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Caracterização in situ da resposta imune granulomatosa à Leishmania braziliensis em lesões dérmicas crônicas no primata Macaca mulattaLemos, Camila Souza January 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Para desvendar a fisiopatologia da leishmaniose humana, é necessário um
melhor entendimento de como a Leishmania é capaz de sobreviver por anos em
granulomas imunologicamente ativos. Neste estudo, utilizamos o modelo de
infecção macaco Rhesus-Leishmania braziliensis (Macaca mulatta) de
leishmaniose cutânea (LC), como um meio de avaliar a utilidade do sistema
primata no estudo da resposta inflamatória crônica granulomatosa desenvolvida
pelo hospedeiro tanto na forma auto-resolutiva quanto na forma persistente da
doença. Nossos achados reforçam a noção de que existe uma interação entre o
sistema imune do hospedeiro e a capacidade patogênica do parasita no
resultado clínico da infecção por Leishmania. De acordo com os casos
documentados de LC em humanos induzida por L.braziliensis, as infecções
experimentais neste modelo induzem a célula “T-helper” tipo 1 (Th1) mediando-a
inflamação e levando a formação de granulomas bem organizados, consistindo
de todos os tipos celulares específicos encontrados nos granulomas humanos.
Nós mostramos que os leucócitos polimorfonucleares são decisivos para
controle do parasita nos eventos iniciais da inflamação in vivo. Ademais,
fagócitos mononucleares que fagocitam granulócitos apoptóticos parasitados
parecem ser a chave principal no estabelecimento da infecção nos macacos. A
formação do granuloma verificada nos animais é direcionada por diversos
mediadores inflamatórios que são importantes para o desenvolvimento das
células Th1 e da função de macrófagos efetores. A análise cinética da resposta
inflamatória revelou variados marcadores fenotípicos de células positivas para
CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, Foxp3 e HLA-DR. Digno de nota, agregados de
células B CD20+ foram encontrados na lesão crônica, o qual serve como um
substrato morfológico para orquestrarem ou modularem o desenvolvimento da
resposta duradoura na infecção persistente. Nossos achados indicam que
ambos os subgrupos de células regulatórias CD4 Foxp3+ e Foxp3- expressando
interleucina-10 previne a erradicação da L. braziliensis da pele inflamada, desse
modo, suprimindo uma eventual resposta curativa em macacos com LC
persistente. Esses resultados apontam a viabilidade do uso desse modelo para
elucidar, totalmente, os mecanismos moleculares das células t regulatórias
mediadoras da supressão na resposta imune efetora, resultando assim o
crescimento descontrolado do granuloma durante a leishmaniose, o que é
necessário ser considerado em qualquer estratégia proposta para o controle
terapêutico dessa importante doença inflamatória. / In order to unravel the physiopathology of leishmaniasis in humans, it is
necessary to better understand how Leismania are able to survive for years
within immunologicallyactive granulomas. In the present study, we used a
Leishmania braziliensis-macaque (Macaca mulatta) infection model of cutaneous
leishmaniasis (CL) as a means of assessing the usefulness of this primate
system to study the host inflammatory granulomatous response involved in both
healing and non-healing forms of the disease. Our findings reinforce the notion
that an interplay exists between the host immune system and the pathogenic
capability of the parasite in the clinical outcome of leishmanial infection.
Consistent with documented cases of human L. braziliensis CL, experimental
infections induced a T-helper cell type 1 (Th1)-mediated inflammation leading to
the formation of well organized granulomas, consisting of all the specific cell
types found within human granulomas. We provide evidence that
polymorphonuclear neutrophil leukocytes are decisive for parasite containment
by early inflammatory events in vivo. Furthermore, scavenger mononuclear
phagocytes engulfing most of the parasite-laden apoptotic granulocytes are likely
to be key players in establishing the infection in macaques. We show that
granuloma formation in macaques is orchestrated by diverse inflammatory
mediators that are important for Th1-cell development and macrophage effector
functions. A kinetic analysis of the inflammatory response revealed marked
variation in the number of positive cells for CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, Foxp3,
and HLA-DR phenotypes. Of note, CD20+ dense B-cell aggregates were found in
chronic lesions, which might serve as a morphological substrate for the
orchestration of the enduring host response to persistent infection. Our findings
indicate that both Foxp3+ and Foxp3- CD4+ regulatory T-cell (Treg) subsets
expressing interleukin-10 might prevent clearance of L. braziliensis from the
inflamed skin, thereby eventually suppressing the healing response in macaques
with long-standing CL. These results point to the feasibility of using this model to
fully elucidate the molecular mechanisms of Treg-mediated suppression leading
to the uncontrolled growth of granulomas occurring in leishmaniasis, which will
need to be considered in any strategy designed for therapeutic control of this
important inflammatory disease.
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Efeito do interferon-gamma sobre defeitos de \"splicing\" que levam à doença granulomatosa crônica ligada ao cromossomo X. / Interferon-gamma effect on splicing defects that cause chronic granulomatous disease linked to X chromosome.Josias Brito Frazão 06 April 2009 (has links)
Os fagócitos contêm uma nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase associada à membrana, que gera superóxido e outros reativos intermediários do oxigênio. Defeitos nesta oxidase em seres humanos resultam na doença granulomatosa crônica (DGC). Mutações próximas aos sítios de splicing que interferem com o processamento do RNA mensageiro, acarretando deleção de um ou mais exons, são cada vez mais freqüentes na literatura científica, nesses casos, os mecanismos moleculares que levam a DGC nem sempre são totalmente esclarecidos, assim como o efeito do IFN-g, seja sobre o processamento da mensagem ou estabilidade dos transcritos. Com base nessas informações o objetivo geral deste trabalho é investigar o efeito do IFN-g sobre a regulação do sistema NADPH oxidase fagocítico humano. Através dos resultados obtidos, não se pode constatar melhora na produção de ânions superóxido após o tratamento com IFN-g em pacientes com defeito de splicing, no entanto detectou-se aumento da expressão do gene CYBB através de PCR convencional e através de real-time PCR além de um aumento na marcação de proteínas do spliceossoma através do FAN. / Phagocytes have a nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase (NADPH) associated to plasmatic membrane that generates superoxide and other oxygen reactive intermediates. Defects on this oxidase in humans result in a disorder called Chronic Granulomatous Disease (CGD). Mutations next to splicing sites that interfere with the mRNA processing leading to deletion of one or more exons, are even more frequent on scientific literature, in these cases, the molecular mechanisms causing CGD are not always completetly clear, as well as the effect of IFN-g on the mRNA processing or on the stability of transcripts. Based on this information our aim is to investigate the effect of IFN-g on the regulation of the human NADPH oxidase phagocyte system.. With the obtained results it wasnt possible to see an increase in anion superoxide production after the IFN-g treatment in patients with splicing defects, however it was detected an increase on the expression of CYBB gene by conventional and real-time PCR besides an increase in the marking of spliceossomal proteins by FAN.
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Efeito do IFN-k e TNF-α sobre a expressão gênica de CYBB e processamento de seus transcritos. / The effect of IFN-g and TNF-α on CYBB gene expression and its transcripts processing.Josias Brito Frazão 19 March 2014 (has links)
O sistema NADPH oxidase humano é responsável pela geração de reativos intermediários do oxigênio e defeitos neste sistema resultam na Doença Granulomatosa Crônica (DGC). Nesta tese de doutorado, investigamos o efeito do IFN-g sobre eventos pós-transcricionais em pacientes com DGC ligada ao X, ocasionada por defeitos de splicing. Os dados obtidos sugerem que o uso do IFN-g in vitro interfere no processamento da mensagem causando aumento da expressão de transcritos do gene CYBB e NCF1 em células B-EBV de indivíduos sadios e pacientes DGC analisados. Observamos também que o IFN-g dimunui a expressão dos genes THOC4 NONO, SF3A1, SRRM1 e UPF3A e promove aumento de expressão de SRSF10, SNRPA1 e C2 em células B-EBV de paciente X-DGC secundária a defeitos de splicing. Identificamos que o IFN-g e o TNF-α aumentam a expressão das proteínas envolvidas no processo do splicing. Concluímos que o IFN-g aumenta a expressão de genes importantes para uma resposta eficiente do sistema imunológico, incluindo os do sistema NADPH oxidase, além de promover aumento da expressão de genes e de proteínas relacionados ao processo de splicing, que podem estar relacionados aos efeitos benéficos observados no uso do IFN-g em pacientes com DGC ligada ao X, ocasionada por defeitos de splicing. / The human phagocyte NADPH oxidase is responsible for the generation of reactive oxygen intermediates and defects in this system result in Chronic Granulomatous Disease (CGD). In this PhD Thesis, we investigated the effect of IFN-g on post-transcriptional events in normal individuals and patients with X-linked CGD, caused by splicing defects. The obtained data suggests that the use of IFN-g in vitro interferes in the message processing causing an increase of expression of CYBB and NCF1 gene transcripts in B-EBV cells of healthy individuals and analyzed CGD patients. We also observed that IFN-g decreases the expression of THOC4, NONO, SF3A1, SRRM1 and UPF3A, and increases the expression of SRSF10, SNRPA1 and C2 genes in cells from X-CGD patients, due to splicing defects. We identified that IFN-g and TNF-α induce expression of proteins involved in the splicing process. We conclude that IFN-g increases the expression of important genes for an effective immune response, including the NADPH oxidase system genes, and promotes augment of gene and protein expression related to the splicing process, which may be related to the beneficial effects related to the use of IFN-g in CGD patient caused by splicing defects.
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Caracterização clínica e genética de pacientes brasileiros com doença granulomatosa crônica e susceptibilidade mendeliana a infecções por micobactérias / Clinical and Genetic Characterization of Brazilian Patients with Chronic Granulomatous Disease and Mendelian Susceptibility to Mycobacterial DiseaseZurro, Nuria Bengala 29 November 2018 (has links)
Dentre pacientes com imunodeficiências primárias, existem aqueles com defeitos de fagócitos e outros componentes da imunidade inata. A doença granulomatosa crônica (DGC) é uma imunodeficiência primária (IDP) causada por mutações em um dos componentes protéicos, gp91-phox, p22-phox, p47-phox, p67-phox e p40-phox, da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) dos fagócitos. Pacientes com DGC apresentam maior susceptibilidade a infecções, assim como hiperinflamação e reação adversa à vacinas como à do Bacilo Calmette-Guérin (BCG), como consequência da atividade microbicida defeituosa dos fagócitos. Por outro lado, a susceptibilidade mendeliana a micobactérias (MSMD) é uma condição que predispõe os pacientes a infecções pelo gênero Mycobacterium sp, levando a infecções graves e por vezes à morte. O objetivo deste trabalho foi realizar o diagnóstico clínico e a análise genético-molecular de pacientes brasileiros com DGC e MSMD. A explosão respiratória de granulócitos foi avaliada pelo ensaio de dihidrorodamina (DHR). A dosagem de citocinas do eixo IL-12/IFN-γ foi realizada mediante o ensaio de ELISA após estimulo com lisado de micobactérias (LM), proteína purifica (PPD) e BCG. O DNA genômico dos pacientes foi extraído, amplificado e sequenciado pelo método de Sanger e seqüenciamento completo de exoma. Durante o período de 2014-2018, 181 pacientes com histórico clínico sugestivo de DGC e 75 pacientes com diagnóstico sugestivo de MSMD foram encaminhados ao nosso laboratório. Após avaliação clínica e bioquímica dos pacientes, 23 deles foram diagnosticadas com DGC e 16 com MSMD. A análise genético-molecular permitiu identificar mutações em 14 pacientes com DGC, nove deles com DGC ligada ao cromossomo X (DGC-X) e 5 com DGC autossômica recessiva (DGC-AR). Identificamos mutações em 5 pacientes com MSMD, sendo três delas no receptor de IL-12 e duas no receptor da IL-17. / Among patients with primary immunodeficiencies, there are those with defects in phagocytes and other components of the innate immunity. Chronic granulomatous disease (CGD) is a primary immunodeficiency (PID) caused by mutations in one of the protein components, gp91-phox, p22-phox, p47-phox, p67-phox and p40-phox of the Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADPH) oxidase of phagocytes. Patients with CDG are susceptible to infections, as well as hyperinflammation and adverse reactions to vaccines such as Bacilo Calmette-Guérin (BCG) as a consequence of defective phagocytes microbicidal activity. On the other hand, Mendelian susceptibility to mycobacterial diseases (MSMD) is a condition that predisposes patients to infections by the genus Mycobacterium sp , leading to serious infections and sometimes death. The main goal of this study was to perform the clinical diagnosis and genetic-molecular analysis of Brazilian patients with CDG and MSMD. The respiratory burst of granulocytes was evaluated by the dihydrorhodamine (DHR) assay. Cytokine dosing of IL-12 / IFN-γ axis was performed by the ELISA assay after stimulation with mycobacterium lysate (LM), purified protein (PPD) and BCG. Patients genomic DNA was extracted, amplified and sequenced by the Sanger method and whole exome sequencing. During the period of 2014 to 2018, 181 patients with a clinical history suggestive of CDG and 75 patients with a diagnosis suggestive of MSMD were referred to our laboratory. After clinical and biochemical evaluation, 23 of them were diagnosed with CDG and 16 with MSMD. Genetic-molecular analysis allowed the identification of mutations in 14 patients with CDG, of those 9 had X-linked DGC (X-CGD) and 5 had autosomal recessive CGD (AR-CGD). Mutations were identified in 5 MSMD patients, three in the IL-12 receptor and two in the IL-17 receptor.
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Uma nova abordagem para o estudo dos defeitos genético-moleculares da doença granulomatosa crônica e análise de suas relações genótipo-fenótipo. / A new approach to study of molecular-genetic defects of chronic granulomatous disease and analysis of its genotype-phenotype relationships.Oliveira Júnior, Edgar Borges de 30 September 2010 (has links)
A Doença Granulomatosa Crônica é uma imunodeficiência grave e rara, na qual os quadros infecciosos por bactérias e fungos, ocorrem predominantemente nas barreiras naturais do organismo. O defeito reside em mutações em um dos componentes do sistema NADPH oxidase. O dHPLC mostrou-se mais sensível que o SSCP, sendo eficaz na detecção de alterações em 100% dos casos. Identificamos sete mutações diferentes no gene CYBB, sendo quatro delas inéditas. São elas R226X; R290X; e C537R. Dentre as mutações inéditas identificamos: T302fsX46; c.141 +5 G> T; C185R; e H222L. Identificamos a mutação V25fsX51 no gene NCF1 em duas pacientes. Estabelecemos uma correlação entre genótipo e fenótipo clínico baseado em manifestações clínicas relevantes na DGC, nos fornecendo dados importantes de cada manifestação clínica e um índice de gravidade clínica (IGC) para cada tipo de mutação. Os resultados contribuem para a construção de estratégias que permitam a identificação dos defeitos genético-moleculares relacionados à DGC. / Chronic granulomatous disease is a primary immunodeficiency characterized by recurrent and severe infections, affecting the body barriers. In these patients, phagocytes present a failure in the respiratory burst caused by a deficiency of the NADPH oxidase system, and a microbicidal defect. Mutations affecting one of the components of the NADPH oxidase system. The dHPLC proved to be more sensitive to the SSCP, being effective in detecting changes in 100% of cases. We found seven different mutations, four of which are original. Are they R226X; R290X; and C537R. Among the unpublished mutations identified: T302fsX46; c. 141 + 5 G > T; C185R; and H222L. We identify the gene mutation V25fsX51 NCF1 in two patients. We have established a correlation between genotype and phenotype clinical relevant clinical manifestations based on DGC in providing important data from each clinical and clinical severity index (CSI) for each type of mutation. The results contribute to the construction of strategies enabling the identification of molecular genetic defects related to CGD.
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Uma nova abordagem para o estudo dos defeitos genético-moleculares da doença granulomatosa crônica e análise de suas relações genótipo-fenótipo. / A new approach to study of molecular-genetic defects of chronic granulomatous disease and analysis of its genotype-phenotype relationships.Edgar Borges de Oliveira Júnior 30 September 2010 (has links)
A Doença Granulomatosa Crônica é uma imunodeficiência grave e rara, na qual os quadros infecciosos por bactérias e fungos, ocorrem predominantemente nas barreiras naturais do organismo. O defeito reside em mutações em um dos componentes do sistema NADPH oxidase. O dHPLC mostrou-se mais sensível que o SSCP, sendo eficaz na detecção de alterações em 100% dos casos. Identificamos sete mutações diferentes no gene CYBB, sendo quatro delas inéditas. São elas R226X; R290X; e C537R. Dentre as mutações inéditas identificamos: T302fsX46; c.141 +5 G> T; C185R; e H222L. Identificamos a mutação V25fsX51 no gene NCF1 em duas pacientes. Estabelecemos uma correlação entre genótipo e fenótipo clínico baseado em manifestações clínicas relevantes na DGC, nos fornecendo dados importantes de cada manifestação clínica e um índice de gravidade clínica (IGC) para cada tipo de mutação. Os resultados contribuem para a construção de estratégias que permitam a identificação dos defeitos genético-moleculares relacionados à DGC. / Chronic granulomatous disease is a primary immunodeficiency characterized by recurrent and severe infections, affecting the body barriers. In these patients, phagocytes present a failure in the respiratory burst caused by a deficiency of the NADPH oxidase system, and a microbicidal defect. Mutations affecting one of the components of the NADPH oxidase system. The dHPLC proved to be more sensitive to the SSCP, being effective in detecting changes in 100% of cases. We found seven different mutations, four of which are original. Are they R226X; R290X; and C537R. Among the unpublished mutations identified: T302fsX46; c. 141 + 5 G > T; C185R; and H222L. We identify the gene mutation V25fsX51 NCF1 in two patients. We have established a correlation between genotype and phenotype clinical relevant clinical manifestations based on DGC in providing important data from each clinical and clinical severity index (CSI) for each type of mutation. The results contribute to the construction of strategies enabling the identification of molecular genetic defects related to CGD.
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