Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-04-17T16:24:41Z No. of bitstreams: 1 2016_AndréRodolfodeOliveiraRibeiro.pdf: 6580504 bytes, checksum: 0c7709089799b4ed79474e6fb445f5ee (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-17T20:15:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndréRodolfodeOliveiraRibeiro.pdf: 6580504 bytes, checksum: 0c7709089799b4ed79474e6fb445f5ee (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T20:15:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndréRodolfodeOliveiraRibeiro.pdf: 6580504 bytes, checksum: 0c7709089799b4ed79474e6fb445f5ee (MD5) / Em Poaceae, a subfamília Panicoideae possui cerca de 3500 espécies e é a mais diversa nas regiões tropicais. Os números cromossômicos básicos x = 5, x = 9 e x = 10 e genomas pequenos (2C/2n = 0,1 pg) predominam entre as espécies de Panicoideae. Os diploides têm meiose estável e alta viabilidade polínica, enquanto os poliploides apresentam viabilididade polínica variável e diretamente relacionada ao índice meiótico. Mesosetum Steud. possui 25 espécies e é o único gênero neotropical de Panicoideae com registro do número cromossômico 2n = 8 (x = 4), cuja origem a partir de x = 10, também encontrado no gênero, ainda não foi elucidada. O objetivo da presente tese de doutorado foi obter dados sobre número e morfologia cromossômica, tamanho do genoma e fertilidade do pólen e relacioná-los à árvore filogenética molecular de Mesosetum. Os dados sobre número cromossômico e tamanho do genoma foram obtidos em 20 acessos e 13 espécies de Paspaleae, sendo uma espécie de Arthropogon Nees, 10 espécies de Mesosetum, uma espécie de Spheneria Kuhlm. e uma espécie de Tatianyx Zuloaga & Soderstr. O número cromossômico 2n = 26 (x = 13) observado em M. exaratum (Trin.) Chase é aqui registrado pela primeira vez na subfamília Panicoideae. Em Mesosetum, é possível reconhecer pelo menos três linhagens relacionadas a distintos números cromossômicos. O clado com número cromossômico básico x = 10 é provavelmente o mais basal em Mesosetum e, a partir do qual, se derivaram o clado com x = 4 e a linhagem monoespecífica com x = 13. O clado com x = 4 provavelmente se derivou por fusão ou rearranjos cromossômicos. Os cromossomos das espécies com 2n = 8, 2n = 16 e 2n = 24 mostraram sinais de DNAr 5S e 45S que confirmaram a ocorrência de poliploidia no clado x = 4. Os dados de citometria de fluxo sugerem que o clado com x = 10 manteve genoma pequeno (2C/2n = 0,04 a 0,1 pg) com cromossomos menores (1,8-4,0 μm). No clado com x = 4 e na linhagem monoespecífica com x = 13 provavelmente ocorreu uma expansão do tamanho do genoma após os eventos de disploidia descendente. Foi verificada uma redução do genoma dos poliploides naturais, sugerindo que já houve algum grau de diploidização após o evento de poliploidização. Esta diploidização também suporta a estabilidade meiótica e alta fertilidade do pólen observadas na maioria dos poliploides de Mesosetum. / In Poaceae, the subfamily Panicoideae contains approximately 3500 species and is the most diverse grass subfamily of tropical regions. The basic chromosome numbers of x = 5, x = 9, x = 10, and small genomes (2C/2n = 0.1 pg) are predominant among Panicoideae species. Diploids have stable meiosis and high pollen viability, while polyploids have variable pollen viability, which is directly related to the meiotic index. Mesosetum Steud. is composed of 25 species and is the only neotropical genus of Panicoideae with a registered chromosome number of 2n = 8 (x = 4). The origin of x = 4 basic chromosome number from x = 10, which also found within the genus, is still unknown. The aim of the present doctoral thesis was to obtain data about chromosome number and morphology, genome size, pollen fertility, and to relate to the molecular phylogenetic tree of Mesosetum. The data concerning chromosome number and genome size were obtained from 20 accessions and 13 species, including one species of Arthropogon Nees, 10 species of Mesosetum, one species of Spheneria Kuhlm., and one species of Tatianyx Zuloaga & Soderstr. The chromosome number of 2n = 26 (x = 13), found in M. exaratum (Trin.) Chase, is registered here for the first time for the subfamily Panicoideae. In Mesosetum, at least three lineages can be possible related through distinct basic chromosome numbers. The clade with the basic chromosome number of x = 10 is probably the most basal in Mesosetum, from which x = 4 clade and x = 13 monospecific lineage were derived. The x = 4 clade was probably derived via fusion or chromosomal rearrangements. The chromosomes of the species with 2n = 8, 16, and 24 showed signals of 5S and 45S rDNA that confirmed the occurrence of polyploidy in the x = 4 clade. The flow cytometry data suggest that a small genome size (2C/2n = 0.04 a 0.1 pg) and the smallest chromosomes of the genus (1.8-4.0 μm) were conserved in the x = 10 clade. In the x = 4 clade and x = 13 lineage, a genome size expansion probably occurred after events of descending disploidy. A decrease in the genome size was verified in natural polyploids, suggesting that some level of diploidization occurred after the polyploidization event. This diploidization also supports the meiotic stability and high pollen fertility observed in the majority of Mesosetum polyploids.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-19T13:46:22Z No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-05-25T00:23:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-25T00:23:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / O vírus Brugmansia suaveolens mottle virus (BsMoV) foi isolado da solanácea Brugmansia suaveolens (conhecida como trombeteira, saia-branca) da coleção de plantas medicinais do Instituto Agronômico, Campinas-SP, Brasil, sendo o isolado nomeado Bs-Campinas. Um trabalho anterior mostrou que o isolado Bs-Campinas foi transmitido por afídeos, induziu sintomas visíveis em algumas solanáceas e em duas espécies de Chenopodium sob condições experimentais, apresentando partículas e inclusões típicas de potyvírus em folhas sintomáticas, quando observadas por microscopia eletrônica de transmissão. Apenas parte do genoma do vírus era conhecida, uma região compreendendo a extremidade 3‟, o que o distinguiu suficientemente dos outros vírus para ser classificado como uma espécie nova de potyvírus. O vírus apresenta características distintas de outros potyvírus conhecidos, induzindo uma alta severidade de sintomas em diversas plantas susceptíveis, além da capacidade de infectar o tomateiro, uma cultura de alta importância econômica e social no Brasil. Essas características o tornam um excelente alvo para estudo dos genes relacionados à patogenicidade e para o desenvolvimento futuro de vetores virais. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular do isolado Bs-Campinas através da determinação de sua sequência genômica completa e determinar o seu relacionamento filogenético com os diferentes potyvírus já relatados no mundo. Para tanto, procedeu-se o emprego de várias técnicas para o completo resgate do genoma viral e posterior determinação de sua sequência. O RNA total foi extraído e o cDNA sintetizado foi obtido pela técnica de 3‟ RACE usando primers universais para potyvírus, resultando na amplificação de um fragmento de 8,3kb. A tentativa de clonagem deste fragmento, contudo, resultou em clones que apresentavam uma deleção interna neste fragmento. Dessa forma, o segundo fragmento obtido resultou da amplificação por RT-PCR utilizando-se primers específicos desenhados com base nas sequências das extremidades do fragmento de 8,3kb com o intuito de resgatar a região interna do genoma gerando um fragmento de aproximadamente 4,7kb. Primers específicos foram também desenhados baseados na sequência da extremidade 5‟ do clone de 8kb obtido e a estratégia 5‟ RACE foi usada para amplificar e clonar a extremidade 5‟ do genoma do vírus, um fragmento de 1,8kb. As amplificações por PCR resultaram no resgate de três fragmentos de cDNA, os quais totalizam a sequência completa do genoma do BsMoV. O RNA genômico consistiu de 9870 nt sem a cauda de poli-A, codificando uma poliproteína típica dos potyvírus de 3090 aa. As análises da sequência de aminoácidos possibilitaram a dedução dos sítios de clivagem, bem como, a identificação das sequências e motivos conservados dentro da sequência de cada proteína, tendo o isolado Bs-Campinas exibido perfil típico de potyvírus. As análises filogenéticas, assim como, comparações com outras espécies de Potyvirus do banco de dados online revelaram que esta sequência tem uma identidade nucleotídica de 63,7% com Pepper mottle virus (PepMoV), a qual foi a sequência de potyvírus de maior identidade e, portanto, o mais estreitamente relacionado. Uma vez que este valor de identidade é inferior ao limiar (76% de identidade nucleotídica) atualmente usado para discriminar espécies de Potyvirus, foi confirmado que Brugmansia suaveolens mottle virus representa uma nova espécie dentro do gênero Potyvirus. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brugmansia suaveolens mottle virus (BsMoV) was isolated from a Brugmansia suaveolens plant (known as "angel trumpet") in the collection of medicinal plants of the Instituto Agronômico, Campinas-SP, Brazil, being the isolate named Bs-Campinas. A previous study showed that the isolate Bs- Campinas was transmitted by aphids and induced visible symptom on some Solanaceous plants and two Chenopodium species under the experimental conditions, showing typical potyvirus particles and inclusions in symptomatic leaves, when observed by transmission electron microscopy. Only part of the virus genome was known, a region comprising the 3' terminal region of the genome, which distinguished it sufficiently from other viruses to be classified as a new potvvirus species. The virus showed characteristics that were distinct from other known potyviruses, such as the high symptom severity in many plants and the ability to infect tomato plants, a crop of high economic and social importance in Brazil. These findings showed that it can be an excellent target for the study of genes related to pathogenicity and for the future development of viral vectors. Therefore, the objective of this study was the molecular characterization of the isolate Bs-Campinas through the determination of its complete genomic sequence and its phylogenetic analysis, when compared with different potyviruses previously reported in the world. For this purpose, some techniques were attempted to enable the rescue of the viral genome and subsequent determination of its sequence. Total RNA was extracted and cDNA synthesis was done by 3 'RACE using universal primers for potyviruses, resulting in the amplification of a fragment of ca. 8,3 kb. However, the cloning of this fragment resulted in clones that presented an internal deletion in this fragment. Therefore, a second fragment using specific primers designed based on the sequence ends of the deleted clones, was amplified by PCR and cloned in order to rescue inner region of the genome by generating a fragment of approximately 4.7 kb. Specific primers were also designed based on the 5‟ end region of the 8,3 kb clone to enable cloning of the 5‟ terminal region of the genome by 5' RACE, a fragment of 1.8 kb. PCR amplifications resulted in three cDNA fragments, comprising the complete genome of BsMoV. The RNA genome consisted of 9870 nt without a poly-A tail, encoding a putative typical potyviral polyprotein of 3090 aa. Analysis of the amino acid sequence allowed the deduction of the cleavage sites, as well as the identification of conserved sequences and motifs within the sequence of each protein, in which the Bs-Campinas isolate displayed typical potyvirus genome strategy. Phylogenetic analysis, as well as comparisons with other species of the Potyvirus genus obtained on online databases revealed that this BsMoV sequence shared 63.7% nucleotide sequence with Pepper mottle virus (PepMoV), which was the best matched potyvirus sequence and, thus the most closely related species. Since this identity value is below the threshold of 76% nt identity presently used to discriminate Potyvirus species, it was confirmed that Brugmansia suaveolens mottle virus represents a new Potyvirus species.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2016-04-27T13:05:16Z No. of bitstreams: 1 2016_MarianaSennaQuirino.pdf: 4546958 bytes, checksum: 7d7bc37fcf79d63d378011f3efea44d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-04-27T14:34:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarianaSennaQuirino.pdf: 4546958 bytes, checksum: 7d7bc37fcf79d63d378011f3efea44d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T14:34:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarianaSennaQuirino.pdf: 4546958 bytes, checksum: 7d7bc37fcf79d63d378011f3efea44d6 (MD5) / No capítulo I avaliamos a presença e análise filogenética de vírus de melancia no estado do Tocantins. Folhas com sintomas de infecção viral foram coletadas em 2013 eparticulas virais foram parcialmente purificadas e o RNA total dessas partículas foi purificado e sequenciado usando a plataforma Ilumina HiSeq 2000. As sequências obtidas foram analisadas com o programa CLC Genomics Workbench, e fases abertas de leitura (ORFs) foram procuradas usando o programa Blast x. Os 4.912 contigs que obtiveram hits com vírus de plantas foram analisados e comparados com o auxílio do programa Geneious. A presença dos vírus foi confirmada por diferentes métodos. Foram identificados genomas completos de vírus pertencentes às famílias Potyviridae,BunyaviridaeePartitiviridae. No capítulo II foi realizado estudo biotecnológico na tentativa de construção de um vetor de expressão de proteínas heterólogas com o genoma do baculovírusAnticarsiagemmatalismultilenucleopolyhedrovirus(AgMNPV), baseado no sistema de transposição sítio-específica comercialmente disponível para o baculovírus Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV). Foram utilizadas três metodologias: i) Recombinação homóloga em células de inseto; ii) Recombinação homóloga em células de E. coli (cepa BJ5183); iii) Digestão e ligação em sítio único Bsu36I e FseI no DNA genômico de AgMNPV. Foi construído um vetor de transferência p2100-KLM, para recombinação homóloga e/ou ligação em sítio único do baculovírus, porém, as tentativas para construção do vetor de expressão não foram efetivas. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In chapter I we analized the presence and phylogeny of viruses found in watermelon in Tocatinsstate. Watermelon leaves with viral symptoms were collected in 2013, and viral particles were partialy purified and total RNA was extracted and sequenced using the Illumina HiSeq 2000 platform. The sequences obtained were analyzed using the CLC Genomics Workbench program, and used for ORF search with theBlastx program. The 4.912 contigs who got hits with plant viruses were analyzed and compared with the help of Geneious program. The presence of viruses in leaves with viral symptoms was confirmed using different methods. Possible complete viral genomes were identified and were related to viruses belonging to the families Potyviridae,Bunyaviridae, Partitiviridae. In chapter II we tried to construct a vector for expression of heterologous proteins using the baculovirusAnticarsiagemmatalismultiple nucleopolyhedrovirus(AgMNPV). This vector was based on site specific transposition system commercially available for the baculovirusAutographacalifornica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Three methodologies were used: i) Homologous recombination in insect cells; ii) Homologous recombination in E. coli cells (strain BJ5183); iii) Direct ligation in Bsu36I and FseI unique restriction sites in the genomic DNA of AgMNPV. One transfer vector (p2100-KLM) was constructed for homologous recombination and / or ligation in the baculovirus single site. However, all the different strategies were not effective.