Optimization in immunohistochemistry is often a time consuming and complex process. There are a varying array of moving parts to consider all while preserving the sensitivity and specificity of the test. When optimizing an antibody it is important to consider the fixation of the tissue and the type of epitope retrieval that would be best suited for the test. The dilution of the primary antibody is a key marker for the efficiency and effectiveness of the laboratory protocol. The purpose of this study was to produce an optimized antibody for the nuclear protein in testis to detect NUT midline carcinoma that provides a sensitive and specific test but is also efficient and can be useful for everyday pathological dedications. The midline carcinoma defined by the translocation of the NUT gene on chromosome 15q14 that bonds with BRD4 or BRD3 commonly known as NUT midline carcinoma (NMC) is a rapidly aggressive and fatal disease. Commonly a fluorescent in situ hybridization (FISH) test is used to diagnosis this carcinoma. This test takes longer than traditional IHC and can delay the treatment of the patient. Therefore this is why, irrespective of the levels of tumor markers, immunohistochemistry for the NUT marker should be performed in any case where there is poorly differentiated carcinomas that do not have glandular differentiation that come from midline structures.

Die equine Endometrose ist eine irreversible periglanduläre und/oder stromale Fibrose, betroffene Uterindrüsen zeigen meist glanduläre Alterationen und häufig eine zyklusasynchrone Differenzierung. Sie ist eine der wichtigsten Ursachen für Fruchtbarkeitsstörungen von Stuten und reduziert - abhängig von ihrer qualitativen und graduellen Ausprägung - die zu erwartende Abfohlrate. Fehldifferenzierte Endometrien treten nach neueren Erkenntnissen häufiger (16 % während der Decksaison) auf als bisher angenommen. Sie sind durch Abweichungen des endometrialen Funktions- und oder Aktivitätszustandes gekennzeichnet, wobei die irreguläre glanduläre Differenzierung (IGD) eine vollständige Pleomorphie ihrer Drüsenanschnitte zeigt. Die ungleichmäßige glanduläre Differenzierung (UGD) ähnelt mit ihren vom Grundzustand des Endometriums abweichend differenzierten Drüsennestern, die bisher als nicht-fibrotisch angesehen wurden, der equinen Endometrose. Bislang finden Fehldifferenzierungen (Ausnahme: die Atrophie in der Decksaison) keine Erwähnung im Kategorisierungsschema der Endometriumbioptate. Tatsächlich sind sie jedoch auch als fertilitätsmindernd anzusehen. Daher war das Ziel der vorliegenden Studie, mittels vergleichender lichtmikroskopischer und immunhistologischer Untersuchung der UGD und der Endometrose in Serienschnitten (n = 837) von Endometriumbioptaten (n = 33), neue Erkenntnisse darüber zu gewinnen, ob die UGD eine Frühform der Endometrose darstellt. Die Bioptate wurden 31 Stuten während der Decksaison (April bis September) der Jahre 1998 - 2012 entnommen und anhand ihrer Befunde in Gruppen eingeteilt: Stuten in Gr. 1 (n = 10) weisen eine UGD auf, Gr. 1a (n = 3) ist durch eine UGD und eine IGD, Gr. 2 (n = 10) durch eine UGD und eine Endometrose gekennzeichnet, während Gr. 2a (n = 10) eine UGD, eine Endometrose und eine IGD zeigt. Als Kontrollen dienten jeweils 5 Biopsien mit unveränderten Endometrien bzw. einer ggr. Endometrose. Die Serienschnitte wurden routinemäßig aufgearbeitet und mittels H.-E. gefärbt oder immunhistologischen Behandlungen zum Nachweis von α-Aktin, Desmin, Vimentin, Laminin, Östrogen- und Progesteronrezeptoren unterzogen. Die Ergebnisauswertung erfolgte semi-quantitativ und ohne die Erstellung einer Statistik. Alle ausgewählten UGD-Nester wurden in 3 Schnittebenen des Gewebes lichtmikroskopisch auf das Vorhandensein und die Ausprägung periglandulär angelagerter Stromazellen (PSC) überprüft. Dabei wiesen in Schnittebene 1 die Mehrzahl (78,15 %) der Drüsen innerhalb der UGD-Nester PSC auf, die häufig einschichtig (67,56 %), seltener (30,38 %) zwei- bis dreischichtig auftraten und die Drüsen meist (73,42 %) maximal zur Hälfte und selten (7,07 %) vollständig umschlossen. In tieferen Schnittebenen konnte eine dezente Zunahme der zwei- bis dreischichtigen PSC (35,85 % bzw. 34,67 %) festgestellt werden, welche die betroffenen Drüsen etwas häufiger vollständig umfassten (10,53 % bzw. 10,03 %). Immunhistologisch nimmt die α-Aktin-Expression innerhalb der UGD und (stärker ausgeprägt) in der Endometrose gegenüber unveränderten Stromazellen zu. Desmin wird im Vergleich mit unveränderten Arealen in der UGD und in der Endometrose von einem höheren Prozentsatz positiver Stromazellen exprimiert, jedoch – wie in der Literatur bereits für die UGD, nicht aber für die Endometrose, berichtet - mit verminderter Intensität. Die stromale Vimentin-Expression ist in UGD und Endometrose gegenüber den unveränderten Arealen insgesamt erhöht, wobei der Prozentsatz Vimentin exprimierender Stromazellen in der UGD etwas höher ausfällt als in der Endometrose. Auch die Drüsenepithelien zeigen in beiden Alterationen einen leicht erhöhten Prozentsatz und v.a. erhöhte Intensität von Vimentin. Für die Basallamina-Komponente Laminin kann v.a. ein verbreitertes/aufgefasertes, diskontinuierliches oder fehlendes, teilweise auch dünneres Erscheinungsbild um Drüsen in der UGD und in der Endometrose festgestellt werden. Die ER und PR werden von den Stromazellen in UGD und Endometrose insgesamt reduziert exprimiert, die Epithelzellen zeigen insbesondere für die ER eine leicht erhöhte Expression gegenüber unveränderten Drüsen. Zusammenfassend weist ein Großteil der UGD-Drüsen PSC auf. Dies lässt, in Verbindung mit dem vom unveränderten Endometrium abweichenden immunhistologischen Expressionsmuster der UGD sowie (meist stärker ausgeprägt) der Endometrose, den Schluss zu, dass die UGD eine Frühform der Endometrose darstellt. Daraus folgt die Notwendigkeit einer Überarbeitung und Ergänzung des histomorphologischen Kategorisierungsschemas für Endometriumbioptate, wobei für die UGD dieselbe (gradabhängige) prognostische Bewertung wie für die Endometrose angenommen werden muss. Künftige Studien können anhand von Verlaufsuntersuchungen überprüfen, ob UGD-Stuten in einem definierten Zeitraum eine den Kriterien des Kategorisierungsschemas entsprechende Endometrose entwickeln. / Equine endometrosis is known as periglandular and/or stromal fibrosis in combination with glandular alterations. In view of their function and/or activity, the affected glands often are deviating from the physiological stage of the cycle. It is one of the most important reasons for reduced fertility in mares and - in dependence on quality and degree - partly leads to a distinct reduction of the expected foaling rate. According to recent findings, endometrial maldifferentiations occur more often (16% during the breeding season) than expected. Affected endometria are characterised by glands deviating from the physiological stage of the cycle regarding their function and/or activity. The irregular glandular differentiation (IGD) shows a polymorphy of epithelial cells within one gland cross-section, while the unequal glandular differentiation (UGD) reminds on endometrosis because of the glandular nests, up to now seen as non-fibrotic, deviating from the stage of the cycle. Until now, endometrial maldifferentiations, excluding atrophia during the breeding season, are not mentioned in the catgorisation system for endometrial tissue examination. But in fact, they also are reducing the fertility. So the aim of this study was to get new insights if UGD is an early form of endometrosis by comparative histomorphological and immunohistochemical examinations on serial slides (n = 837) of 33 endometrial tissue specimens with UGD and endometrosis. The biopsies were taken of 31 mares during physiological breeding season (April to September) between 1998 and 2012 and grouped according to their diagnostic findings: The mares in group 1 (n = 10) show UGD, group 1a (n = 3) shows UGD and IGD while Group 2 (n = 10) is characterised by the presence of UGD and endometrosis and group 2a (n = 10) by UGD, endometrosis and IGD. Each 5 tissue samples without alterations, respectively a mild endometrosis served as controls. All serial slides (n = 837) were routinely processed and stained by hematoxylin and eosin or underwent an immunohistochemical treatment to detect α-actin, desmin, vimentin, laminin, estrogen- und progesteronreceptors. The evaluation of the results was carried out semi-quantitatively and without statistical analysis. Each three slide levels of the tissue samples were examined by light microscopy, if and of which gradual occurrence periglandular arranged stromal cells (PSC) were noticeable in deeper areas of the selected UGD-nests. In slide level 1 most of the glands (78.15%) within UGD show PSC, which mostly (73.42%) surrounds maximally half of the affected gland and rarely (7.07%) the whole gland, often (67.56%) consists of one layer and less frequently (30.38%) of two or three layers. A slight increase of PSC with two or three layers (35.85% respectively 34.67%) is detectable in deeper slide levels, also more often a complete surrounding of the glands (10.53% respectively 10.03%) by the PSC is seen. The immunohistochemical investigations reveal, compared to unchanged stromal cells, an increase of the stromal α-actin-expression in UGD and (stronger) in endometrosis. Desmin is expressed by a higher percentage of stromal cells in UGD as well as in endometrosis, but with reduced intensity. This is already described in literature for UGD but not for endometrosis. The stromal vimentin-expression is increased towards the unchanged areas in UGD and endometrosis, but the percentage of vimentin-positive stromal cells is slightly higher within UGD than within endometrosis. Vimentin also is detectable with slightly hightened percentage and first of all stronger intensity in epithelial cells of both alterations. Laminin, which is a part of the basal lamina, can be found around glands and around UGD- and fibrotic glands primarily is characterised by a widened/filamentous, discontinuous or missing, sometimes also slighter morphology. Compared to the unchanged areas, the stromal cells in UGD and endometrosis express the ER and PR in a reduced way, while epithelial cells show a slightly increased expression, especially for the ER. To sum up, a big part of the glands within UGD is characterised by PSC. In association with the immunohistochemical expression pattern of UGD and endometrosis differing (mostly stronger in endometrosis) from those of the unchanged endometrium, this is regarded as an aproach of UGD towards endometrosis, which suggests UGD being an early form of endometrosis. Because of that, a revision and completion of the histomorphological categorisation system for endometrial tissue samples is necessary, assuming the same prognostical evaluation für UGD as for endometrosis, that depends on the degree of the alterations. Future studies could verify, if mares suffering from UGD are developing an endometrosis according to the diagnostical criteria of the categorization system by a defined period of time.