Dans la cellule hôte, Toxoplasma gondii se développe dans une vacuole parasitophore (VP) caractérisée par un réseau de nanotubes membranaires (RNM) dont la composition, le mécanisme de formation et la fonction sont obscures. Quelques protéines GRA, dont GRA2 et GRA6, sont sécrétées dans la VP à partir des granules denses puis ciblées au RNM. Cette localisation s'accorde avec l'hélice alpha-hydrophobe de GRA6 et les hélices alpha-amphipathiques de GRA2. Avant et après sécrétion dans la VP, les protéines GRA sont partiellement solubles. Le phénotype de parasites délétés de leur(s) gène(s) GRA2 et/ou GRA6 révèle que ces 2 protéines sont indispensables à la formation du RNM. J'ai montré 1) qu'avant leur insertion dans les membranes de la VP, la solubilité des protéines GRA est préservée grâce à des interactions hydrophobes avec peut être, des micelles de l'espace vacuolaire ; 2) que GRA12, une nouvelle protéine du RNM, n'interagit pas avec GRA2 dans ces membranes. 3) que l'adressage spécifique de GRA6 au RNM est déterminé par son domaine N-terminal hydrophile. 4) J'ai montré que GRA2 recombinante a une affinité pour le phosphatidyl inositol (4, 5) diphosphate avec lequel elle interagit via ses hélices alpha-amphipathiques. GRA2 déforme des liposomes de courbure membranaire importante pour générer de courts tubules membranaires. La tubulation est accentuée par GRA6 qui s'associe aux liposomes, quelque soit leur diamètre. Ces résultats valident le rôle direct de GRA2 et GRA6 dans la formation du RNM et laissent envisager un modèle de sa formation, dans lequel GRA6 favoriserait l'assemblage de vésicules lipidiques que GRA2 fusionnerait en tubules membranaires.

Dans la cellule hôte, Toxoplasma gondii se développe dans une vacuole parasitophore (VP) caractérisée par un réseau de nanotubes membranaires (RNM) dont la composition, le mécanisme de formation et la fonction sont obscures. Quelques protéines GRA, dont GRA2 et GRA6, sont sécrétées dans la VP à partir des granules denses puis ciblées au RNM. Cette localisation s'accorde avec l'hélice alpha-hydrophobe de GRA6 et les hélices alpha-amphipathiques de GRA2. Avant et après sécrétion dans la VP, les protéines GRA sont partiellement solubles. Le phénotype de parasites délétés de leur(s) gène(s) GRA2 et/ou GRA6 révèle que ces 2 protéines sont indispensables à la formation du RNM. J'ai montré 1) qu'avant leur insertion dans les membranes de la VP, la solubilité des protéines GRA est préservée grâce à des interactions hydrophobes avec peut être, des micelles de l'espace vacuolaire ; 2) que GRA12, une nouvelle protéine du RNM, n'interagit pas avec GRA2 dans ces membranes. 3) que l'adressage spécifique de GRA6 au RNM est déterminé par son domaine N-terminal hydrophile. 4) J'ai montré que GRA2 recombinante a une affinité pour le phosphatidyl inositol (4, 5) diphosphate avec lequel elle interagit via ses hélices alpha-amphipathiques. GRA2 déforme des liposomes de courbure membranaire importante pour générer de courts tubules membranaires. La tubulation est accentuée par GRA6 qui s'associe aux liposomes, quelque soit leur diamètre. Ces résultats valident le rôle direct de GRA2 et GRA6 dans la formation du RNM et laissent envisager un modèle de sa formation, dans lequel GRA6 favoriserait l'assemblage de vésicules lipidiques que GRA2 fusionnerait en tubules membranaires. / Within the host cell, Toxoplasma gondii multiplies in a parasitophorous vacuole (PV) characterized by a membranous nanotubular network (MNN). Its components, the mechanism of its formation and its function remain unknown. A few GRA proteins, including GRA2 and GRA6, are secreted from the dense granules into the PV and are targeted to the MNN. This location is in agreement with the hydrophobic alpha-helix predicted in GRA6 and with the GRA2 amphipatic alpha-helices. However, before and after their secretion in the PV, the GRA proteins are partially soluble. The phenotypic analysis of parasites deleted from their GRA2 and/or GRA6 gene(s) had shown that both these proteins are indispensable for MNN formation. During my thesis, I showed that before their insertion into the PV membranes, the GRA proteins solubility is preserved by establishing hydrophobic interactions, likely with micelles in the PV space. I also showed that GRA12, a novel MNN-associated protein, does not interact with GRA2 within these membranes. Using GRA6 as a model of study, I contributed to demonstrate that the GRA6 specific targeting to the MNN relies on its N-terminal hydrophilic domain. I demonstrated that recombinant GRA2 recognizes inositol (4, 5) biphosphate with which it interacts via its amphipatic alpha-helices. GRA2 deforms liposomes of steep membrane curvature into short membranous tubules. The tubulation is increased by GRA6 which associates with liposomes independently of their diameter. These results validate the direct role of both GRA2 and GRA6 in MNN formation and led us to propose a model in which GRA6 would tether vesicles, the fusion of which would be induced by GRA2.

Parmi les mécanismes de survie intracellulaire connus, l'export de protéines solubles ou transmembranaires visant à modifier différents compartiments de la cellule-hôte est une stratégie employée par de nombreux pathogènes. Chez Toxoplasma gondii, il a été montré que les granules denses (GD) constituent la voie de sécrétion par défaut pour les protéines solubles. Par contre, le tri de protéines transmembranaires vers les GD et leur maintien sous forme soluble avant insertion membranaire post-sécrétoire font appel à des mécanismes originaux qui ont fait l'objet de ces travaux.<br />Chez le Toxoplasme, la protéine de GD GRA5 est adressée à la membrane de la vacuole parasitophore (MVP) après sécrétion. Exprimée en cellules de mammifères, GRA5 est adressée à la membrane plasmique avec une topologie de type I, ce qui démontre la particularité des mécanismes de sécrétion chez T. gondii. Par une approche basée sur des protéines chimériques présentant des domaines spécifiques de GRA5 et d'une protéine transmembranaire de la membrane plasmique parasitaire (MPP), nous avons pu identifier les déterminants de l'adressage à la MPP versus à la MVP. Nous avons ainsi pu démontrer que le domaine Nt de GRA5 est impliqué dans l'adressage soluble aux GD et est essentiel pour l'insertion membranaire post-sécrétoire dans la MVP. Ces résultats, qui ont été étendus à une autre protéine GRA transmembranaire (GRA6), divergent de l'idée largement répandue selon laquelle les signaux d'adressage des protéines transmembranaires seraient présents dans la queue C-terminale et/ou dépendraient de la longueur du domaine transmembranaire de ces protéines.

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire responsable de la toxoplasmose. Lors de l’infection aiguë, le parasite se divise dans une vacuole parasitophore (VP), compartiment d’interactions avec la cellule hôte. La VP se modifie pour former un kyste qui persiste au cours de la phase chronique. Le rôle des protéines de granules denses (GRA) dans ce processus est suggéré par leur abondance dans la VP et la paroi kystique. Par des approches de génétique inverse et de protéomique, le but de ce travail visait à préciser au plan moléculaire, le rôle de la protéine GRA5. En utilisant un modèle de différenciation parasitaire in vitro, l’étude des phénotypes d’un mutant invalidé du gène gra5 a permis de découvrir son rôle clé dans la formation des kystes par le maintien 1/ de l’intégrité de la membrane délimitant la VP en cours de différenciation, 2/ de l’accumulation d’autres composants parasitaires dans la VP et 3/ de son interaction avec le reticulum endoplasmique de l’hôte. / Toxoplasmosis, which is caused by the intracellular parasite Toxoplasma gondii is characterized by a life-long chronic infection. The parasites replicate inside a parasitophorous vacuole (PV), which evolves into a persistent cyst. The molecular mechanisms governing the differentiation process are poorly characterized. It is known that the dense granules proteins (GRA) are major components of both the PV and the cyst wall, enabling their interaction with the host cells. Using a Prugniaud cystogenic type II strain in which the gra5 gene was invalidated and a combination of cellular and proteomic approaches, we discovered that GRA5 regulates i) the molecular content of the PV, ii) the PV interaction with the host endoplasmic reticulum and iii) host cell homeostasis,that is necessary to ensure the formation of a stable cyst wall.