Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / As espermatogônias tronco são células responsáveis pela produção contínua dos gametas masculinos, os espermatozóides. Essas células se diferenciam a partir dos gonócitos, porém, pouco se sabe sobre sua biologia e sobre os processos pelos quais elas se diferenciam. Embora sejam células de grande importância, não há informações precisas sobre a dinâmica de formação dessas células a partir dos gonócitos nem sobre o número total e a distribuição das espermatogônias indiferenciadas nos testículos, o que dificulta a interpretação de estudos nessa área. A proposta deste trabalho foi analisar a proliferação, morte e distribuição dos gonócitos e pré-espermatogônias nos testículos de ratos no desenvolvimento embrionário e pós-natal, em períodos críticos do desenvolvimento testicular. Foram utilizados ratos com idades de 19dpc, 1, 3, 5, 8, 11 e 15dpp, cujos testículos foram analisados quanto à distribuição, proliferação e apoptose dos gonócitos e pré-espermatogônias durante o desenvolvimento testicular. A análise morfológica dos testículos, o método de TUNEL, a imunomarcação das proteínas p53 e caspase-3 clivada foram empregados para investigação de apoptose, enquanto a densidade numérica (Nv), quantificação de gonócitos, densidade de comprimento cordonal (Lv), comprimento cordonal total (L), volume total dos cordões seminíferos e estimativa do número total de gonócitos foram utilizados para investigação da distribuição dessas células. A citometria de fluxo foi empregada para avaliar a proliferação dos gonócitos através do uso do kit Guava Cell Cycle. Para identificar as espermatogônias indiferenciadas nas idades de 11 e 15dpc foi utilizada a imunomarcação da proteína OCT4. Durante a análise morfológica testicular observou-se que ocorre redução do número de gonócitos por seção testicular nos primeiros cinco dias após o nascimento e que as primeiras espermatogônias são observadas aos 8dpp. Foi observado aumento da Lv nos animais de 1dpp em relação aos de 19dpc. Dos 3 aos 11dpp, houve aumento progressivo da Lv, que voltou a diminuir aos 15dpp. Houve crescimento muito acentuado dos cordões seminíferos entre 19dpc e 1dpp. Após o nascimento, o crescimento continuou até os 15dpp, mas foi menos intenso. Já a Nv de gonócitos foi inversamente proporcional ao crescimento testicular, enquanto o número estimado de gonócitos foi cerca de quatro vezes maior aos 1dpp em relação aos de 19dpc. Isto explica os dados obtidos a partir da análise morfológica na qual a frequência de gonócitos por seção testicular diminuiu nos cinco primeiros dias após o nascimento. Após o nascimento, o número de gonócitos permaneceu estável até os 5dpp, sugerindo que não há morte ou proliferação dessas células nessas idades. Não foram detectados gonócitos em apoptose nas idades estudadas, embora corpos apoptóticos tenham sido observados. Esses corpos apoptóticos eram muito raros dos 19dpc aos 5dpp e começaram a se tornar mais frequentes aos 8dpp, atingindo sua frequência máxima aos 15dpp. Também aos 15dpp, células positivas para TUNEL e caspase 3 clivada foram observadas, mas essas células não puderam ser identificadas devido ao fato de sua morfologia já estar consideravelmente alterada. Contudo, todos os gonócitos de 19dpc até 8dpp foram positivos ao emprego da caspase-3 clivada, embora apresentassem morfologia normal. Isto indica que a caspase-3 clivada pode ter outra função, que não seja apoptótica, no desenvolvimento dos gonócitos. A análise ao citômetro de fluxo nas idades de 19dpc a 5dpp mostrou que mais da metade dos gonócitos encontravam-se em fase G0/G1 do ciclo celular, indicando que muitas estão em quiescência nestas idades. Não houve marcação da proteína OCT4 nas espermatogônias, o que impossibilitou a quantificação dessas células nas idades de 8, 11 e 15dpp. Os dados do presente estudo sugerem que a diminuição da frequência de gonócitos por seção testicular nos primeiros dias após o nascimento não é consequência de apoptose dessas células, como tem sido sugerido na literatura, mas sim de sua redistribuição ao longo dos cordões seminíferos. Como não há indícios de que estas células estejam proliferando nessas idades, menos gonócitos são observados por seção testicular. Concluiu-se ainda que a proteína OCT4 não está presente nos testículos de rato nas idades pós-natais, diferentemente do observado em camundongo. Estudos estão sendo realizados para verificar quando os gonócitos retomam a proliferação, quando a população definitiva de espermatogônias tronco é formada e quais seriam os marcadores ideais para estudos das espermatogônias indiferenciadas no rato. / Spermatogonial stem cells (SSC) are responsible for the constant production of the male gamete. These cells differentiate from the gonocytes, but little is known about its biology and about the mechanisms of their differentiation. Despite the importance of these cells, the information about the dynamic of formation of these cells from the gonocytes or about the total number and distribution of the undifferentiated spermatogonia is not precise, causing problems to the interpretation of the studies in this area. The goal of this study was to analyze the proliferation, death and distribution of the gonocytes and pre-spermatogonia in the rat testis in embryonic and postnatal life. Rat testes were collected at 19dpc and at 1, 3, 5, 8, 11 and 15dpp for the analysis of the distribution, proliferation and apoptosis of the gonocytes and pre-spermatogonia during key periods of testicular development. To investigate gonocyte apoptosis, four methods were used: morphological analysis, TUNEL method and immunostaining of p53 and cleaved caspase 3. The number of gonocytes was investigated using the numerical density (Nv) and an estimative of the total number of these cells was obtained. These data were associated with the seminiferous cord length density (Lv), the total cordonal length (L) the total volume of the seminiferous cords and the total estimated number of gonocytes were used to investigate the distribution of these cells. Guava flow citometry was used to evaluate the proliferation of the gonocytes. To identify the undifferentiated spermatogonia at 11 and 15dpp, OCT4 labeling was used. During testicular morphological analysis it was observed a reduction of the number of the gonocytes per testicular section during the first five days after birth and the first spermatogonial cells were seen at 8dpp. The Lv increased in the 1dpp rats in relation to 19dpc rats. From 3 to 11dpp, Lv increased progressively and subsequently decreased at 15dpp. There was very accentuated growth of the seminiferous cords (L) between 19dpc and 1dpp. The growth progressed until 15dpp, although it was less intense. The gonocyte Nv was inversely proportional to the seminiferous cord growth, while the total estimated number of gonocytes was about four times higher at 1dpp in relation to the 19dpc embryos. This explains the data obtained from morphological analysis, in which the frequency of gonocytes per testicular section decreased in the first days after birth. The number of gonocytes remained stable from 1 to 5dpp, suggesting that the gonocytes do not die or proliferate in this period. Apoptotic gonocytes were not detected in all ages, although apoptotic bodies were observed. These apoptotic bodies were rare between 19dpc and 5dpp, and at 8dpp they became more frequent, and reached the highest frequency at 15dpp. Also at 15dpp, TUNEL positive-cells and cleaved caspase3-positive cells were observed, although these cells could not be indentified due to the fact that their morphology was already changed. Nevertheless, all gonocytes between 19dpc and 8dpp were positive to cleaved caspase-3, although they presented normal morphology. This suggests that cleaved caspase-3 could have other function that not apoptotic in gonocytes development. The flow citometry analysis between 19dpc and 5dpp showed that more than half of the gonocytes was at G0/G1 phase of the cell cycle, proving that lots of them are quiescent in these ages. There were no OCT4-positive spermatogonia, what impaired the quantification of these cells at 8, 11 and 15dpp. The data of this study suggest that the decrease in the frequency of gonocytes per testicular section in the first days after birth is not due to apoptosis, as has been suggested in the literature, but rather to their redistribution throughout the seminiferous cords. Since there is no evidence that these cells are proliferating in these ages, less gonocytes are seen per testicular section. It has also been concluded that OCT4 protein is not present in rat testis in postnatal ages, differing from what is observed in the mouse testis. Further studies are been performed to verify when gonocytes resume its proliferation, when the final SSC population is established and which markers could be useful to study undifferentiated spermatogonia in the rat. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第19243号 / 農博第2140号 / 新制||農||1036(附属図書館) / 学位論文||H27||N4947(農学部図書室) / 32242 / 京都大学大学院農学研究科応用生物科学専攻 / (主査)教授 今井 裕, 教授 祝前 博明, 教授 松井 徹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Orientador: Rejane Maira Goes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T18:19:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinto_MariaEtelvina_D.pdf: 7979906 bytes, checksum: 0558bfd8fbc931f0f8dfcc8ad0957763 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O gerbilo da Mongólia (Meriones unguiculatus) tem sido utilizado de maneira crescente em estudos sobre o sistema genital masculino. Alguns aspectos da espermatogênese e o ciclo do epitélio seminífero dessa espécie são conhecidos, mas investigações sobre o desenvolvimento pós-natal do testículo e diferenciação das suas principais populações celulares são incipientes. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar os eventos envolvidos com a diferenciação das células germinativas e de Leydig durante o desenvolvimento pós-natal, estabelecer o período de maturação testicular, e descrever a dinâmica das populações de células de Leydig do nascimento à senilidade. Foram utilizados gerbilos machos com 1-6 dias, 1-8 semanas, 3 e 18 meses de idade. Os diferentes tipos celulares foram identificados com base em microscopia de luz de alta resolução, microscopia eletrônica de transmissão e imunocitoquímica para marcadores específicos da linhagem germinativa (VASA) e das células de Leydig adultas (enzimas 3ß-hidroxiesteróide desidrogenase - 3ß-HSD e 11ß-hidroxiesteróide esteróide desidrogenase 1- 11ß-HSD1). Reações imunocitoquímicas para o receptor de andrógeno (AR), para o marcador de células em proliferação (PCNA) e técnica para marcação de células apoptóticas (TUNEL), bem como análises estereológicas dos componentes testiculares e determinação dos níveis séricos de testosterona e estrógeno também foram efetuadas. O processo de migração dos gonócitos para a membrana basal no gerbilo se estende até a segunda semana pós-natal, sendo seguido da sua rápida diferenciação em proespermatogonias. Diferentemente de outros roedores, os eventos relativos à maturação dos gonócitos e sua diferenciação em células da linhagem espermatogonial é mais longo, ocorrem assincronicamente entre os cordões seminíferos e estão associados à perda de sensibilidade ao andrógeno. O desenvolvimento da população de células de Leydig adultas (CLA) envolve quatro estágios progressivos de maturação: as células de Leydig adultas progenitoras, as recém-formadas, as imaturas e as maduras, as quais surgiram, respectivamente com duas, quatro, cinco e seis semanas de idade. As células de Leydig adultas maduras exibem núcleo excêntrico e irregular e um canalículo citoplasmático perinuclear. Também apresentam heterogeneidade funcional em relação à expressão do AR e da enzima 11ß-HSD1. As mudanças que ocorrem no insterstício testicular do gerbilo durante o desenvolvimento pós-natal são muito similares às encontradas em outros roedores, no entanto, o número de células de Leydig fetais permanece constante até a senilidade. Adicionalmente, o surgimento e aumento da população de células de Leydig adultas ocorrem mais tardiamente em relação a outros roedores. A análise histológica indicou que a maturidade testicular no gerbilo ocorre por volta da décima segunda semana de idade. Os níveis séricos de testosterona aumentaram expressivamente a partir da sexta semana de idade, enquanto os de estrógeno permaneceram constantes até a décima segunda semana de idade. Nos animais senis houve uma queda acentuada de ambos os hormônios. O comprometimento da síntese de esteróides nesse último período decorre do prejuízo funcional das CLA. O presente estudo fornece um panorama abrangente do desenvolvimento testicular do gerbilo da Mongólia, ampliando o conhecimento sobre a biologia reprodutiva dessa espécie e proporcionado os fundamentos para o desenvolvimento de estudos experimentais. / Abstract: The Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) has been increasingly used with studies on the male genital system. Some aspects of spermatogenesis and the seminiferous epithelium cycle of this species are known, but investigations about the postnatal development of testis and differentiation of the main cell populations are incipient. The objective of this study was to evaluate the events involved in differentiation of germ cells and Leydig cells during postnatal development, establish the period of testicular maturation, and describe the dynamics of Leydig cells population from birth to senility. Male gerbils were used with 1-6 days, 1-8 weeks, 3 and 18 months of age. The different cell types were identified based on light microscopy, high-resolution transmission electron microscopy and immunocytochemistry for specific markers of germ line (VASA) and adult Leydig cells (enzyme 3 ß-hydroxysteroid dehydrogenase - 3 ß-HSD and 11 ß- hydroxysteroid steroid dehydrogenase 1 - 11 ß-HSD1). Reactions observed for the androgen receptor (AR), for cell proliferation marker (PCNA), technique for marking apoptotic cells (TUNEL), stereological analysis of testicular components and determination of serum levels of testosterone and estrogen were also made. The process of gonocytes migration to the basement membrane in the gerbil extends to the second postnatal week, being followed by their rapid differentiation to proespermatogonia. Unlike other rodents, the events on the gonocytes maturation and differentiation into espermatogonial cell lineage are longer, occur asynchronously between the seminiferous cords and are associated with loss of sensitivity to androgen. The development of the adult Leydig cells (ALC) population involves four progressive stages of maturation: the adult Leydig cell progenitor, newly formed, immature and mature, which appeared respectively with two, four, five and six weeks of age. Mature ALC exhibit irregular and eccentric nuclei and a perinuclear cytoplasmic canaliculus. Also present functional heterogeneity in expression of AR and the enzyme 11 ß-HSD1. The changes occurring in gerbil testicular insterstitium during postnatal development are very similar to those found in other rodents, however, the number of fetal Leydig cells remains constant until senility. Additionally, the emergence and increase of ALC population occur later in relation to other rodents. Histological analysis indicated that the testicular maturity in the gerbil occurs around the twelfth week of age. Serum levels of testosterone significantly increased from the sixth week of age, while the estrogen remained constant until the twelfth week of age. In senile animals there were a sharp fall of both hormones. The impairment of the steroid synthesis in this last period comes from the functional injury of the CLA. This study provides a comprehensive overview of the testicular development of the Mongolian gerbil, expanding knowledge about the reproductive biology of this species and providing the foundation for the development of experimental studies. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural