Bei der zystischen Fibrose (CF) sowie der primären Ziliendyskinesie (PCD) handelt es sich um zwei seltene Erkrankungen, die unter anderem den mukoziliären Transport beeinträchtigen. CF gehört hierbei zu den am häufigsten vorkommenden angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wobei Betroffene unter einem Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator (CFTR)-Gens leiden, der durch die Produktion von hochviskosem Sekret in muzinproduzierenden Organen, wie dem gastrointestinalen Trakt und der Lunge, gekennzeichnet ist. Patienten, die an PCD leiden, weisen Defekte in, zum jetzigen Zeitpunkt, ca. 38 bekannten und PCD-assoziierten Genen auf, die in strukturellen Defekten des ziliären Apparats und somit in dysfunktionalen Kinozilien resultieren. Da aktuell weder für die CF noch für die PCD eine Heilung möglich ist, steht bei der Therapie vor allem die Linderung der Symptome im Fokus. Grundlegendes Ziel ist der langfristige Erhalt der Lungenfunktion sowie die Prävention bakterieller Infekte. Als bisherige Modellsysteme zur Erforschung möglicher Therapeutika gelten Tiermodelle, die den humanen Phänotyp aufgrund von Speziesdiversität nicht vollständig abbilden können. Als vielversprechende Testsysteme für die zystische Fibrose gelten humane intestinale Organoidkulturen. Nachdem allerdings vorwiegend respiratorische Symptome für die Mortalität der Patienten verantwortlich sind, stellen CF-Atemwegsmodelle bessere Testsysteme für zukünftige Therapeutika dar. Atmungsorganoidkulturen wurden verwendet, um die CFTR-Funktionalität zu untersuchen, repräsentieren aber nicht vollständig die in vivo Situation. Deshalb werden zur Entwicklung neuer Therapiestrategien patientenspezifische 3D in vitro Testsysteme der humanen Atemwege benötigt, die insbesondere im Hinblick auf personalisierte Medizin ihren Einsatz finden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine für den Lehrstuhl neue Methode zur Zellgewinnung aus nasalen Schleimhautabstrichen etabliert, die eine standardisierte Versorgung mit humanem Primärmaterial garantiert. Zur Generierung einer krankheitsspezifischen Zelllinie, wie beispielsweise einer PCD-Zelllinie mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems, ist eine Atemwegszelllinie erforderlich, die die in vivo Situation vollständig repräsentiert. So wurden vier verschiedene respiratorische Epithelzelllinien (HBEC3-KT, Calu-3, VA10 und Cl-huAEC) auf ihren mukoziliären Phänotyp hin untersucht, wobei lediglich die Zelllinie HBEC3-KT in zilientragende Zellen differenzierte. Diese zeigten jedoch nur auf ca. 5 % der Modelloberfläche Kinozilien, wodurch die humane respiratorische Mukosa nicht komplett abgebildet werden konnte und die HBEC3-KT-Zelllinie keine geeignete Zelllinie zur Generierung einer PCD-Zelllinie darstellte. Mit Hilfe des Tissue Engineering war es möglich, 3D in vitro Testsysteme basierend auf zwei unterschiedlichen Matrices, der biologischen SIS (small intestinal submucosa) und der synthetischen Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, aufzubauen. Es wurden 3D Atemwegstestsysteme mit humanen primären nasalen und tracheobronchialen Epithelzellen generiert. Ergänzend zu histologischen Untersuchungen und zur Charakterisierung spezifischer Marker des respiratorischen Systems mittels Immunfluoreszenz, wurde die Ultrastruktur der Modelle, mit speziellem Fokus auf ziliäre Strukturen, analysiert. Um Rückschlüsse auf die ziliäre Funktionalität ziehen zu können und somit eine hohe in vivo Korrelation zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin die Methode der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie etabliert, welche die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Ebenfalls wurde der Einfluss von isotoner Kochsalzlösung und des � 2-adrenergen Agonisten Salbutamol, das vor allem als Bronchodilatator bei Asthmapatienten eingesetzt wird, auf die Zilienschlagfrequenz analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen den Zilienschlag im Atemwegsmodell erhöhen. Zur Generierung der Testsysteme der beiden seltenen Erkrankungen CF und PCD wurden Epithelzellen der betroffenen Patienten zunächst mittels nicht-invasiver Raman-Spektroskopie auf einen potentiellen Biomarker untersucht, welcher Einsatz in der Diagnostik der beiden Krankheiten finden könnte. Es konnte jedoch weder für die CF noch für die PCD ein Biomarker aufgedeckt werden. Jedoch zeigten PCD-Zellen eine geringe Auftrennung gegenüber nicht-PCD Zellen. Anschließend wurden 3D-Atemwegstestsysteme basierend auf Patientenzellen aufgebaut. Der Phänotyp der CF-Modelle wurde mittels immunhistologischer Färbung und der Analyse des gestörten mukoziliären Transports verifiziert. Strukturelle ziliäre Defekte konnten durch die ultrastrukturelle Analyse von Zilienquerschnitten in drei donorspezifischen PCD-Modellen identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die ziliäre Funktionalität mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, eine neue Methode zur vollständigen Charakterisierung von 3D-Atemwegstestsystemen zu etablieren, die die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit Hilfe des Tissue Engineering ein personalisiertes Krankheitsmodell für die PCD auf Segmenten eines dezellularisierten porzinen Jejunums generiert werden kann, das zukünftig ein Testsystem für potentielle Therapeutika darstellen kann. / Cystic fibrosis (CF) and primary ciliary dyskinesia (PCD) are two rare diseases which,among others, impair the mucociliary transport. CF is one of the most common in-herited metabolic diseases with patients suffering from a defect in theCystic FibrosisTransmembrane Conductor Regulator(CFTR) gene, which is characterized by the pro-duction of highly viscous secretions in mucin-producing organs such as the gastrointestinaltract and lungs. Patients suffering from PCD have defects in currently approximately 38known and PCD-associated genes resulting in structural defects of the ciliary appara-tus and thus in dysfunctional cilia. Since neither CF nor PCD have any chance of beingcured so far, the main focus is on alleviating the symptoms. The basic goal is the long-term preservation of lung function and the prevention of microbial infections. Previousmodel systems for exploring possible therapeutic options have been animal models thatcan never completely represent the human phenotype due to species diversity. Humanintestinal organoid cultures are considered as a promising test system for cystic fibro-sis. However, since respiratory symptoms are mainly responsible for patient mortality,CF respiratory models provide better test systems for future therapeutics. Respiratoryorganoid cultures have been used to study CFTR functionality, but do not completelyrepresent thein vivosituation. In order to develop new therapeutic strategies, patient-specific 3Din vitrotest systems for the human respiratory tract expressing functionalkinocilia are required, which can be used in particular with regard to personalized medi-cine.In the present thesis, a new method for obtaining cells from nasal mucosal brush biop-sies was established, that guarantees a standardised supply of human primary materi-al. In order to generate a disease-specific cell line, such as a PCD cell line, using theCRISPR/Cas9 system, a respiratory cell line that fully represents thein vivosituation isrequired. Hence, four different respiratory epithelial cell lines (HBEC3-KT, Calu-3, VA10and Cl-huAEC) were investigated with regard to their mucociliary phenotype, wherebyonly the cell line HBEC3-KT differentiated into ciliated cells. However, these showed ki-nocilia only on approx. 5 % of the model’s surface, thus the human respiratory mucosacould not be completely modelled and HBEC3-KT cell line is no suitable cell line for geneediting experiments.Tissue engineering made it possible to build 3Din vitrotest systems based on two differentmatrices, the biological SIS (small intestine submucosa) and synthetic PET (polyethyleneterephthalate) membranes. 3D airway test systems were generated using human primarynasal and tracheobronchial epithelial cells. In addition to histological investigations and the characterization of specific markers of the respiratory system by immunofluorescence,the ultrastructure of the models was analyzed with a special focus on ciliary structures.In order to gain insight into the ciliary functionality and thus to achieve a highin vivocorrelation, the method of high-speed video microscopy was established within the scopeof this work at the Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, which allowsthe analysis of ciliary beat frequency as well as mucociliary transport. The influence ofisotonic saline solution and salbutamol, aβ2-adrenergic agonist mainly used as broncho-dilator in asthma patients, on ciliary beat frequency was also analyzed. It could be shownthat both substances increased the ciliary beat of the primary respiratory mucosa models.In order to generate test systems for the two rare diseases CF and PCD, epithelial cellsof the affected patients were first examined by non-invasive Raman spectroscopy for apotential biomarker that could be used in diagnostic approaches. However, no biomarkerfor CF or PCD could be detected, with PCD cells showing a low separation to non-PCDcells. Subsequently, 3D test systems based on patient cells were developed. The phenotypeof the CF models was verified by immunohistological staining and analysis of impairedmucociliary transport. Ultrastructural ciliary defects could be identified by ultrastructuralanalysis of cilia cross sections in three donor-specific PCD models. Additionally, ciliaryfunctionality could not be detected using high speed video microscopy analysis.In summary, this work succeeded in establishing a new method for the complete characte-rization of 3D airway test systems, which allows the analysis of ciliary beating frequencyand mucociliary transport. It has been shown for the first time that tissue engineering canbe used to generate a personalized disease model for PCD using a decellularized poricinejejunum as a scaffold. Both, PCD and CF disease models could in future be regarded astest systems for potential therapeutics.

Beschrieben wird die Etablierung von Schnittkulturen verschiedener Depots zur Untersuchung von organotypischem humanen Fettgewebe. Diese eignen sich als stabiles präklinisches Forschungsmodell zur in vitro Analyse von humanem Fettgewebe. Die Vorteile dieses Modells sind der Erhalt der zelluläre Gewebezusammensetzung, Morphologie und Vitalität von Adipozyten und Makrophagen über mindestens 14 Tage in Kultur.:INHALTSVERZEICHNIS 2 BIBLIOGRAPHISCHE ANGABEN 3 EINLEITUNG 4 FRAGESTELLUNG 13 LITERATURVERZEICHNIS DER EINLEITUNG 14 PUBLIKATIONEN 26 ZUSAMMENFASSUNG 44 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 46 SPEZIFIZIERUNG DES WISSENSCHAFTLICHEN BEITRAGS 47 DANKSAGUNG 49

Glioblastoma multiforme (GBM) ist der häufigste bösartige Hirntumor bei Erwachsenen. Unbehandelt liegt das mediane Überleben bei circa drei Monaten. Mithilfe maximal möglicher Resektion des Tumors und anschließender aggressiver kombinierter Radiochemotherapie, bestehend aus Bestrahlung und dem Zytostatikum Temozolomid, wird das mediane Überleben auf circa 15 Monate nach Diagnosestellung angehoben. Trotz intensiver Forschung ist über die Entstehung des GBMs wenig bekannt, der einzige bisher bestätigte prädisponierende Faktor ist eine Bestrahlung des Kopfes, insbesondere im Kindes- und Jugendalter. Ein charakteristisches Merkmal des GBMs ist seine große Heterogenität sowohl innerhalb des Tumors eines Patienten als auch zwischen den Tumoren verschiedener Patienten. Dadurch werden die erfolgreiche Behandlung und eine mögliche Heilung erschwert, da sich bis heute nicht zuverlässig vorhersagen lässt, wie gut ein Patient von der Standardtherapie profitieren wird. Das infiltrative Wachstum von GBMs entlang von Nervenbahnen in der gesunden weißen Substanz oder mithilfe der Blutgefäße macht es nahezu unmöglich, die gesamte Tumormasse chirurgisch zu entfernen, was eine hohe Rezidivrate zur Folge hat. Ein größeres Verständnis für die Entstehungsmechanismen des GBMs und seiner Therapieresistenzen ist essenziell für die Entwicklung besserer Therapiemöglichkeiten und verlangt dringend nach geeigneten Modellen für deren Erforschung. In der Krebsforschung bedient man sich häufig an Zellkultur- oder Tiermodellen. Zellkulturen bieten den Vorteil, dass sie preisgünstig in der Unterhaltung sind und sich in relativ kurzer Zeit große Datenmengen durch einen hohen experimentellen Durchsatz erzielen lassen. Nachteilig ist, dass jeglicher Gewebeverband fehlt und das Modell daher nicht die reale Situation in einem ganzheitlichen Organismus widerspiegelt. Im Tiermodell ist der Organismus mitsamt verschiedenen Zelltypen, extrazellulärer Matrix und Blutkreislauf gegeben, jedoch gibt es mitunter gravierende Interspeziesunterschiede, die eine erfolgreiche klinische Translation der Ergebnisse aus Tierversuchen in das humane System erschweren. Patient-derived xenografts, also Transplantate aus Patientengewebe, machen sich den Organismus des Versuchstieres zunutze, erhalten aber dabei auch die Charakteristik des ursprünglichen Tumors weitgehend. Um eine Abstoßung des transplantierten Tumorgewebes zu verhindern, werden zumeist immundefiziente Tiere verwendet, bei denen die immunologische Komponente fehlt, was das Modell artifizieller macht. Zudem ist das erzeugte Tierleid ein nicht zu unterschätzender Faktor, denn Überlebenszeitanalysen mit dem Tod des Versuchstieres als Endpunkt, spielen eine wesentliche Rolle in der onkologischen Forschung. Um das Tierleid in wissenschaftlichen Experimenten zu verringern, wurde 1959 erstmals das 3R-Prinzip (Reduction, Replacement, Refinement) definiert, wonach Tierversuche möglichst komplett ersetzt, Tierzahlen reduziert und die Bedingungen für Versuchstiere verbessert werden sollen. Diesem Prinzip folgend wurden im Institut für Anatomie der Universität Leipzig die organotypischen Schnittkulturen aus Patientengewebe als Alternative zum Tierversuch etabliert. Hierbei wird operativ entnommenes Tumorgewebe von Patienten mithilfe eines Tissue Choppers in 350 µm dünne Scheiben geschnitten und auf Membranen an einer Luft-Medium-Grenze kultiviert. Gewebe aus humanem GBM kann auf diese Weise bis zu zwei Wochen vital erhalten und für Versuche verwendet werden. In der hier vorliegenden Promotionsarbeit wurden Schnittkulturen aus GBM-Gewebe von 25 Patienten angelegt und der Standardbehandlung aus Temozolomid und Bestrahlung unterzogen. Anschließend wurde das Gewebe histologisch aufgearbeitet, um einerseits die Qualität des Gewebeerhalts mittels klassischer Färbungen mit Hämatoxylin und Eosin beurteilen und um andererseits Marker für Proliferation (Ki67) und Apoptose (TUNEL-Assay) anfärben und quantifizieren zu können. In der Vergangenheit beschränkte sich die Auswertung solcher Färbungen vorrangig auf die manuelle Quantifizierung, was zeitintensiv und abhängig von der durchführenden Person zu abweichenden Ergebnissen führt. Im Rahmen dieser Arbeit gelang die automatisierte quantitative Auswertung histologischer Färbungen von kultivierten Gewebeschnitten und deren Veröffentlichung. Durch die Automatisierung kann die Analyse deutlich schneller erfolgen, ist objektiver und damit auch geeigneter für eine klinische Anwendung. Zusätzlich zur histologischen Aufarbeitung des Gewebes wurde aus den Schnittkulturen RNA extrahiert, um Behandlungseffekte auf Expressionsebene untersuchen zu können. Für einen Patienten gelang der Vergleich zwischen Tumorgewebe und angrenzendem Tumorzugangsgewebe, da von beiden Gewebetypen Schnittkulturen angelegt und die Behandlung durchgeführt werden konnte. Mit einer Sequenziertiefe von bis zu 368 Millionen Reads pro Probe, wurden 1888 Gene identifiziert, die im Vergleich zum angrenzendem Gewebe im Tumorgewebe signifikant herunterreguliert waren. Fast 2400 Gene waren entsprechend hochreguliert. Zwischen behandeltem und unbehandeltem Tumorgewebe gab es über 3400 Transkripte, die signifikant unterschiedlich exprimiert wurden. Die Signalweganalyse mit der IPA Software (Qiagen) ergab eine reduzierte Proliferation in behandeltem GBM-Gewebe, was sich mit den Befunden aus der Quantifizierung der Ki67-Färbung deckte. Eine Subgruppenanalyse ergab, dass Gewebekulturen von langzeitüberlebenden Patienten (Gesamtüberleben > 24 Monate) besser auf die Behandlung anzusprechen scheinen, was sich in einer signifikant erhöhten Apoptoserate im Vergleich zu Patienten mit kurzem Überleben zeigte. Schnittkulturen aus Patienten mit einem progressionsfreien Überleben (PFS) von mehr als 7 oder 12 Monaten zeigten eine signifikant höhere Proliferation als Patienten mit einem PFS von unter 7 Monaten. Begründbar ist das mit einer höheren Suszeptibilität von proliferierendem Gewebe gegenüber Schäden durch Bestrahlung und Zytostatika. Die Expressionsanalyse aller 25 Patientenproben ergab eine Hochregulierung von 58 proteinkodierenden Genen. 32 Gene waren im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen im behandelten Gewebe herunterreguliert. Durch die funktionelle Analyse dieser differentiell exprimierten Gene konnte gezeigt werden, dass der p53-Signalweg, die Zellzykluskontrolle, sowie mit DNA-Schäden und deren Reparatur assoziierte Gene und Signalwege nach der Behandlung vermehrt aktiviert sind. Insgesamt zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass Schnittkulturen aus GBM-Gewebe nicht nur histologisch aufgearbeitet werden können, sondern dass es zudem möglich ist, weitreichende molekulare Untersuchungen und Genexpressionsanalysen erfolgreich durchzuführen. Weiterhin sieht man eine gute Korrelation der aus den Kulturen gewonnenen Ergebnisse mit dem klinischen Verlauf der jeweiligen Patienten, was den Rückschluss zulässt, dass die Schnittkulturen ein gutes Abbild der tatsächlichen Situation im Patienten darstellen. Damit wird die Nutzbarkeit des Modells als Alternative zum Tierversuch weiter erhöht und klinisch interessant. Die Robustheit der Methode zeigt sich dadurch, dass RNA-Analysen aus den 25 Patienten umgesetzt werden konnten, obwohl es zum Teil gravierende Unterschiede in der Qualität des kultivierten Gewebes gab. Die inter- und intratumorale Heterogenität des GBMs stellt eine große Herausforderung dar, die mit der Verwendung von biologischen und technischen Replikaten adressiert wurden. Die Korrelationsanalyse der einzelnen Replikate zeigte, dass zumindest die intratumorale Heterogenität weitgehend ausgeglichen werden konnte. Die Heterogenität zwischen den einzelnen Patienten blieb jedoch erhalten und erschwerte allgemeine Aussagen und generelle Rückschlüsse. Auch im GBM besteht daher der dringende Bedarf an individualisierten und auf den einzelnen Patienten ausgerichteten Therapieansätzen. Hierfür bedarf es zukünftig weiterer Forschung an potenziellen Biomarkern mit größeren Patientenkohorten. Gewebekulturen können hierfür sowohl für die Untersuchung von Patientengewebe als auch für die Testung neuartiger Therapieansätze eine Rolle spielen.:Einleitung 3 Glioblastoma multiforme 3 Standardtherapie und MGMT 4 Immuntherapie 5 Heterogenität im GBM 6 Individualisierte Therapie 7 RNA-Sequenzierung 8 Modelle in der Krebsforschung 10 Schnittkulturen aus Patientengewebe 11 Zielstellung der Arbeit 13 Publikation I 14 Publikation II 33 Zusammenfassung 63 Referenzen 66 Darstellung des eigenen Beitrags 72 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 76 Lebenslauf 77 Publikationen 78 Vorträge 78 Danksagung 79

The neuromeric concept of brain formation has become a well-established model to explain how order is created in the developing vertebrate central nervous system. The most important feature of neuromeres is their compartmentalization on the cellular level: Each neuromere comprises a lineage-restricted population of cells that does not intermingle with cells from neighboring compartments. The units of the vertebrate hindbrain, the rhombomeres, serve as the best-studied examples of neuromeres. Here, the lineage restriction mechanism has been found to function on the basis of differentially expressed adhesion molecules. To date, hard evidence for the existence of other lineage restricted regions in more anterior parts of the brain is still scarce. The focus of this study is the midbrain-hindbrain boundary (mhb) region, where the juxtaposition of the mesencephalon and metencephalon gives rise to a signaling center, termed the midbrain-hindbrain or isthmic organizer. Evidence for lineage restriction boundaries in the mhb region is still controversial, with some very recent studies supporting the existence of a lineage boundary between the mesencephalon and metencephalon and others rejecting this. Here, I present data strongly supporting the existence of a compartment boundary between the posterior midbrain and anterior hindbrain territory. I base this proposition on cell-tracing experiments with single cell resolution. By connecting the traces to a molecular midbrain marker, I establish a link between cell fate and behavior. In the second part, I present a novel tissue explant method for the zebrafish that has the potential to serve numerous developmental studies, especially imaging of so far inaccessible regions of the embryo.

The neuromeric concept of brain formation has become a well-established model to explain how order is created in the developing vertebrate central nervous system. The most important feature of neuromeres is their compartmentalization on the cellular level: Each neuromere comprises a lineage-restricted population of cells that does not intermingle with cells from neighboring compartments. The units of the vertebrate hindbrain, the rhombomeres, serve as the best-studied examples of neuromeres. Here, the lineage restriction mechanism has been found to function on the basis of differentially expressed adhesion molecules. To date, hard evidence for the existence of other lineage restricted regions in more anterior parts of the brain is still scarce. The focus of this study is the midbrain-hindbrain boundary (mhb) region, where the juxtaposition of the mesencephalon and metencephalon gives rise to a signaling center, termed the midbrain-hindbrain or isthmic organizer. Evidence for lineage restriction boundaries in the mhb region is still controversial, with some very recent studies supporting the existence of a lineage boundary between the mesencephalon and metencephalon and others rejecting this. Here, I present data strongly supporting the existence of a compartment boundary between the posterior midbrain and anterior hindbrain territory. I base this proposition on cell-tracing experiments with single cell resolution. By connecting the traces to a molecular midbrain marker, I establish a link between cell fate and behavior. In the second part, I present a novel tissue explant method for the zebrafish that has the potential to serve numerous developmental studies, especially imaging of so far inaccessible regions of the embryo.

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