En el presente trabajo se caracterizaron glicosil hidrolasas (GHs) y permeasas fúngicas implicadas en el metabolismo y transporte de azúcares, con dos aplicaciones diferentes: la producción de etanol y la síntesis de isomaltooligosacáridos (IMOS). Se han abordado tres objetivos específicos: 1) desarrollar un proceso eficiente de sacarificación y fermentación simultánea (SSF) de celulosa; 2) comparar distintas estrategias para la fermentación de celobiosa, paso crítico en la fermentación de celulosa; 3) sintetizar IMOS utilizando como material catalítico células de levadura que producen una ¿-glucosidasa de Aspergillus niger. En el proceso propuesto de sacarificación y fermentación simultánea celulosa, el material de partida (papel de filtro) se digirió con una preparación enzimática de Trichodema reesei, y se fermentó con una cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae (T500) que secreta una ß-glucosidasa de Saccharomycopsis fibuligera. La actividad ß-glucosidasa, deficitaria en el cóctel celulolítico de T. reesei, mejoró el progreso de la hidrólisis de la celulosa y la fermentación, ya que disminuye el efecto inhibitorio causado por la acumulación de celobiosa. Con este proceso se alcanzaron rendimientos de etanol por encima de 70 g/L. Se han comparado estrategias de hidrólisis extracelular o intracelular de celobiosa. Para ello, se utilizó la cepa T500 y nuevas cepas recombinantes generadas en este estudio. En una primera aproximación para la hidrólisis intracelular, se ensayaron tres ß-glucosidasas distintas y una permeasa de celobiosa de Penicillium oxalicum. En los transformantes resultantes, la tasa de crecimiento en celobiosa se vio limitada por ß-glucosidasas con baja actividad celobiasa, pero por encima de cierto valor de actividad el principal cuello de botella fue el transporte del azúcar. Por esta razón, buscamos nuevos transportadores de celobiosa procedentes de T. reesei. De 107 secuencias designadas como transportadores de azúcares en el genoma de T. reesei, se seleccionaron diez por su mayor similitud de secuencia con permeasas de celobiosa de otros hongos caracterizadas funcionalmente. Solo una de ellas (Tr_StrC) fue capaz de facilitar el transporte de celobiosa y permitir el crecimiento de S. cerevisiae. Finalmente, se comparó la capacidad de fermentar celobiosa de los dobles transformantes de levadura, con capacidad de transportar e hidrolizar intracelularmente el disacárido, con la del transformante T500. La estrategia extracelular permitió una tasa de fermentación más rápida y mayores rendimientos de etanol en comparación con la estrategia intracelular. La cepa T500 también fue más eficiente en un sistema SSF de celulosa. Se han construido y analizado cepas recombinantes de S. cerevisiae que expresan un gen (aglA) que codifica una ¿-glucosidasa de A. niger. Los transformantes de levadura produjeron actividad ¿-glucosidasa extracelularmente, la mitad de la cual quedó asociada a células y la otra mitad fue liberada al medio de cultivo. Usando maltosa como único sustrato de partida, tras 8 h de incubación, el principal producto de transglicosilación fue panosa, pero tras 24 h el producto predominante fue isomaltosa. La isomaltosa también predominó a tiempos cortos de reacción, si en lugar de sólo maltosa se utilizaba de partida una mezcla de maltosa y glucosa. Para facilitar la síntesis de IMOS se diseñó un proceso en el cual las células de levadura pueden ser utilizadas directamente como material catalítico. Para ello, se expresaron en S. cerevisiae construcciones génicas del gen aglA fusionado con el gen de levadura SED1, en versión completa o truncada, que posee la secuencia GPI (glicosilfosfatidil inositol) de anclaje a pared celular. Las enzimas híbridas resultantes se fijaron de forma estable a la superficie celular. Las células provenientes de los cultivos recombinantes que expresan las construcciones aglA-SED1 se pudieron reciclar p / In the present work, glycosyl hydrolases (GHs) and fungal permeases involved in the metabolism and transport of sugars were characterized, with two different applications: the production of ethanol and the synthesis of isomaltooligosaccharides (IMOS). Three specific objectives have been addressed in order to: 1) develop an efficient process of saccharification and simultaneous fermentation (SSF) of cellulose; 2) compare different strategies for cellobiose fermentation, a critical step in cellulose fermentation; 3) synthesize IMOS using, as catalytic material, yeast cells that produce Aspergillus niger ¿-glucosidase. Strategies for extracellular or intracellular hydrolysis of cellobiose have been compared. To this end, the T500 strain and new recombinant strains generated in this study were used. In a first approach for intracellular hydrolysis, three different ß-glucosidases and a cellobiose permease from Penicillium oxalicum were tested. In the resulting transformants, growth rate in cellobiose was limited by ß-glucosidases with low cellobiase activity, but above a certain activity value the main bottleneck was sugar transport. For this reason, we searched novel cellobiose transporters from T. reesei. Among 107 sequences designated as sugar transporters in the genome of T. reesei, ten were selected based on their higher sequence similarity with functionally characterized cellobiose permeases from other fungi. Only one of them (Tr_StrC) was able to facilitate cellobiose transport and to allow growth of S. cerevisiae. Finally, the ability to ferment cellobiose of the double yeast transformants, capable of transporting and hydrolyzing the disaccharide intracellularly, was compared with that of the transformant T500. The extracellular strategy allowed a faster fermentation rate and higher ethanol yields compared to the intracellular approach. The T500 strain was also more efficient in a cellulose SSF system. Recombinant strains of S. cerevisiae expressing a gene (aglA) encoding an ¿-glucosidase from A. niger have been constructed and analyzed. The yeast transformants produced ¿-glucosidase activity extracellularly, half of which was cell-associated and the other half was released into the culture medium. Using maltose as the only initial substrate, after 8 h of incubation, the main product of transglycosylation was panose, but after 24 h the predominant product was isomaltose. Isomaltose also predominated at short reaction times, if a mixture of maltose and glucose was used instead of maltose alone. In order to facilitate the synthesis of IMOS, a process was designed in which the yeast cells can be used directly as catalytic material. For this purpose, the aglA coding region was fused to full-length or truncated versions of the yeast gene SED1, containing the GPI (glycosylphosphatidyl inositol) sequence for anchoring to the cell wall, and expressed in S. cerevisiae. The resulting hybrid enzymes were fixed stably to the cell surface. Cells from the recombinant cultures expressing the aglA-SED1 constructs could be recycled to produce IMOS in successive reactions. / En aquest treball es van caracteritzar glicosil hidrolases (GHs) i permeases fúngiques implicades en el metabolisme i transport de sucres, amb dos aplicacions diferents: la producció d'etanol i la síntesi d'isomaltooligosacàrids (IMOS). S'han abordat tres objectius específics: 1) desenvolupar un procés eficient de sacarificació i fermentació simultània (SSF) de cel·lulosa; 2) comparar distintes estratègies per a la fermentació de celobiosa, pas crític en la fermentació de cel·lulosa; 3) sintetitzar IMOS utilizant com a material catalític cèl·lules de llevat que produeixen una ¿-glucosidasa de Aspergillus niger. En el procés proposat de sacarificació i fermentació simultània de cel·lulosa, el material de partida (paper de filtre) es va digerir amb una preparació enzimàtica de Trichodema reesei i es va fermentar amb una soca recombinant de Saccharomyces cerevisiae (T500), la qual secreta una ß-glucosidasa de Saccharomycopsis fibuligera. L'activitat ß-glucosidasa, deficitària en el còctel cel·lulolític de T. reesei, va millorar el progrés de la hidròlisi de la cel·lulosa i la fermentació, ja que disminuiex l'efecte inhibitori causat per l'acumulació de celobiosa. Amb aquest procés es van assolir rendiments d'etanol superiors a 70 g/L. S'han comparat estratègies d'hidròlisi extracel·lular o intracel·lular de celobiosa. Per a això, es va emprar la soca T500 i noves soques recombinants generades en aquest estudi. En una primera aproximació per a l'hidròlisi intracel·lular, s'assajaren tres ß-glucosidases distintes i una permeasa de celobiosa de Penicillium oxalicum. Als transformants resultants, la tasa de creixement amb celobiosa va estar limitada per ß-glucosidases amb baixa activitat celobiasa, però per damunt d'un cert valor d'activitat el principal coll d'ampolla va ser el transport del sucre. Per aquesta raó, cercàrem nous transportadors de celobiosa procedents de T. reesei. De 107 seqüències designades com a transportadors de sucres en el genoma de T. reesei, es van seleccionar deu per la seua major similitut de seqüència amb permeases de celobiosa d'altres fongs caracteritzades funcionalment. Només una d'elles (Tr_StrC) va ser capaç de facilitar el transport de celobiosa i permetre el creixement de S. cerevisiae. Finalment, es va comparar la capacitat de fermentar celobiosa dels dobles transformants de llevat, amb capacitat de transportar i hidrolitzar intracel·lularment el disacàrid, amb la del transformant T500. La estratègia extracel·lular va permetre una tasa de fermentació més ràpida i majors rendiments d'etanol en comparació amb la estratègia intracel·lular. La soca T500 també va ser més eficient en un sistema SSF de cel·lulosa. S'han construït i analitzat soques recombinants de S. cerevisiae que expresen un gen (aglA) que codifica una ¿-glucosidasa de A. niger. Els transformants de llevat produiren activitat ¿-glucosidasa extracelul·larment, la meitat de la qual va quedar associada a cèl·lules i l'altra meitat va ser alliberada al medi de cultiu. Utilitzant maltosa com a únic substrat de partida, després de 8 h d'incubació, el principal producte de transglicosilació va serpanosa, però després de 24 h el producte predominant va ser isomaltosa. La isomaltosa també va predominar a tiemps curts de reacció, si en lloc de només maltosa s'utilizava de partida una combinació de maltosa i glucosa. Per a facilitar la síntesi de IMOS es va dissenyar un procés en el qual les cèl·lules de llevat poden ser utilitzades directament com a material catalític. Per a això, s'expresaren en S. cerevisiae construccions gèniques del gen aglA fusionat amb el gen de llevat SED1, en versió completa o truncada, el qual conté la seqüència GPI (glicosilfosfatidil inositol) d'ancoratge a paret cel·lular. Els enzims híbrids resultants es van fixar de forma estable a la superfície cel·lular. Les cèl·lules provinents dels cultius recombinants que exp / Casa Villegas, MF. (2018). Caracterización de glicosidasas y permeasas fúngicas implicadas en el transporte y metabolismo de azúcares [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/106344

Les ß-glucosidases són enzims que hidrolitzen enllaços b-glicosídics de disacàrids o oligosacàrids, amb una baixa regioespecificitat de manera que reconeixen específicament l'extrem glucídic no reductor i alhora tenen baixa especificitat per l'extrem reductor o aglicó. El mecanisme catalític és un doble desplaçament amb catàlisi àcid/base i formació d'un intermediari glicosil-enzim; la hidròlisi es produeix amb retenció de la configuració del carboni anomèric. En aquest treball s'ha estudiat la ß-glucosidasa Bgl3 d'Streptomyces sp. (ATCC 11238) clonada anteriorment al grup, s'ha millorat la producció de l'enzim posant-lo sota control del promotor de la T7-RNA polimerasa, i s'ha millorat el procés de purificació amb la fusió a una cua d'histidines al seu extrem N-terminal que permet l'obtenció de proteïna pura mitjançant un sol pas de purificació (columna d'afinitat). La proteïna obtinguda ha permès l'obtenció de l'estructura tridimensional de l'enzim per cristal.lografia de raigs X.S'ha caracteritzat l'activitat catalítica de la Bgl3 amb dues bateries de substrats, una que variava l'extrem no reductor per determinar l'especificitat del subseti -1, i l'altre que variava les característiques de l'aglicó amb l'objectiu d'establir una relació lineal d'energia lliure (anàlisi de Hammett). L'estudi de la dependència de l'activitat respecte a la temperatura i al pH, ha permès dilucidar aspectes del mecanisme catalític com l'energia d'activació i la variació dels pKa dels residus catalítics essencials.Per mutagènesi dirigida s'han obtingut enzims sense algun dels dos residus catalítics essencials, i s'ha comprovat la reducció de l'activitat catalítica. S'ha comprovat el paper de cada un d'aquests residus a la catàlisi per rescat químic de l'activitat dels mutants amb l'addició d'un nucleòfil extern, i posterior identificació per Ressonància Magnètica Nuclear dels productes formats.Finalment s'ha avançat en l'estudi de l'especificitat de substrat respecte l'aglicó mitjançant mutagènesi dirigida i caracterització cinètica dels mutants sobre una posició conservada del centre actiu: la cisteïna 181 de la Bgl3. / ßeta-glucosidases are enzymes that can hydrolyze ßeta-glycosidic bonds from disaccharides or oligosacharides, with a low regiospecificity, so than they recognize specifically the glucidic non-reducing extreme and they have low specificity for the reducing extreme or aglycon. The catalytic mechanism is a double displacement with catalysis acid/base and formation of an intermediary glycosil-enzyme; the hydrolysis is produced with retention of the configuration of the anomeric carbon. In this work it has studied the ß-glucosidase Bgl3 from Streptomyces sp. (ATCC 11238) cloned before in the group, it has improve the production of the enzyme expressing it under control of T7-RNA polymerase promotor, and it has improve the purity method fusing at the N-terminus of the gene, a 6 histidines tag, allowing pure protein obtaining with a sole step purification (affinity column). Protein so obtained has allowed the resolution of the 3D structure for ray X crystallography.It have characterized the catalytic activity of Bgl3 with 2 sets of substrates, one that vary his non reducing extreme to determine the specificity of subset -1, and the other set that vary the characteristics of the aglycon moiety to determine a free energy relationship (Hammett analysis). The study of the dependence between activity and temperature or pH, has show aspects of the catalytic mechanism as Energy of activation and the pKa variations of the essential catalytic residues during catalysis.Trough site directed mutagenesis, it has been obtained enzymes without any one of the two essential catalytic residues, and it has been check reduction of the catalytic activity. It has been proved the role of those residues in the catalysis with the chemical rescue of the activity of the mutant forms adding an extern nucleophile, and identifying the products with Nuclear Magnetic Resonance.Finally, it have been progress in the substrate specificity respect aglycon by means of site directed mutagenesis and kinetic characterization of the mutants over a conserved position in the active center: the cysteine 181 of the Bgl3.