. Two techniques of transformation were tested: agrobiolistic of explants with accumulation of meristematic cells and SAAT ('sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation'). Both systems of transformation aim to produce micro wounds in the explants in order to increase the Agrobacterium penetration in the tissues. In the case of agrolistica the explant was previously submitted to micro projectile bombardment, followed by bacteria inoculation. On the other hand in the SAAT technique the explante is submitted to short periods (few seconds) of sonication together with the bacteria. Transformation was evaluated by measuring the expression of the reporter gene uidA which codes the ß-glucuronidase enzyme. Several parameters were tested for agrobiolistic such as, gas pressure (helium), flight distance of micro projectiles, gene expression of the uidA, co-cultivation temperature. The highest values of ß-glucuronidase were observed for 1350 PSI, 9.5 cm from target and 26O C for co-cultivation. A histological analyze was carried out to check it the meristematic tissues were being transformed. The results showed that the meristematic tissues were localized in the surface of the explante. The meristem is formed by the dedifferentiation of epidermal cells and the first layers of the cortical parenchyma indicating its exogenous origin. The histological location of the reporter gene uidA showed that the expression occurs only in cells already differentiated, and not in meristematic cells. For SAAT experiments a clone was previously selected for favorable characteristic of transformation: high rate of regeneration, susceptibility of selective agents and to Agrobacterium transformation. The highest rate of ß-glucuronidase activity were observed for 60 s of sonication; higher sonication time reduced the efficiency of regeneration. Additional sonication, following a preliminary sonication of explante , in the presence of the bacteria, improved the efficiency of transformation. The results provided evidence the SAAT is a viable technique for Eucalyptus transformation via Agrobacterium.

O trabalho teve como objetivo otimizar a metodologia de transformação de plantas de Eucalyptus grandis; uma importante espécie florestal amplamente cultivada no Brasil. Foram estudadas a transformação por agrobiobalística de explantes com acúmulo de gemas axilares e do SAAT ('sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation'). Ambas as técnicas causam microferimentos nos explantes aumentando a penetração da Agrobacterium nos tecidos vegetais. Na agrobiobalística o explante é submetido ao bombardeamento com micropartículas seguida por inoculação com a bactéria; enquanto que no SAAT o explante é submetido à sonicação por breves períodos de tempo na presença da bactéria. Os experimentos de transformação foram avaliados pela analise da expressão transitória do gene repórter uidA. Os parâmetros estudados na transformação por agrobiobalística foram: pressão de disparo ( pressão do gás hélio), distância de vôo das micropartículas, estabilidade da expressão do gene uidA e temperatura de co-cultivo. As freqüências mais elevadas da expressão da ß-glucuronidase foram observadas utilizando 1350 PSI de gás hélio, 9,5 cm de distância de vôo dos microprojéteis e temperatura de 26ºC durante o co-cultivo. Para otimizar a transformação de explantes com acúmulo de gemas axilares foi realizado um estudo histológico, o qual permitiu constatar que as áreas meristemáticas estão localizadas na superfície do explante. O meristema é formado pela rediferenciação de células da epiderme e das primeiras camadas do parênquima cortical caracterizando sua origem exógena. A localização histológica do produto da expressão do gene repórter uidA mostrou que esta expressão ocorre apenas em células já diferenciadas, não sendo encontrada durante os tratamentos com células meristemáticas. Para realizar os ensaios com SAAT foi selecionado previamente um clone com características favoráveis à transformação: alta taxa de regeneração, susceptibilidade a agentes seletivos e à transformação por Agrobacterium. A maior taxa de plantas que apresentaram atividade da ß-glucuronidase foram observadas utilizando-se 60 segundos de sonicação; tempos superiores a este causaram um comprometimento da regeneração do explante. A sonicação adicional, após a sonicação preliminar do explante, juntamente com a bactéria, melhora a eficiência do processo de transformação. Os resultados demonstram que o uso de SAAT é viável na transformação de eucalipto com Agrobacterium. / The research project aimed the establishment of a method for genetic transformation of Eucalyptus grandis; an important and widely planted forestry tree in Brazil. Two techniques of transformation were tested: agrobiolistic of explants with accumulation of meristematic cells and SAAT ('sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation'). Both systems of transformation aim to produce micro wounds in the explants in order to increase the Agrobacterium penetration in the tissues. In the case of agrolistica the explant was previously submitted to micro projectile bombardment, followed by bacteria inoculation. On the other hand in the SAAT technique the explante is submitted to short periods (few seconds) of sonication together with the bacteria. Transformation was evaluated by measuring the expression of the reporter gene uidA which codes the ß-glucuronidase enzyme. Several parameters were tested for agrobiolistic such as, gas pressure (helium), flight distance of micro projectiles, gene expression of the uidA, co-cultivation temperature. The highest values of ß-glucuronidase were observed for 1350 PSI, 9.5 cm from target and 26O C for co-cultivation. A histological analyze was carried out to check it the meristematic tissues were being transformed. The results showed that the meristematic tissues were localized in the surface of the explante. The meristem is formed by the dedifferentiation of epidermal cells and the first layers of the cortical parenchyma indicating its exogenous origin. The histological location of the reporter gene uidA showed that the expression occurs only in cells already differentiated, and not in meristematic cells. For SAAT experiments a clone was previously selected for favorable characteristic of transformation: high rate of regeneration, susceptibility of selective agents and to Agrobacterium transformation. The highest rate of ß-glucuronidase activity were observed for 60 s of sonication; higher sonication time reduced the efficiency of regeneration. Additional sonication, following a preliminary sonication of explante , in the presence of the bacteria, improved the efficiency of transformation. The results provided evidence the SAAT is a viable technique for Eucalyptus transformation via Agrobacterium.