The type 1 insulin-like growth factor receptor (lGF-1 R) plays a significant role in tumor growth and spread, and IGF-1 R inhibitors and antibodies are now undergoing clinical testing. However, factors that regulate sensitivity to IGF-1 R inhibition remain unclear. The aim of this project is to identify proteins whose depletion regulates sensitivity to IGF-1 R inhibition, in order to design effective combination treatments to benefit patients. An IGF-1 R kinase inhibitor, AZ12253801 (provided by AstraZeneca) was able to block IGF-induced phosphorylation of IGF-1 R in DU145 prostate cancer and MCF-7 breast cancer cells, inhibited downstream signalling in DU145 cells, and also inhibited proliferation and cell survival of both cell lines. AZ12253801 was used in an unbiased siRNA screen in both cell lines, using two s'iRNA libraries (779 kinase-related Kinome and 230 DNA repair-associated siRNAs). Eight Kinome and five DNA repair-associated hits have been identified after primary and second round screens, and further validated. The strongest hit was dishevelled homolog 3 (DVL3), a member of the WNT signalling pathway, which is highly expressed in both cell lines. DVL3 silencing caused reduction in active l3-catenin and inactivated the mTOR pathway, consistent with previous studies, and did not affect IGF-1 Rand AKT activity. However, DVL3 silencing led to activation of MEK1/2-ERK1/2 in serum-starved cells and sensitized this pathway to IGF-1 stimulation, with translocation of ERK1/2 into the nucleus and increased expression of ERK1/2 target genes. A DVL PDZ domain inhibitor (DVLi) showed similar effects on active l3-catenin, mTOR signalling and ERK1/2 signalling activity. The administration of DVLi increased sensitivity to AZ12253801 in cell lines with detectable ERK1/2 activation, but not prostate cancer cells in which ERK signalling was suppressed and AKT was activated in the context of loss of functional PTEN. Furthermore, DVL3 regulated activation of ERKs by influencing signaling downstream of the IGF-1 R and upstream of RAS, and DVL3 was found in a complex with the adaptor proteins GRB2 and DAB2. GRB2 knockdown was capable of abolishing ERK1/2 activation induced by DVLi, further implicating involvement of GRB2, and DAB2 silencing sensitized to IGF-1 R inhibition, mimicking effects of DVL3 depletion. Taken together, DVL3 silencing or inhibition enhances sensitivity to IGF-1 R inhibition by negatively regulating the ERK1/2 signaling pathway. These investigations shed new light on the factors that regulate IGF signaling, and provide a rational basis for design of clinical trials of IGF-1 R inhibitors.

Osteoarthritis (OA) ist eine chronische Erkrankung der Gelenke des menschlichen Körpers, insbesondere des Kniegelenkes. Sie ist durch entzündliche und degenerative Prozesse gekennzeichnet, die Patienten in ihrer Beweglichkeit stark einschränkt. In der komplexen Pathophysiologie kommt es unter anderem zu zellmorphologischen Veränderungen der knorpelbildenden Zellen, den Chondrozyten, und zu destruktiven Veränderungen der Knorpelmatrix. Bisherige therapeutische Ansätze bestehen in meist in einer rein symptomatischen Therapie durch Schmerzmittel sowie der operativen endoprothetischen Versorgung als Ultima Ratio. Eine kurative Therapie ist bisher nicht möglich. Einen Ansatz für eine kurative Therapie könnte eine Subpopulation der Zellen des Knorpelgewebes bieten. Chondrogene Progenitor Zellen (CPCs) stellen als Vorläuferzellen der Chondrozyten, gesteuert durch das prochondrogene Gen SOX9 und das proosteogene Gen RUNX2, einen möglichen regenerativen Ansatz in der Behandlung dar. Eine Rolle in diesem Prozess könnten die Wachstumsfaktoren TGF- β3 und EGF sowie das Matrixmolekül Biglycan darstellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Wachstumsfaktoren, deren Rezeptoren und das Matrixmolekül Biglycan im osteoarthrischen Knorpel eine Rolle spielen. Insbesondere konnte in vitro gezeigt werden, dass CPCs unter dem Einfluss dieser Moleküle zu einer vermehrten SOX9 und verminderten RUNX2-Expression angeregt werden. Unter der Hypothese, dass sich CPCs auf diese Art zu Chondrozyten differenzieren lassen und so den Knorpel wiederherstellen, könnten diese Moleküle einen möglichen Baustein einer zukünftigen Therapie der OA darstellen.

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GDF-15 ist ein atypisches Mitglied der TGF-b-Superfamilie. Unter physiologischen Bedingungen kommt es nur in der Plazenta in größeren Mengen vor, während es in zahlreichen Tumoren überexprimiert gefunden wurde. Die genaue Funktion von GDF-15 im Tumorkontext ist nicht genau geklärt. Aufgrund der häufigen und hohen Expression in Tumoren scheint GDF-15 eine wesentliche Funktion im Tumorprogress auszuüben. Das Ovarialkarzinom (OvCA) nimmt die Stellung als tödlichste gynäkologische Erkrankung ein. Da der Tumor meist erst in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert wird, sind bis heute die Heilungschancen schlecht. Häufig kommt es zum Rezidiv nach zunächst erfolgreicher Chemotherapie und mit 30% ist die 5-Jahres-Überlebenschance gering. Für die chemoresistenten Fälle gibt es bis zum heutigen Zeitpunkt keine effektive Therapie. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, neue innovative Therapiestrategien zu entwickeln. Günstige immunologische Parameter korrelieren mit der Überlebensdauer von OvCA-Patientinnen, was die Immuntherapie beim OvCA in den Fokus der experimentellen klinischen Therapie rückt. Doch um neue immuntherapeutische Strategien entwickeln zu können, müssen zunächst immunologisch relevante Angriffspunkte identifiziert werden. Das in vielen Tumoren exprimierte GDF-15 ist mit einem der stärksten immunsuppressiven Faktoren verwandt, was die Vermutung nahe legt, dass auch GDF-15 eine immunologisch relevante Funktion im Tumorkontext ausüben könnte. Daher wurden die Expression und die mögliche Funktion von GDF-15 als Immunmodulator im Ovarialkarzinom untersucht. Expressionsanalysen von OvCA-Gewebe und primären OvCA-Zellen zeigten, dass GDF-15 das am stärksten überexprimierte Gen der untersuchten TGF-b-Familienmitglieder im OvCA ist. Auch als sezerniertes Protein wird GDF-15 in vivo und in vitro im OvCA detektiert, was auf eine funktionale Rolle von GDF-15 im OvCA hindeutet. Normalerweise eliminiert das Immunsystem entartete körpereigene Zellen. Manchmal gelingt es Tumorzellen jedoch, sich dieser Immunüberwachung zu entziehen und dem Immunsystem zu „entwischen“. Inwieweit GDF-15 bei der Koordination des „immune escape“ des OvCA eine Rolle spielt, sollte im Fokus dieser Arbeit stehen. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf der Wirkung von GDF-15 auf NK-Zellen, da diese als frühe Effektoren und wichtige Mediatoren zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem nicht nur eine Schlüsselrolle bei der immunologische Überwachung spielen, sondern sich dadurch auch als ideale Werkzeuge für die Tumorimmuntherapie auszeichnen. Exogenes GDF-15 hemmt in vitro die Lyseaktivität von NK-Zellen gegenüber OvCA-Zellen. Endogene GDF-15-Defizienz der OvCA-Zellen sensitiviert diese für NK-Zell-Lyse und endogene GDF-15-Überexpression mindert die NK-Lyseaktivität. Die Hemmung der NK-Lyseaktivität kann durch verschiedene synergistisch wirkende Mechanismen erfolgen: durch Rezeptormodulation, durch direkte Modulation des Lysemechanismus und durch Apoptoseregulation. Wie TGF-b1 reguliert GDF-15 die Expression des aktivierenden NK-Rezeptors NKG2D von der Zelloberfläche herunter und induziert zusätzlich die Expression des inhibierenden Rezeptors CD305 und die des mit NKG2A- und NKG2C-assoziierten Rezeptors CD94. Daneben greift GDF-15 direkt in den Lysemechanismus der NK-Zellen ein, indem es die Granzym B-Expression beeinflusst. Darüber hinaus sensitiviert GDF-15 Immunzellen für die Apoptose durch die Induktion von Fas/CD95. Signaltransduktionsanalysen zeigen, dass GDF-15 in Immunzellen die SMAD-Proteine zeitverzögert zu TGF-b aktiviert, was auf eine indirekte Wirkung schließen lässt. Zusätzlich kann GDF-15 auch die die p38/MAPK in Immunzellen aktivieren. Die Genregulation von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen ist sehr verschieden. Beide Zytokine regulieren überwiegend Gene aus gleichen Funktionalitätsclustern, allerdings sind die einzelnen von TGF-b1 und GDF-15 regulierten Gene verschieden. Nur drei Gene (CD55, Caspase-8 und Apolipoprotein 6) sind durch GDF-15 und TGF-b1 gleich reguliert. Zusammengefasst zeigt sich eine funktionale Analogie von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen. TGF-b1 scheint eine stärkere Wirkung zu induzieren, dafür zeigt GDF-15 hier ein breiteres Funktionalitätsspektrum. Durch die Charakterisierung der funktionalen Rolle von GDF-15 als Immunmodulator in Tumoren ist hier ein neuer potentieller Angriffspunkt identifiziert worden, welcher Grundlage für neue Tumortherapiestrategien, nicht nur für das OvCA, sondern auch für andere GDF-15-exprimierende Tumore sein kann. / GDF-15 is an atypical member of the TGF-b superfamily. Under physiological conditions it is expressed primarily in the placenta, whereas it is over-expressed in many tumors. So far, the exact function of GDF-15 in tumor context remains unknown. Due to the high and frequent expression in different tumors GDF-15 might play an important role in tumor progression. Ovarian cancer (OvCA) is one of the most deadly gynaecological malignancies. Often OvCA is diagnosed in late stages and therapies frequently fail. Initially, chemotherapy is successful but in many cases tumors re-grow and the 5-year survival rate is less than 30%. Until now, no cure for chemoresistent OvCA exists which demonstrates the need for new experimental strategies. Immunotherapy is one major subject of experimental OvCA therapy, as favorable immunological parameters correlate with the survival of OvCA patients. In order to design new immunotherapeutic strategies against OvCA reliable and immunologically relevant targets have to be identified. GDF-15 is not only highly expressed in different tumors but is also closely related to one of the most immunosuppressive factors known suggesting a potential immunosuppressive role for GDF-15 itself. Thus, in this work GDF-15 expression and potential function as an immune modulator in ovarian cancer is analyzed. Expression analyses of OvCA tissue and primary OvCA cells reveal GDF-15 with the highest over-expression in OvCA of all analyzed TGF-b family members on RNA and protein level in vivo and in vitro. This high expression suggests a functional involvement of GDF-15 in ovarian carcinogenesis. The immune system is able to eliminate altered cells but sometimes tumor cells escape from this immune surveillance. Thus, this work focuses on the contribution of GDF-15 to the immune escape of OvCA. NK cells act as early cytotoxic effectors against tumors and represent important immune mediators with impact on innate and adaptive immunity. In vitro, exogenous GDF-15 inhibits NK cell lysis against OvCA cells. Additionally, GDF-15 deficient OvCA cells are killed more efficiently in NK lysis assays than GDF-15 over-expressing OvCA targets. Inhibition of NK cell lysis can occur by different synergistic mechanisms: receptor modulation, direct inhibition of cytotoxic functions and apoptosis regulation. Like TGF-b GDF-15 down-regulates NKG2D receptor expression and furthermore, induces the expression of the inhibitory receptor CD305 and the NKG2A and NKG2C associated receptor CD94. Additionally, GDF-15 interferes directly with the cytolytic activity of NK cells by reducing granzyme B expression. Moreover, GDF-15 sensitizes immune cells for apoptosis by up-regulation of CD95/Fas. Signal transduction analyses reveal a delay in GDF-15 dependent SMAD signaling in immune cells compared to that of TGF-b suggesting a rather indirect effect of GDF-15. But GDF-15 can additionally activate p38/MAPK in immune cells. GDF-15 and TGF-b dependent gene regulation in NK cells is different although regulated genes cluster in the same functional groups. Only three genes (CD55, caspase-8 and Apolipoprotein 6) are regulated in a similar way. In summary, GDF-15 and TGF-b show similar immune modulating characteristics. TGF-b seems to be more potent mostly achieving a more powerful effect but here, GDF-15 showed a broader mechanistic spectrum. The functional role of GDF-15 as an immune mediator in tumor context reveals an interesting new target for experimental therapy not only for OvCA but for all GDF-15 producing tumors.

Echinococcus multilocularis besitzt als Lebergewebe - infiltrierender Parasit und Erreger der Alveolären Echinokokkose evolutionär konservierte Faktoren des TGF-β / BMP Signalsystems, die im Konzept der hormonellen Wirt - Parasit Kreuzkommunikation nicht nur hinsichtlich des Wirts - Einflusses auf die Entwicklung des Parasiten sondern auch umgekehrt in Bezug auf Immunantwort und Physiologie des Wirts eine mögliche regulierende Funktion besitzen. Die vorliegende Arbeit befasst sich primär mit den Auswirkungen von TGF-β / BMP Signaling auf den Fuchsbandwurm E. multilocularis. Dazu wurde zunächst durch Immunlokalisation das Vorliegen aller Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren während einer natürlich aufgetretenen Alveolären Echinokokkose überprüft, sowie die funktionelle Interaktion von EmRSK3 und EmRSK4 mit humanem TGF-β1 in vitro nachgewiesen. Mit Hilfe von humanen Zytokinen (BMP2 und TGF β1) und Rezeptor - spezifischen Inhibitoren (SB431542, Dorsomorphin und LY364947) wurde die Rolle von TGF β / BMP Signaling in Bezug auf Vitalität, Wachstum, Differenzierung und Regeneration von E. multilocularis in verschiedenen Stadien untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss von humanem BMP2 und von SB431542 auf die Genexpression in E. multilocularis analysiert. Die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation durch Echinokokken Faktoren des TGF-β / BMP Signaling wurde ebenfalls adressiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren in vitro durch sekretierte Faktoren aus Metazestoden aktiviert werden können. Auf Basis von Genomsequenzierungsdaten wurden zudem weitere Komponenten des TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis, wie die bisher unbekannten TGF β / BMP Homologe EmBMP2 und EmAct, die Noggin-like Homologe EmNlg1 und 2, ein I-Smad (EmSmadF) sowie ein zweiter BR-Smad (EmSmadE) identifiziert, strukturell charakterisiert und die jeweilige Genexpression in verschiedenen Stadien überprüft. EmSmadE wurde zudem in weiterführenden Studien funktionell charakterisiert. Fragestellungen bezüglich der Spezifität, Funktionalität und Möglichkeit der konstitutiven Aktivierung von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis wurden auf Basis von EmSmadA, EmRSK3 und EmRSK3b in weiteren molekularbiologischen Studien untersucht und dienen dem tieferen Verständnis von TGF-β / BMP Signaling. In der vorliegenden Arbeit konnten damit alle grundlegenden Faktoren von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis identifiziert werden und es wurden erstmals die eindeutige Sensierung von Wirts TGF-β / BMP Zytokinen durch Metazestoden sowie die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation über Echinokokken TGF-β / BMP Faktoren belegt. Zusätzlich deuten die neu identifizierten potenziell sekretierten TGF-β / BMP Faktoren auf eine mögliche Beeinflussung von Physiologie und Immunantwort des Wirts durch Echinokokken TGF-β / BMP Zytokine hin. / Being the causative agent of alveolar echinococcosis with infiltrative growth in liver tissue, Echinococcus multilocularis possesses evolutionary conserved TGF-β / BMP signaling factors, which might have - according to the concept of ‘hormonal host-parasite cross-communication’ - a fundamental function in developmental processes of the parasite which are under influence of the host, and vice versa a regulatory role in immune response and host physiology. The present work addresses primarily the impact of TGF-β / BMP signaling on the fox tapeworm. For this purpose, the presence of all four TGF β / BMP receptors of E. multilocularis had been initially checked by immune localization in naturally infected liver tissue and the functional interaction of EmRSK3, EmRSK4 and human TGF-β1 was demonstrated in vitro. The role of TGF-β / BMP signaling concerning vitality, growth, differentiation and regeneration was examined in several stages of E. multilocularis development, using human cytokines (BMP2 and TGF β1) and specific inhibitors of TGF-β / BMP receptors (SB431542, Dorsomorphin and LY364947). The influences of human BMP2 and of the small molecule compound SB431542 on the gene expression profile of metacestodes were analyzed as well. A second subproject dealt with the possibility of intra-species communication via TGF-β / BMP signaling in E. multilocularis. Thus, it was demonstrated that TGF-β / BMP receptors of the fox tapeworm are activated by secreted factors of metacestode vesicles. Based on the data of a genome sequencing project, several so far unknown factors of TGF-β / BMP signaling in E. multilocularis were identified, structurally characterized and expression levels were tested in all larval stages. This included two TGF β / BMP homologues (EmBMP2 and EmAct), two Noggin-like factors (EmNlg1 and 2), one I-Smad homologue (EmSmadF) and a second BR Smad (EmSmadE). Additional functional studies were performed for EmSmadE. Questions about specificity, functionality and the possibility of constitutive activation, which leverage the knowledge of TGF-β / BMP signaling in general, were addressed in further molecular biological studies with EmSmadA, EmRSK3 and EmRSK3b. Taken together, all basic factors of TGF-β / BMP signaling in E. multilocularis could be identified in the present study and sensing of host TGF-β / BMP cytokines by metacestodes as well as the possibility of intra-species communication via TGF-β / BMP signaling could be shown for the first time. In addition, based on the possibly secreted TGF-β / BMP factors which have been identified in the present work, there is evidence that TGF-β / BMP cytokines of E. multilocularis might influence immune response and physiology of the host during an infection.

Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) ist ein multifunktionelles Zytokin, welches insbesondere Zellwachstum und Zelldifferenzierung koordiniert. TGF-b ist vor allem dafür bekannt, Zellen des Immunsystems zu beeinflussen. TGF-b steuert zum Beispiel die Differenzierung von T-Zellen und und deren Effektorfunktionen. Die Signaltransduktion von TGF-b wird vermittelt durch die Phosphorylierung von Rezeptor-assoziierten Smad-Proteinen (R-Smads). R-Smads werden vom Typ I Rezeptor aktiviert, der seinerseits vom hochaffinen Typ II Rezeptor phosphoryliert wird, sobald der Ligand bindet. Die phosphorylierten RSmads assoziieren darauf mit Co-Smads. Heterooligomere von R-Smads und Co-Smads wandern dann in den Zellkern, wo sie im Zusammenspiel mit Transkriptionsfaktoren wie CBP/p300 oder AP-1 die Transkription TGF-b-spezifischer Zielgene koordinieren. Neue Erkenntnisse lassen vermuten, daß die pleiotropen Effekte von TGF-b durch das Interagieren mit anderen Signalkaskaden entstehen, zum Beispiel mit dem MAP-Kinase-Weg oder der STAT-Kaskade. Wir beschreiben hier den Effekt von TGF-b auf die Effektorfunktionen unterschiedlich stimulierter primärer Maus-Milzzellen und aufgereinigten zytotoxischen CD8+ Maus-TZellen. Langzeitbehandlung mit TGF-b resultierte in der Unfähigkeit der Zellen, Smad2 ligandeninduziert zu phosphorylieren. Entweder wurde überhaupt keine Phosphorylierung beobachtet, oder eine anhaltende Phosphorylierung von Smad2 unabhängig vom Vorhandensein des Liganden. Des weiteren stellten wir einen Zusammenhang zwischen anhaltender Smad2-Phosphorylierung und der Resistenz gegenüber TGF-b induzierter Wachstumshemmung fest. Im Gegensatz dazu zeigen Zellen, die sensitiv sind gegenüber TGF-b vermittelter Wachstumshemmung, keine Smad2-Phosphorylierung mehr. Bezüglich ihrer zytotoxische Aktivtät waren allerdings beide Phänotypen nicht mehr lytisch wirksam, unabhängig von der jeweiligen Smad2-Phosphorylierung. In dieser Arbeit zeigen wir auch die Notwendigkeit eines funktionalen MEK-1-Signalweges auf, der unabdingbar ist, damit TZellen keine Wachstumsinhibierung durch TGF-b mehr erfahren. Das Blockieren dieses Signalweges führt darüberhinaus bei diesen Zellen ebenfalls zu einem veränderten Smad2- Phosphorylierungsmuster. Bezüglich des JNK-Signalweges konnten wir feststellen, daß ein funktional aktiver JNK-Signalweg mit der Resistenz gegenüber TGF-b vermittelter Wachstumsinhibierung einhergeht. Allerdings führt die Zugabe von IFNg und/oder aCD28- Antikörper nicht zu einer veränderten Sensitivität gegenüber TGF-b. Im Gegensatz zuprimären Zellen können die beschriebenen Zusammenhänge in Zellkulturen vom humanen und murinen T Zellen nicht beobachtet werden, und sind somit spezifisch für primare TZellen. Wir beschreiben auch die Klonierung eines chimären dominant-negativen Typ II Rezeptors, der an eine Kinase gekoppelt ist, die bei Aktivierung Zelltod auslöst. Damit soll es in Zukunft möglich sein, T-Zellen gegenüber TGF-b Resistenz zu verleihen. Die hier geschilderten Ergebnisse vertiefen die Kenntnisse über molekulare Mechanismen der Wirkung von TGF-b auf T-Zellen und können vielleicht dazu beitragen, negative Effekte von TGF-b, zum Beispiel in der Tumortherapie, gezielt abzuwenden. / Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) is a multifunctional cytokine that regulates cell growth and differentiation in many types of cells. TGF-b1 is especially known to exert a variety of regulatory functions in the immune system, such as T cell differentiation and T cell function. Signal transduction of TGF-b1 is mediated by phosphorylation of receptorassociated Smad proteins (R-Smads). R-Smads are phosphorylated by the activated type I receptor, which is itself phosphorylated by the high affinity type II receptor upon ligand binding. The phosphorylated R-Smads then associate with Co-Smads. Heterooligomers of R- and Co-Smads translocate into the nucleus where they regulate transcription of target genes in concert with other transcription factors such as CBP/p300 or AP-1. Recent findings suggest that the pleiotropic effects of TGF-b1 are conferred by crosstalks to other signal transduction pathways such as the MAP-kinases or the STAT-pathway. Here we describe the effect of long-term exposure to TGF-b1 on the effector function of differentially stimulated primary murine splenocytes and purified primary murine CD8+ cytotoxic T cells. Long-term exposure to TGF-b1 results in non-responsiveness to TGF-b1- induced Smad2 phosphorylation. This is seen either by no phosphorylation or sustained phosphorylation of Smad2. Furthermore, we observed a strong correlation between sustained Smad2 phosphorylation and resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition. In contrast, splenocyte cultures strongly growth inhibited by TGF-b1 showed no Smad2 phosphorylation. Lytic activity of these cultures, however, was found to be suppressed regardless of proliferation properties and Smad2 phosphorylation pattern. We also describe that a functional MEK-1 pathway is a prerequisite for rendering murine splenocytes unresponsive to TGF-b1 mediated growth inhibition, and that inhibition of the MEK-1 cascade alters the Smad2 phosphorylation pattern. In addition, we show that resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition correlates with the activation of the JNK pathway. However, the resistant phenotype was found unable to be reverted upon administration of exogeneous IFNg and/or aCD28 antibody. In human or mouse T cell lines, however, the described correlation between the type of stimulation and TGF-b growth resistance or growth sensitivity is not present. Thus, this correlation is specific for primary T cells. We also cloned a chimeric dominantnegative TGF-b receptor which is coupled to a suicide gene, in order to render T cells resistant to TGF-b mediated effects.These findings shed light on how TGF-b1 mediates its immunosuppressive role, and may help to gain knowledge of averting these TGF-b1 effects in the course of tumor therapy.

In the last years it became evident that many cytokines do not only bind to their specific cell surface receptors but also interact with components of the extracellular matrix. Mainly in Drosophila, several enzymes were identified, that are involved in glycosaminoglycan synthesis. Mutations in these enzymes mostly result in disturbances of several signaling pathways like hedgehog, wingless, FGF or dpp. In most cases it was, due to these pleiotropic effects, not possible to examine the relevance of matrix interactions for single pathways. The aim of this work was to examine the relevance of matrix interactions for the TGF-ß superfamily member DPP. Based on the fact that DPP is highly homologous to human BMP-2, the basic N-terminus of mature DPP was mutated, which has been shown to contain a heparin-binding site in BMP-2. Thus, a wildtype variant (D-MYC), a deletion variant (D-DEL), which lacked the whole basic part of the N-terminus and a duplication variant (D-DUP), which contained a second copy of the basic core moitiv, were generated. In order to characterise the variants biochemically, they were expressed in E.coli and refolded in a bioactive form. In chicken limbbud assay, the deletion variant was much more active than the wildtype variant, comparable to data of BMP-2. By means of biacore mesurements with the immobilised ectodomain of the high affinity type I receptor thick veins, it could be demonstrated, that the variants differ only in matrix binding and not in their receptor affinity. Different matrix binding was shown by Heparin FPLC. The biological relevance of the matrix interaction of DPP was examined in transgenic flies. To allow expression of the different variants under the control of various Gal4 driver lines, they were cloned behind an UAS-promoter site. In early tracheal development, a strong dependence of DPP signaling on matrix binding was observed. While ectopic expression of the deletion variant caused only minor defects, the branching pattern was strongly disturbed by overexpression of wildtype and duplication variant. Ubiquitous expression of the variants in the wing imaginal disc caused overproliferation of the disc and expansion of the omb target gene expression. The extent of phenotypes correlated with the matrix binding ability of the variants. Corresponding disturbances of the wing vein pattern was observed in adult flies. By the crossing of different dpp allels, transheterozygous animals were created, that lack dpp only in imaginal discs. Expression of the variants under the control of a suitable dpp-Gal4 driver line revealed insights into the biological relevance of matrix binding on DPP gradient formation and specific target gene activation in wing imaginal discs. It was shown, that all variants were able to generate a functional DPP gradient with correct expression of the target genes omb and spalt. Again a correlation between extent of target gene domains and matrix binding ability of the corresponding variants was found. Thus by mutating the N-terminus of DPP, it could be shown that this is responsible for DPP`s matrix interaction. Also the relevance of matrix binding of DPP in different tissues was examined. It turned out, that the reorganisation of tracheal branching by DPP strongly depends on matrix interactions wheras the establishing of a gradient in wing imaginal discs depends only gradually on matrix interactions. Based on these data a model for the action of DPP/TGFßs as morphogens was established. While a deletion of matrix binding leads to a decrease in specific bioactivity of the cytokine, the latter is increased by additional matrix binding sites. / In den letzten Jahren wurde deutlich, daß viele Zytokine nicht nur mit ihren spezifischen Zelloberflächen-Rezeptoren interagieren, sondern auch Affinität zu Komponenten der Extrazellulären Matrix zeigen. Vor allem in Drosophila konnten viele Enzyme zur Synthese von Glukosaminoglykanen identifiziert werden. Mutationen in diesen Enzymen führen in der Regel zu Störungen verschiedener Signalwege, wie z.B. hedgehog, wingless, FGF oder dpp. Aufgrund dieser pleiotropen Effekte, war es meist nicht möglich, die Bedeutung der Matrix-Interaktionen für bestimmte Zytokine zu untersuchen. In dieser Arbeit sollte die Bedeutung der Matrix-Interaktion für das TGF-ß-Superfamilienmitglied DPP unter-sucht werden. Ausgehend von der hohen Homologie zwischen humanem BMP-2 und DPP wurde der basische N-Terminus von DPP, der im BMP-2 für die Heparininteraktion verantwortlich ist, verändert. Es wurde neben einer Wildtypvariante (D-MYC) eine Deletionsvariante (D-DEL) generiert, die keine basischen Aminosäuren im N-Terminus aufweist, sowie eine Duplikationsvariante (D-DUP), die eine zweite Kopie des basischen Hauptmotivs im N-Terminus enthält. Zur biochemischen Charakterisierung wurden die Varianten sowie wildtypisches DPP in E.coli exprimiert und in eine bioaktive Form zurückgefaltet. Im Limbbud-Test zeigte sich vergleichbar zum BMP-2 eine stark erhöhte Aktivität der Deletionsvariante gegenüber Wildtyp-DPP. Durch Biacore-Messungen an der immobilisierten Ektodomäne des hochaffinen DPP TypI-Rezeptors Thick veins konnte gezeigt werden, daß alle Varianten gleiche Rezeptoraffinität haben und sich nur in der Matrixbindung unterscheiden. Letzteres wurde durch eine analytische FPLC mit Heparin als Matrix gezeigt. Die biologische Relevanz der Matrixbindung wurde in transgenen Fliegen untersucht. Hierbei wurden die DPP-Varianten hinter einen UAS-Promoter kloniert, um jene unter der Kontrolle verschiedener Gal4-Treiberlinien exprimieren zu können. In der frühen Tracheenentwicklung zeigte sich eine sehr starke Matrix-Abhängigkeit der DPP-Wirkung. Während ektopische Expression der Deletionsvariante fast keine Störung der Zellmigration verursachte, war das Muster der Tracheenäste bei ektopischer Expression von D-MYC als auch D-DUP massiv gestört. Ubiquitäre Expression der Varianten in der Flügelimaginalscheibe verursachte Überproliferation und eine Ausdehnung der Expressionsdomäne des omb-Genes. Die Stärke der Phänotypen korrelierte dabei mit der Matrixbindung der Varianten. Entsprechende Störungen des Venenmusters konnten in Flügeln adulter Tiere festgestellt werden. Durch Kreuzung zweier dpp-Allele konnten transheterozygote Fliegen gewonnen werden, die keine dpp-Expression in den Imaginalscheiben zeigen. Die Expression der Varianten unter Kontrolle eines geeigneten dpp-Gal4-Treibers in diesen Fliegen gab Aufschluß über die tatsächliche Relevanz der DPP-Matrix-Interaktion für die Ausbildung eines DPP-Gradienten und spezifische Aktivierung verschiedener Targetgene in der Flügelscheibe. Es wurde gezeigt, daß alle Varianten dazu in der Lage sind, einen DPP-Gradienten mit entsprechender Expression der Targetgene omb und spalt zu erzeugen. Wieder wurde eine Korrelation zwischen Ausdehnung der Targetgen-Domänen und der Matrixbindung der Varianten beobachtet. Somit konnte durch Mutation des N-Terminus des DPP-Proteins gezeigt werden, daß dieser für die Matrixinteraktion von DPP verantwortlich ist. Auch wurde Aufschluß über die Bedeutung der Matrixinteraktion an verschiedenen DPP-Wirkungsorten gewonnen. Die Abhängigkeit des DPP-Signalpotentials von der Matrixbindung differiert zwischen verschiedenen Gewebetypen. Während die Wirkung von DPP in der Restrukturierung der trachealen Migration sehr stark von einer Matrixbindung abhängt, sieht man in bei der Proliferation und Musterbildung in der Imaginalscheibe nur graduelle Effekte. Diese Daten führten zur Etablierung eines Models für den Wirkungsmechanismus von DPP/TGFß Molekülen als morphogene Faktoren. Während eine Deletion von Matrixbindung zu einem Verlust der spezifischen biologischen Aktivität führt, wird durch zusätzliche Matrixbindung eine erhöhte Aktivität erreicht.

A dissertation submitted to the Faculty of Science, University of the Witwatersrand, Johannesburg, in fulfilment of the requirements for the degree of Master of Science. / A member of the epidermal growth factor (EGF) family; transforming growth factor alpha (TGF-a) shares significant homology with EGF and binds to the EGF receptor (EGF-R). Like EGF TGF-a plays important roles in normal physiological processes; but, as its name signifies, it has potent transforming ability; often associated with autocrine stimulatory mechanisms. The purpose of this study is to investigate a possible role for TGF-a and its receptor in certam human oesophageal squamous cell carcinoma (SCC) cell lines - namely, WHCO-I, -3 and -5. The wellstudied A431 epidermoid. carcinoma cell line was used throughout for control purposes. (Abbreviation abstract) / Andrew Chakane 2018

by Xin-xia Tian. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 1999. / Includes bibliographical references (p. 195-212). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.

Tse Chui-ling. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2001. / Includes bibliographical references (leaves 130-146). / Abstracts in English and Chinese. / Acknowledgments --- p.i / Abstract --- p.ii / 論文撮要 --- p.iii / List of Figures and Tables --- p.iv / Abbreviations --- p.vi / Table of contents --- p.vii / Chapter Chapter I --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Literature review --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- An overview of IGFs --- p.3 / Chapter 1.1.2 --- Molecular biology of IGFs --- p.5 / Chapter 1.1.2.1 --- IGF-I and IGF-II genes and mRNAs --- p.5 / Chapter 1.1.2.2 --- Amino acid sequences of IGF-II --- p.8 / Chapter 1.1.2.3 --- Imprinting of IGF-II --- p.12 / Chapter 1.1.3 --- IGF distribution in tissues and body fluids --- p.14 / Chapter 1.1.3.1 --- IGF in serum --- p.14 / Chapter 1.1.3.2 --- IGF binding proteins --- p.16 / Chapter 1.1.4 --- IGF receptors --- p.19 / Chapter 1.1.4.1 --- Structures of the IGF receptors --- p.20 / Chapter 1.1.4.2 --- Ligand binding of the IGF receptors --- p.21 / Chapter 1.1.4.3 --- Signal transduction and biological response --- p.22 / Chapter 1.1.5 --- Biological effects of IGF --- p.24 / Chapter 1.1.6 --- Expression of recombinant IGF --- p.28 / Chapter 1.2 --- Rationale and Objective --- p.29 / Chapter Chapter II --- Methodology --- p.33 / Chapter 2.1 --- Design of degenerate primers --- p.33 / Chapter 2.2 --- Cloning --- p.35 / Chapter 2.2.1 --- DNA extraction from agarose gel --- p.35 / Chapter 2.2.2 --- Linearization and dephosphorylation of plasmid DNA --- p.35 / Chapter 2.2.3 --- Blunt-end ligation of amplicon with linearized plasmid --- p.36 / Chapter 2.2.4 --- T/A ligation of amplicon with linearized plasmid --- p.37 / Chapter 2.2.5 --- Sticky end ligation of foreign DNA with linearized plasmid --- p.37 / Chapter 2.2.6 --- Preparation of competent of E. coli stain DHI5α cells --- p.38 / Chapter 2.2.7 --- Transformation of plasmid vector into competent cells (heat-shock/ electroporation) --- p.39 / Chapter 2.2.8 --- "Spread single colony, PCR check clone and inoculation" --- p.40 / Chapter 2.2.9 --- Small scale alkali preparation of plasmid DNA --- p.41 / Chapter 2.2.10 --- Large scale preparation of plasmid DNA --- p.41 / Chapter 2.2.11 --- Nucleotide sequencing --- p.41 / Chapter 2.2.11.1 --- Manual sequencing --- p.41 / Chapter 2.2.11.2 --- PCR sequencing --- p.43 / Chapter 2.3 --- Northern blot --- p.45 / Chapter 2.4 --- Preparation of radio-labeled probe and hybridization of radio-labeled probe to nylon immobilized nucleic acid --- p.46 / Chapter 2.5 --- RACE --- p.48 / Chapter 2.5.1 --- Design of gene-specific primer --- p.51 / Chapter 2.5.2 --- First strand cDNA synthesis --- p.51 / Chapter 2.5.3 --- TdT tailing of cDNA --- p.52 / Chapter 2.6 --- Poly-A tract extraction --- p.53 / Chapter 2.7 --- Tissue distribution of mRNA --- p.53 / Chapter 2.7.1 --- Tissue preparation --- p.53 / Chapter 2.7.2 --- Total RNA extraction --- p.54 / Chapter 2.7.3 --- Formaldehyde agarose gel electrophoresis of RNA --- p.54 / Chapter 2.8 --- RNAse protection assay --- p.55 / Chapter 2.8.1 --- Antisense probe generation --- p.56 / Chapter 2.8.2 --- Preparation of the sample RNA --- p.58 / Chapter 2.8.3 --- Hybridization --- p.58 / Chapter 2.8.4 --- RNase digestion of hybridized probe and sample RNA --- p.59 / Chapter 2.8.5 --- Preparation of radioactive marker --- p.60 / Chapter 2.8.6 --- Separation and detection of protected fragments --- p.60 / Chapter 2.8.7 --- Data processing and statistical analysis --- p.61 / Chapter 2.9 --- Injection of GH --- p.62 / Chapter 2.10 --- Recombinant protein expression --- p.62 / Chapter 2.10.1 --- Plasmid construction --- p.62 / Chapter 2.10.2 --- Expression --- p.63 / Chapter 2.11 --- Resolution of proteins on SDS-PAGE --- p.63 / Chapter 2.12 --- Purification --- p.64 / Chapter 2.13 --- Western transfer --- p.64 / Chapter 2.14 --- Immunodetection --- p.65 / Chapter Chapter III --- Results & Discussion --- p.67 / Chapter 3.1 --- Isolation and characterization of IGF-II cDNA and its gene organization --- p.67 / Chapter 3.1.1 --- Introduction --- p.67 / Chapter 3.1.2 --- Results --- p.68 / Chapter 3.1.2.1 --- Generation of a fragment of the common carp IGF-II cDNA by PCR --- p.68 / Chapter 3.1.2.2 --- Isolation of the full length common carp IGF-II cDNA by RACE. --- p.69 / Chapter 3.1.2.3 --- Nucleotide sequence analysis --- p.74 / Chapter 3.1.2.4 --- Relationship of common carp IGF-II to common carp IGF-I and insulin --- p.78 / Chapter 3.1.2.5 --- Confirmation of the presence of IGF-II in common carp --- p.79 / Chapter 3.1.2.6 --- Multiple mRNA forms of common carp IGF-I and IGF-II --- p.80 / Chapter 3.1.2.7 --- Gene organization of the common carp IGF-II gene --- p.83 / Chapter 3.1.3 --- Discussion --- p.86 / Chapter 3.2 --- Tissue specific distribution of IGF-I and IGF-II mRNA and their hormonal regulation --- p.90 / Chapter 3.2.1 --- Introduction --- p.90 / Chapter 3.2.2 --- Results --- p.94 / Chapter 3.2.2.1 --- RNase protection assay measurement of tissue mRNA levels in juvenile and adult common carp --- p.94 / Chapter 3.2.2.2 --- Expression of IGF-II mRNA during larval development --- p.99 / Chapter 3.2.2.3 --- Effect of GH on IGF-I and IGF-II mRNA levels in brain and Hver of juvenile common carp --- p.102 / Chapter 3.2.3 --- Discussion --- p.106 / Chapter 3.3 --- Recombinant common carp IGF-II expressed in E. coli --- p.110 / Chapter 3.3.1 --- Introduction --- p.110 / Chapter 3.3.2 --- Results --- p.112 / Chapter 3.3.2.1 --- Product of recombinant common carp IGF-II --- p.112 / Chapter 3.3.2.2 --- Purification of common carp IGF-II --- p.115 / Chapter 3.3.2.3 --- Immunodetection --- p.117 / Chapter 3.3.3 --- Discussion --- p.118 / Chapter Chapter IV --- General conclusion --- p.120 / Appendix: Reagents --- p.124 / Reference list --- p.130