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京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22348号 / 医博第4589号 / 新制||医||1042(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 小柳 義夫, 教授 中川 一路, 教授 伊藤 貴浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第22810号 / 生博第444号 / 新制||生||59(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 野田 岳志, 教授 朝長 啓造, 教授 杉田 昌彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

La reconnaissance spécifique du génome viral et son encapsidation est une étape cruciale pour l’assemblage de particules virales. Chez SPP1, comme chez d’autres bactériophages à queue, le moteur moléculaire qui encapside le génome viral est composé de la terminase, une enzyme hétéro-oligomérique qui possède une activité ATPasique et nucléasique, et de la protéine portale, un oligomère cyclique par lequel l’ADN viral est transloqué. Dans un grand nombre de ses virus, l’encapsidation de l’ADN est initiée par la reconnaissance et le clivage d’une séquence spécifique nommée « pac ». C’est un évènement qui se produit une seule fois au début d’une série de cycles d’encapsidation processive à partir d’un concatémère issu de la réplication du génome du phage. La région pac de SPP1 contient deux séquences (pacL et pacR) où TerS (gp1) se lie entourant la région (pacC) où TerL (gp2) coupe l’ADN de SPP1.Ici, nous montrons qu’une région de la séquence pacL et qu’un motif polyadénine de pacR agissent ensemble pour promouvoir le clivage en pacC. La dégénération de la région pacC n’a pas montré d’effet sur que le clivage endonucléolytique qui a lieu à une position bien définie de pacC avec une précision de ~6 pb. Des études avec des phages proches de SPP1 ont montré une conservation dans la position du clivage, malgré des variations dans pacC, pacR ou dans la distance entre pacL et pacC. Les données sont compatibles avec un modèle dans lequel TerS interagit spécifiquement avec la région pacL, sur laquelle le multimère cyclique TerS doit s’enrouler, et le motif polyadénine de la région pacR. Le complexe nucléoprotéique résultant va créer un contexte structural qui permet de recruter et positionner le domaine nucléase de TerL pour une coupure très précise sur pacC sans spécificité de séquence. / The specific recognition of the viral genome and its packaging is a critical step in viral particle assembly. In SPP1, as in many tailed bacteriophages, the macromolecular motor that encapsidates viral DNA is composed of terminase, a hetero-oligomeric enzyme possessing ATPase and nuclease activities, and of portal protein, a cyclic oligomer through which DNA is translocated. In a large number of these viruses, DNA packaging is initiated by recognition and cleavage of a specific sequence pac. This event occurs once at the beginning of a series of processive encapsidation events along a substrate concatemer of replicated phage genomes. The SPP1 pac region has two sequences where TerS (gp1) binds (pacL and pacR) flanking the segment where TerL (gp2) cleaves the SPP1 DNA (pacC). Here we show that a sequence segment of pacL and a poly-adenine motif in pacR act together to promote cleavage at pacC. Extensive degeneration of pacC sequence has no detectable effect in pac cleavage. The endonucleolytic cut occurs at a defined position with a precision of ~6 bp. Studies with SPP1-related phages show conservation of the cut position, irrespectively of sequence variation in pacC, in pacR or changes in pacL-pacC distance. The data is compatible with a model in which TerS interacts specifically with a region of pacL that probably wraps around the TerS cyclical multimer, and a poly-A tract in pacR. The resulting nucleoprotein complex architecture positions TerL for accurate cleavage at pacC without specific sequence requirement.

Les huit ARN viraux (ARNv) génomiques des influenzavirus de type A sont sélectivement empaquetés dans les virions, vraisemblablement sous la forme d’un complexe supramoléculaire maintenu par des appariements ARN/ARN entre signaux d’empaquetage. Afin d’améliorer la compréhension des règles qui gouvernent ce mécanisme, nous avons déterminé le réseau d’interactions formé entre les ARNv de la souche modèle de laboratoire A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Nous avons ensuite défini, au nucléotide près et par deux approches in vitro, les séquences des ARNv impliquées dans la formation de certaines interactions. Le rôle fonctionnel de deux d’entre elles a été testé en contexte infectieux. Nous avons également poursuivi l’étude d’une interaction identifiée au laboratoire entre deux ARNv de la souche A/Moscou/10/99 (H3N2) circulante. Enfin, nous avons collaboré avec le Dr L. Brown (Australie) sur l’étude du rôle d’une interaction entre deux ARNv de la souche A/Udorn/307/72 (H3N2). / The genome of influenza A viruses comprises eight viral RNAs (vRNAs) likely to be selectively packaged into progeny virions as organized supramolecular complexes where vRNAs are held together by base pairing within the packaging signals. To better understand the rules governing this mechanism, we investigated the vRNA/vRNA interaction network of the A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) strain. We then identified, at the nucleotide level, using two in vitro approaches, the vRNA sequences involved in several of the interactions. Two of them were functionally tested in an infectious context. We also studied an interaction previously identified in the laboratory between two vRNAs belonging to the circulating A/Moscow/10/99 (H3N2) strain. Finally, we collaborated with Dr L. Brown (Australia) in order to assess the role of an interaction between two vRNAs of the A/Udorn/307/72 (H3N2) strain.