La spermatogenèse est le processus par lequel les cellules germinales sont transformées en spermatozoïdes par le déroulement de 3 phases: la phase mitotique et méiotiques et la spermiogénèse. Pendant la spermiogénèse d'importantes structures sont formées afin de générer un spermatozoïde fonctionnel : l’acrosome, la manchette et le flagelle. La manchette est une structure transitoire situé caudalement à l’acrosome, composée par un manteau de microtubules longeant le noyau du spermatide. La manchette est connue pour participer au remodelage du noyau afin de lui conférer une forme falciforme ainsi que pour son rôle dans le développement de l’acrosome et du flagelle. En effet, pendant la spermiogénèse toutes les molécules nécessaires pour la formation du flagelle et de l’acrosome doivent être transportées sur leur site d'assemblage. Les microtubules forment la manchette permettent le mouvement de protéines entre la région pré-acrosomique et la zone d’assemblage du flagelle. Cependant ce transport doit être finement régulé dans l’espace et dans le temps car la localisation aberrante et/ou manquante de certaines protéines peut causer des malformations de l’ acrosome, de la manchette et du flagelle. Un mécanisme qui peut expliquer la façon dont ce processus de transport peut être régulé est la génération de modification post-traductionnelles de la tubuline forment les microtubules car ces modifications peuvent réguler les interactions avec les moteurs moléculaires et les protéines associées aux microtubules. La polyglutamylation correspond à un attachement covalent de chaines de glutamates latérales sur la queue terminale de la tubuline. Cette modification est contrôlée par la coordination des enzymes glutamylase (TTLLs) et déglutamylase (CCPs). De récents études ont souligné l'importance potentielle de certaines de ces enzymes dans la formation et la maintenance du flagelle. Mon projet est centré sur l’étude des fonctions exercées par CCP5 pendant la spermatogenèse chez la souris. CCP5 est le seule enzyme qui a la capacité de couper le glutamate de branchement des chaines latéral et qui peut donc réguler l’équilibre entre présence ou l’absence de glutamate de branchement. L’analyse de la souris CCP5-knockout a permis de souligner le rôle essentiel mené par CCP5 pendant la spermiogénèse. J'ai constaté que les souris CCP5-KO produisent 100 fois moins de sperme, défectueux et immobile, comparé aux contrôles. De plus, des nombreuses cellules haploïdes immatures sont prématurément libérées de l’épithélium germinatif. Une analyse approfondie à révélée que la réduite production de sperme est due à plusieurs défaut ultrastructurelles qui surgissent pendant la spermiogenèse. J’ai observé que l’acrosome n’était pas bien développée et que cela se détachait du noyau chez les spermatides matures condensés. De plus l’organisation des microtubules formant la manchette était aussi affectée par une émanation ectopique, ainsi que par une localisation défectueuse dans le noyau. Ces défauts corrèlent avec la formation des spermatides allongée que n’ont pas la typique forme falciforme. De plus, j’ai constaté la présence de centrioles surnuméraires chez les spermatides allongées CCP5-KO. Ce défaut corrèle avec l’observation de microtubules « doublets » et « singlets » dispersés dans le cytoplasme de la cellule. De plus, les structures accessoires du flagelle se positionnaient, de façon désorganisé, à côté de ces microtubules. On a pu constater que ces microtubules sont très probablement issus de plusieurs axonemes qui s'ouvrent dans leur région. Le processus entier de spermiogenèse semble être défectueux dans la souris CCP5-KO et cela est accompagné par d'importants changements de niveaux de glutamylation chez les spermatides rondes et allongés. Par conséquence la régulation des niveaux de glutamylation faites par CCP5 lors de la spermiogénèse semble être fondamental pour garantir un développement normal des spermatides en spermatozoïdes. / Spermatogenesis is the process by which germ cells are transformed into spermatozoa by three sequential phases: the mitotic- and meiotic- phase followed by spermiogenesis. To allow the final maturation of haploid germ cells into spermatozoa specific structures have to be developed during the spermiogenesis: the acrosome, the manchette and the flagellum. The manchette is a MTs-based structure, located caudally to the acrosome, organizing in a skirt-like fashion. Manchette is known to participate in the shaping of the nucleus conferring it the typical hook-like shape and several studies have underlined its importance in acrosome and flagellum formation. During spermiogenesis all molecules and organelles necessary for both acrosome and flagellum formation have to be transported to their destination sites and manchettal MTs allow the movement of organelles and other proteins between the pro-acrosome region and the spermatid tail. However this MTs-based traffic has to be regulated both in space and time as it has been shown that ectopic or mislocalization of certain proteins can lead to failures in acrosome, manchette and flagellum development. The generation of posttranslationally modified MTs might explain a possible mechanism of traffic regulation since it has been demonstrated that posttranslational modifications (PTMs) can regulate the interaction between MTs and molecular motors and microtubules binding proteins. Polyglutamylation, consist in the addition of glutamate side chains of variable length on α- and β- tubulin carboxy-terminal tails. Glutamylation levels are determined by the combined action of glutamylase (TTLLs) and deglutamylase (CCPs) enzymes. Several reports have recently highlighted the importance of some of these enzymes in flagellum assembly and/or maintenance. During my PhD I investigated about the functional role of CCP5 during mouse spermatogenesis. CCP5 is the only enzyme able to remove the glutamate branching point of the added side chain. Thus, its activity might regulate the equilibrium between presence/absence of glutamate branching points, in turn interfering with polyglutamylation levels. The study of the CCP5-KO mouse reveals that CCP5 has an essential role during mouse spermiogenesis. CCP5-KO male produces 100-fold less sperm cells than controls and released sperm cells are highly defective and immotile. Moreover, haploid immature germ cells are also found in CCP5-KO semen. A deep-analysis reveals that the reduced sperm output is due to several ultrastructural defects emerging during the spermatids differentiation process. The acrosome, although is still formed, it does not appear to develop symmetrically and appears to detach from the nucleus in condensed spermatids. Another structure that is impaired in CCP5-KO spermatids in the manchette. Manchettal MTs, are seen to emanate from ectopic regions of the germ cells without running parallel to the nucleus, and are often observed within the spermatids nuclei. Altogether these defects correlate with an aberrant-shaped spermatid nucleus not showing the typical hook-like shape. Another phenotype observed in CCP5-KO elongating spermatids is the presence of supernumerary basal bodies that correlates with the presence of singlet or doublets microtubules dispersed within the germ cell cytoplasm. Interestingly sperm accessory structures are seen to chaotically organize around the microtubules. Unstable disassembling axonemes are seen together with those MTs, suggesting that CCP5-KO spermatids develop abortive unstable flagella. Interesting all these ultrastructural defects correlate with increased level of glutamylation on round spermatids’ cortical MTs and elongating spermatids’ manchettal MTs. Taken together, this study strongly suggests that CCP5-mediated glutamylation regulation is fundamental for spermatids differentiation into healthy functional spermatozoa.

La scoliose est une déformation de la colonne vertébrale dans les trois plans de l’espace (frontal, sagittal et transverse), et la forme la plus fréquente est la scoliose idiopathique (SI) dont la cause est encore très mal comprise. La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est une forme de SI qui se développe au cours de la puberté, plus souvent chez les filles, et présente une importante hétérogénéité phénotypique. Les très nombreuses recherches afin de comprendre les mécanismes qui entrent en jeu dans le développement de cette maladie et afin de déterminer l’étiologie ont permis de mettre en évidence un très grand nombre de théories regroupant des facteurs endocriniens et métaboliques, des facteurs biomécaniques et musculosquelettiques, des facteurs neurologiques et vestibulaires ainsi que des facteurs génétiques et épigénétiques. L’identification du gène candidat POC5 dans la SI par notre laboratoire, un gène crucial dans la formation du cil primaire, a été un tournant majeur apportant la première pièce d’un puzzle plaçant le cil primaire au centre des hypothèses concernant la mise en place de la maladie. Le cil primaire est une organelle non-motile retrouvée à la surface de la totalité des cellules du corps humain à l’exception des cellules sanguines. Grâce à son axonème formé de tubuline capable de subir des modifications post-traductionnelles appelées « code tubuline » et sa membrane ciliaire ultra spécialisée, le cil primaire joue un rôle mécanosenseur important tout au long de la vie, dès le développement embryonnaire. Il prend part à de nombreux mécanismes dont la formation et l’homéostasie osseuse et a déjà été mis en cause dans les maladies osseuses. En effet, lorsque le cil primaire est défectueux, il est responsable de syndromes complexes regroupés sous le nom de ciliopathie dont un des symptômes est la scoliose. L’hypothèse générale de la présente thèse est que des variants rares dans des gènes ciliaires, particulièrement le gène POC5 et le gène TTLL11, agissent sur les mécanismes cellulaires responsables de la mise en place de la SIA faisant d’elle une maladie appartenant à la grande famille des ciliopathies. L’objectif de cette thèse a été de documenter l’implication et la pathogénicité des gènes POC5 et TTLL11 dans la SIA. Nous avons d’abord déterminé la prévalence des variants du gène POC5 dans une cohorte de patients d’origine franco-canadienne ou britannique atteints de SIA (Manuscrit 1). Ensuite, nous avons créé trois modèles de souris Knock-in pour l’équivalent des variants du gène POC5 humain afin d’analyser la pathogénicité et le phénotype éventuel de ciliopathie (Manuscrit 2). Finalement, la pathogénicité du gène TTLL11 muté a été analysée dans des cellules issues de patients atteints de SIA et dans un modèle animal, le poisson zèbre (Manuscrit 3). Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont montré que les deux gènes ciliaire POC5 et TTLL11 sont des gènes candidats probablement impliqués dans les mécanismes cellulaires fondamentaux induisant la mise en place de la SIA et ont permis d’identifier un mécanisme, la polyglutamylation du cil primaire, comme étant relié à la SIA. / Scoliosis is a 3D spinal curvature, in the frontal, sagittal and transverse plans, and the most common form is the idiopathic scoliosis (IS) with a cause that remains very poorly understood. Adolescent Idiopathic Scoliosis (AIS) is a subtype of IS that develops during the puberty, most commonly in girls, and has a significant phenotypic heterogeneity. To date, a large amount of research on scoliosis etiology highlighted various hypotheses based on endocrine and metabolic factors, biomechanical and musculoskeletal factors, neurological and vestibular factors, as well as genetic and epigenetic factors. The identification of the IS candidate gene POC5 by our laboratory, a crucial gene in the formation of the primary cilium, was a major turning point bringing the first piece of a puzzle where the primary cilium is a central hypothesis concerning the onset of the disease. The primary cilium is a non-motile organelle found at the cell surface of all the human body cells, except for blood cells. The primary cilium plays an important mechano-sensor role throughout life, from embryonic development through its axoneme composed by tubulin that hosted post-translational modifications called “tubulin code”, and its ultra-specialized ciliary membrane. It is involved in many mechanisms including bone formation and homeostasis and has already been implicated in bone diseases. Indeed, the defective primary cilium is responsible for human ciliopathy syndromes that are associated with scoliosis. The main hypothesis of this thesis is that rare variants in ciliary genes, especially the POC5 gene and the TTLL11 gene, participate on cellular mechanisms responsible for the onset of AIS supporting the idea that scoliosis is a form of ciliopathy. The specific objective of this thesis was to document the involvement and pathogenicity of the POC5 and TTLL11 genes in AIS. We first determined the prevalence of POC5 gene variants in a cohort of French-Canadian and British AIS patients (Manuscript 1). Then, we created three knock-in mouse models carrying the equivalent of the human POC5 gene variants to analyze the pathogenicity and the possible phenotype of ciliopathy (Manuscript 2). Finally, the pathogenicity of the mutated TTLL11 gene was analyzed in cells extracted from AIS patients and in an animal model, the zebrafish (Manuscript 3). The work presented in this thesis showed that the two ciliary genes POC5 and TTLL11 are candidate genes probably involved in the fundamental cellular mechanisms inducing the onset of AIS and allowed us to identify the primary cilium polyglutamylation, as a mechanism being related to AIS.

In comparison to other Pseudomonas, P. aeruginosa grows poorly in L-lysine as a sole source of nutrient while fast growth mutants can be obtained. The proposed catabolic pathway involves lysine decarboxylation to cadaverine and its subsequent degradation through g-glutamylation pathway to d-aminovalerate and glutarate. The lysine decarboxylase A (ldcA) gene, previously identified as a member of the ArgR regulon of L-arginine metabolism, was found essential for L-lysine catabolism. The ldcA gene encodes a decarboxylase which takes L-lysine but not L-arginine as substrate. Contrarily, the ldcA expression was inducible by L-arginine but not by L-lysine. This peculiar arginine control on lysine utilization was also noted from uptake experiments. The lack of lysine-responsive control on lysine catabolism and its tight connection to arginine regulatory network provided an explanation of lysine as poor nutrient for P. aeruginosa. Catabolism of cadaverine, a product from lysine decarboxylation, was investigated and compared to that of putrescine, another diamine of similar biochemical properties that is derived from arginine and ornithine. While the g-glutamylation pathway was first reported in E. coli for putrescine utilization, an expanded version of this pathway was found in P. aeruginosa with redundant enzymes for polyamine degradation. The PauR protein was identified as a transcriptional repressor of genes for the catabolism of putrescine and cadaverine, as well as their corresponding downstream metabolites, g-aminobutyrate (GABA) and d-aminovalerate (AMV). PauR shows distinct dimer configuration after glutaraldehyde crosslinkage, and possible conformational changes could be triggered by the presence of putrescine and cadaverine, but not GABA. A newly identified ABC transport system, encoded by the agtABCD operon, was found important for the uptake of GABA and AMV; and expression of which is controlled by the AgtSR two-component system. The CbrAB two-component system was proposed to regulate the catabolite repression control protein Crc through a small RNA CrcZ. A consensus CbrB recognition sequence was proposed based on the conserved palindromic nucleotide sequence in the upstream activating sequence of the crcZ promoter. Genetic studies indicated utilization of arginine, lysine and diamines (but not histidine, GABA and AMV) might be under CbrAB regulation through the CbrAB/CrcZ/Crc system in P. aeruginosa.