La biosynthèse de phénol-glycolipides (PGL) par Mycobacterium tuberculosis et M. leprae favorise l’invasion des macrophages via l'interaction de la partie saccharidique des PGL avec le domaine lectine du récepteur cellulaire au complément CR3. Les PGL inhibent également la production de cytokines inflammatoires par la cellule hôte, par un mécanisme inconnu. J’ai observé que des bactéries BCG transgéniques exprimant les PGL de M. tuberculosis ou M. leprae avaient une capacité de survie accrue dans les macrophages. Cette persistance intracellulaire était dépendante de CR3 et associée à une diminution de la production d'oxyde nitrique dans les cellules infectées. L’addition de PGL purifié suffisait à inhiber la production d’oxyde nitrique par des macrophages stimulés avec LPS/IFN-γ. J’ai montré que la liaison de PGL-1 à CR3 provoquait la dégradation post-transcriptionnelle de TIR-domain-containing adapter-inducing interféron-β (TRIF) dans les macrophages, ce qui entraînait une réduction de la signalisation TRIF-dépendante. Dans les macrophages stimulés avec LPS/IFN-γ, la dégradation de TRIF réduisait la production d’oxyde nitrique synthase, et la production TRIF dépendante de cytokines inflammatoires et des chimiokines. Mes résultats ont donc permis d’identifier un nouveau mécanisme de virulence développé par les mycobactéries pathogènes pour réprimer conjointement les réponses inflammatoires et antimicrobiennes de l’hôte / Biosynthesis of phenolic glycolipids (PGL) by Mycobacterium tuberculosis and M. leprae promotes macrophage invasion, which proceeds through the interaction of the PGL sugar moieties with the lectin domain of cell-displayed complement receptor (CR3). PGL also limit host cell production of inflammatory cytokines by an unknown mechanism. I observed that transgenic BCG that express PGL specific to M. tuberculosis or M. leprae displayed enhanced survival within macrophages. Increased intracellular persistence of PGL-expressing BCG was CR3-dependent and correlated with the decreased production of nitric oxide in infected cells. Notably, the addition of soluble PGL to macrophages was sufficient to induce a reduction in nitric oxide production upon stimulation with LPS/IFN-γ. I showed that PGL-1 binding to CR3 causes the post-transcriptional degradation of TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) in macrophages, resulting in impaired TRIF-dependent signaling. Functionally, PGL-1-mediated degradation of TRIF resulted in the decreased induction of nitric oxide synthase, and TRIF-dependent inflammatory cytokines and chemokines in LPS/IFN-γ-stimulated macrophages. My results thus identified a virulence mechanism evolved by pathogenic mycobacteria to suppress both the inflammatory and antimicrobial responses of infected host cells

Th.--Sci. pharm.--Paris 5, 1981. N°: 61.

Les microalgues présentes à la fois dans les eaux douces et salées compteraient plus de 200 000 espèces. Cette diversité en fait une source potentielle de métabolites spécialisés originaux. Parmi les principales familles de substances naturelles valorisées actuellement, on peut citer les pigments, lipides, protéines, polysaccharides, caroténoïdes. Une vision plus globale du métabolome de chacune des espèces apparaît aujourd’hui nécessaire pour mieux mettre en valeur le potentiel commercial que représente cette « microbiodiversité ». Pour cela, nous avons tout d’abord choisi d’approcher le métabolome de différentes souches de microalgues cultivées au sein de la Société Greensea en s’appuyant sur les techniques d’HPTLC, de RMN et d’UHPLC-QTOF pour une visualisation large. Cette étude nous a permis de regrouper les espèces par analogie métabolique après traitement statistique des données. Une seconde partie a consisté en une étude phytochimique approfondie de certaines souches et a conduit à l’isolement et la caractérisation de plusieurs molécules. Ainsi, en plus de métabolites connus, un peptide original portant un motif isoprényl, le cumbriamide a été caractérisé au sein de Lyngbya sp. et une première évaluation de son potentiel thérapeutique a été entreprise. Une large diversité en glycolipides s’est montrée prépondérante dans de nombreuses souches et une méthode de caractérisation a pu être mise au point pour leur identification par UHPLC-QTOF. Enfin, différentes applications des approches métabolomiques ont été envisagées. Ainsi, des études chimiotaxonomiques ont été menées sur les différentes souches de microalgues et l’influence de changements de conditions de culture sur la production de métabolites chez Nannochloropsis oculata a été observée. / Microalgae are present both in Oceans and freshwaters and could include more than 200 000 species. This diversity is a source of original specialized metabolites that can find a large array of applications. Pigments, lipids, proteins, polysaccharides and carotenoids are usual compounds produced by microalgae that have found commercial applications. A global vision of the metabolome of each species has showed promises to highlight the commercial value of this “microdiversity”. We then decided to assess the metabolome of several microalgae species grown at the Greensea company by using HPTLC, NMR and UHPLC-QTOF techniques for a rapid and global overview. A classification of the species according to their metabolomics similarities was obtained after statistics treatment of the data. A second part was dedicated to a phytochemical study of the extracts of selected strains and led to the isolation and characterization of several metabolites. Thus, in addition to known molecules, an original peptide substituted by an isoprenyl moiety and named cumbriamide has been characterized in Lyngbya sp and a first assessment of its therapeutical potential has been undertaken. Glycolipids have been identified as the major metabolites in the extracts of numerous strains and a UHPLC-QTOF method was developed for their identification. Finally, several applications of the metabolomics approaches were considered. Chemotaxonomic studies were first carried out and the influence of growth conditions on the metabolome of Nannochloropsis oculata was observed.

L'enveloppe mycobactérienne contient de nombreux lipides uniques qui jouent un rôle clé dans leur pathogénicité. Certains lipides ont été identifiés comme antigènes, les glycolipides phénoliques (PGL), le lipoarabinomannane (LAM), les sulfoglycolipides diacylés (Ac2SGL) et les phosphatidylinositolmannosides (PIMs). Le but de cette thèse est la synthèse chimique des épitopes de deux glycolipides mycobactériens importants : les glycolipides phénoliques et les phosphatidylinositol mannosides. / The mycobacterial cell envelope contains many unique lipids which play a key role in the pathogenicity. Some of the lipids have been identified as antigens, the phenolic glycolipids (PGLs), the lipoarabinomannan (LAM), the diacylated sulfoglycolipid (Ac2SGL) and the phosphatidylinositolmannoside (PIMs). The main theme of this thesis is the chemical synthesis of the epitopes of two important mycobacterial glycolipids : phenolic glycolipids and phosphatidylinositol mannosides.

Les secteurs de la parfumerie et de la cosmétique occupent une place proéminente dans la société moderne. De nombreuses entreprises se positionnent depuis plusieurs années sur les produits cosmétiques à ingrédients naturels. Les plantes, longtemps considérées comme matière première principale pour le domaine de la cosmétique, sont aujourd’hui concurrencées par les microalgues dont la biomasse devient plus facile à obtenir grâce aux avancées en biotechnologie bleue. Ainsi, Cosmo International Ingredients se positionne à travers cette thèse pour élargir son panel de matières premières valorisables dans le domaine de la cosmétique. Dans un premier temps, l’étude phytochimique de microalgues péruviennes a permis d’isoler et identifier une famille majeure de métabolites chez les microalgues : les glycolipides. Une recherche de conditions d’extraction optimale pour cette famille a été effectuée et a permis de proposer une méthodologie verte, spécifique et peu coûteuse. Les cyanobactéries connues pour leur production de métabolites structurellement diversifiés ont été sélectionnées pour la culture suivant des critères spécifiques. Cette approche a permis d’isoler et de caractériser 5 composés à forte valeur ajoutée dont 4 peptides et un alcaloïde. Enfin, un forçage métabolique a été effectué sur Microcystis aeruginosa afin d’optimiser la production des 4 peptides cibles. Il en est ressorti que les paramètres température et intensité lumineuse jouent un rôle important dans la production peptidique / The sectors of fragrances and cosmetics play a prominent role in the modern society. During the last decades, several companies have been focusing on nature to provide innovative products. Plants have historically been considered the main raw material in the cosmetic field but, recently, microalgae have been identified as a worthy competitor due to the facility to obtain biomass. Thus, the company Cosmo International Ingredients supported this PhD. thesis to broaden their range of raw materials that can be used for the cosmetic industry. First, the phytochemical study of Peruvian microalgae allowed the isolation of a major family of metabolites: glycolipids. An environmentally-friendly, selective and low-cost method for their extraction from the biomass has been developed. Cyanobacteria known for their production of structurally diverse metabolites have been selected for culture following specific criteria; as a result 5 compounds have been isolated and fully characterized, 4 of which were peptides and one was an indole alkaloid. Finally, to optimize the production of the targeted bioactive peptides, a kinetic study was performed for 3 different temperatures and 3 different light intensities. These parameters were found to play a critical role for the peptide production

Les glycoconjugués comme les glycolipides et les glycopeptides sont impliqués dans de nombreux processus biologique, physiologique et pathologique, tels que les interactions cellule-cellule, les infections virales et bactériales, les réponses immunitaires, le cancer, etc. Ces propriétés ont suscité de recherche intensive pour la synthèse de mimes de glycoconjugés pour des applications en biologie et en pharmacie. Cette thèse est consacrée à la synthèse de glycolipides et de glycopeptides liés par la liaison N-oxyamide qui possède une meilleure stabilité métabolique et une facilité de formation de liaison H conduisant à des structures secondaires très intéressantes.Les dérivés de pyranoid glycoaminooxy acides fonctionnés en positions 2 et 6 du sucre sont synthétisés à partir du methyl alpha-D-glucopyranoside, puis transformés en N-oxyamide glycolipides. En tant que nouveaux mimes de glycoglycérolipides et glycosphingolipides, les N-oxyamide beta-glycolipides possédant une ou deux chaines lipidiques sont préparés à partir du glucose ou du galactose penta-acétate et de (S)-1,2-di-O-benzyl-glycérol.De plus, une synthèse stéréosélective de (2R) et de (2S)-3-beta-O-glycosyl aminooxy esters a été réalisée à partir du (2R)-beta-glycoglycérol, avec la réaction de Mitsunobu et l’épimérisation de Lattrell-Dax comme étapes clés. Les N-oxyamide glycopeptides ont pu être préparés à partir de glycosyl aminooxy esters orthogonalement protégés. / As part of glycoconjugate family, glycolipids and glycopeptides are involved in a variety of important biological, physiological and pathological processes, such as cell-cell interactions, viral and bacterial infections, immune response, cancer progression, etc. Synthesis of glycoconjugate mimics has attracted intensive research interest for biological and pharmaceutical applications. This thesis was devoted to the synthesis of N-oxyamide-linked glycolipids and glycopeptides, since N-oxyamide-containing compounds have shown improved metabolic stability, and interesting secondary structures due to the easy H-bond formation property of N-oxyamide compounds.From methyl alpha-D-glucopyranoside, the 2,6-functionalized pyranoid glycoaminooxy acid derivatives have been successfully prepared as a multifunctional building block for further derivatization to new N-oxyamide glycolipids. From glucose or galactose pentaacetate and (S)-1,2-di-O-benzyl-glycerol, we have successfully achieved the first synthesis of N-oxyamide-linked beta-glycolipids with one or two lipids chains, as novel mimics of glycoglycerolipids and glycosphingolipids.In addition, the (2R) and (2S)-3-beta-O-glycosyl aminooxy esters have been stereoselectively synthesized from (2R)-beta-glycoglycerol, with Mitsunobu reaction and Lattrell-Dax epimerization as key steps. N-Oxyamide-linked glycopeptides have been prepared from the orthogonally protected glycosyl aminooxy esters.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / Dans cette étude, nous avons comparé le potentiel de lutte biologique et le développement de quatre espèces du genre Pseudozyma {P. antárctica, P. flocculosa, P. fusiformata et P. rugulosa), reconnues pour leur production de glycolipides aux propriétés antifongiques in vitro. Pour ce faire, nous avons d'abord généré des transformants GFP et conçu des amorces spécifiques pour chacune des espèces testées. Par la suite, nous avons pu observer ces espèces en conditions naturelles et quantifier leurs populations en temps réel, sur des feuilles saines et infectées par le blanc. Bien que Pseudozyma spp. présentent plusieurs caractéristiques similaires, seulement P. flocculosa a été en mesure de contrôler efficacement le blanc et de croître en sa présence, comme en témoigne l'augmentation constante de sa population, tel qu'observée en qRT-PCR. De tels résultats suggèrent ainsi que la production de glycolipides n'est pas le seul facteur définissant l'activité antagoniste de Pseudozyma spp. en conditions naturelles. De plus, ces résultats soulignent également la nécessité d'avoir recours à des tests in situ pour une juste évaluation du potentiel de lutte biologique d'un champignon ainsi qu'une compréhension exhaustive de son écologie, et ce toujours dans le but d'optimiser l'efficacité d'un agent de lutte biologique potentiel

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La flocculosine est un glycolipide de 854 Da qui a été reconnu responsable de l'activité antagoniste de Pseudozyma flocculosa, un agent de lutte biologique contre le blanc et principe actif du biofongicide Sporodex®. Il a été démontré récemment que cette molécule avait une activité délétère contre plusieurs microorganismes. Or, selon le dernier rapport de l'organisation mondiale de la santé, les maladies infectieuses arrivent toujours au deuxième rang des principales causes de mortalité au monde. De plus, l'apparition croissante de microorganismes résistants aux agents antimicrobiens a considérablement réduit l'efficacité de l'arsenal thérapeutique disponible, ce qui accentue l'urgence du besoin de nouvelles molécules antimicrobiennes. L'objectif général de ce projet était donc d'évaluer le potentiel antimicrobien de la flocculosine afin de préciser son spectre d'activité, d'évaluer sa toxicité, de clarifier son mode d'action et de définir son implication dans l'écologie de P. flocculosa . En conditions acides, la flocculosine a démontré des effets délétères et très rapides contre une vaste gamme d'agents infectieux comprenant levures et bactéries. De plus, la molécule n'a pas été affectée par les divers mécanismes de résistance présents et l'association de la flocculosine avec l'amphotéricine B a révélé un fort synergisme, suggérant son utilisation comme adjuvant afin de réduire la toxicité et de contourner certaines résistances. Par ailleurs, la flocculosine n'a démontré aucune toxicité sur les différentes lignées cellulaires humaines exposées. Il a aussi été démontré que le glycolipide agissait au niveau de la membrane plasmique et que sa spécificité dépendait de la composition de celles-ci. En outre, ces travaux ont permis de révéler un nouveau rôle de la flocculosine dans le pouvoir adaptatif de P. flocculosa, celui de réserve énergétique. Les études de dégradation ont en effet indiqué que le champignon était capable de cataboliser sa toxine à l'aide d'une enzyme dans certaines conditions limitantes. Cela suggère un rôle beaucoup plus étendu que prévu pour la flocculosine; non pas limité à la protection de la niche écologique du champignon mais aussi impliqué au sein de processus énergétiques complexes. Bref, cette étude a démontré le potentiel antimicrobien de la flocculosine tout en jetant un éclairage nouveau sur ses implications biologiques.

Certains agents pathogènes ou cellules tumorales échappent au système immunitaire parce que les cellules immunitaires ne reconnaissent pas les peptides ou protéines présents à leur surface. Les approches thérapeutiques favorisant la reconnaissance de ces peptides ou protéines faiblement immunogènes sont donc très attractives. Pour ainsi forcer l'activation des cellules présentatrices d'antigènes, plusieurs systèmes ont été décrits, à base de liposomes ou de nanoparticules inorganiques. Nous proposons ici d'utiliser un système à base de gouttelettes d'huile. Les micro ou nanogouttelettes d'huile végétale présentent de nombreux avantages par rapport aux microparticules solides inorganiques. Faites de triglycérides naturels, elles sont biocompatibles et biodégradables tout en étant plus robustes que les liposomes. Ce sont des plates-formes idéales pour construire des assemblages multifonctionnels pour la vectorisation. La première partie du projet traite de la synthèse de glycolipides nécessaires pour avoir une reconnaissance des gouttelettes par les lectines présentes dans le système immunitaire (DC-sign). La seconde partie du projet traite de la fabrication des gouttelettes d’huile fonctionnalisées avec les glycolipides précédemment synthétisés et la mise en évidence de leurs interactions avec des lectines. / Some pathogens or tumour cells escape the immune system because the immune cells misrecognize their surface peptides or proteins. Therapeutic approaches, promoting the recognition of these poorly immunogenic peptides or proteins are thus very attractive. The strategy is then to process directly peptides or proteins through cell presentating cells. To this end, some systems have been described, based on liposome or nanoparticles. We propose to use an oil droplet based system. Among the microparticles, vegetal oil microdroplets have numerous advantages over solid microparticles. Made of natural triglycerides, they are biocompatible and biodegradable. They are ideal platforms to build multifunctional assemblies for vectorization. In this project, we aim to design and address lipid (soya oil) droplet to dendritic cells via the lectin DC -sign. The first part deals of the synthesis of glycolipids necessary for the recognition by lectins. The second part presents the fabrication of functionalized oil droplets with previously synthesized glycolipids and their interaction with lectins.