Echinococcus multilocularis besitzt als Lebergewebe - infiltrierender Parasit und Erreger der Alveolären Echinokokkose evolutionär konservierte Faktoren des TGF-β / BMP Signalsystems, die im Konzept der hormonellen Wirt - Parasit Kreuzkommunikation nicht nur hinsichtlich des Wirts - Einflusses auf die Entwicklung des Parasiten sondern auch umgekehrt in Bezug auf Immunantwort und Physiologie des Wirts eine mögliche regulierende Funktion besitzen. Die vorliegende Arbeit befasst sich primär mit den Auswirkungen von TGF-β / BMP Signaling auf den Fuchsbandwurm E. multilocularis. Dazu wurde zunächst durch Immunlokalisation das Vorliegen aller Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren während einer natürlich aufgetretenen Alveolären Echinokokkose überprüft, sowie die funktionelle Interaktion von EmRSK3 und EmRSK4 mit humanem TGF-β1 in vitro nachgewiesen. Mit Hilfe von humanen Zytokinen (BMP2 und TGF β1) und Rezeptor - spezifischen Inhibitoren (SB431542, Dorsomorphin und LY364947) wurde die Rolle von TGF β / BMP Signaling in Bezug auf Vitalität, Wachstum, Differenzierung und Regeneration von E. multilocularis in verschiedenen Stadien untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss von humanem BMP2 und von SB431542 auf die Genexpression in E. multilocularis analysiert. Die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation durch Echinokokken Faktoren des TGF-β / BMP Signaling wurde ebenfalls adressiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren in vitro durch sekretierte Faktoren aus Metazestoden aktiviert werden können. Auf Basis von Genomsequenzierungsdaten wurden zudem weitere Komponenten des TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis, wie die bisher unbekannten TGF β / BMP Homologe EmBMP2 und EmAct, die Noggin-like Homologe EmNlg1 und 2, ein I-Smad (EmSmadF) sowie ein zweiter BR-Smad (EmSmadE) identifiziert, strukturell charakterisiert und die jeweilige Genexpression in verschiedenen Stadien überprüft. EmSmadE wurde zudem in weiterführenden Studien funktionell charakterisiert. Fragestellungen bezüglich der Spezifität, Funktionalität und Möglichkeit der konstitutiven Aktivierung von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis wurden auf Basis von EmSmadA, EmRSK3 und EmRSK3b in weiteren molekularbiologischen Studien untersucht und dienen dem tieferen Verständnis von TGF-β / BMP Signaling. In der vorliegenden Arbeit konnten damit alle grundlegenden Faktoren von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis identifiziert werden und es wurden erstmals die eindeutige Sensierung von Wirts TGF-β / BMP Zytokinen durch Metazestoden sowie die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation über Echinokokken TGF-β / BMP Faktoren belegt. Zusätzlich deuten die neu identifizierten potenziell sekretierten TGF-β / BMP Faktoren auf eine mögliche Beeinflussung von Physiologie und Immunantwort des Wirts durch Echinokokken TGF-β / BMP Zytokine hin. / Being the causative agent of alveolar echinococcosis with infiltrative growth in liver tissue, Echinococcus multilocularis possesses evolutionary conserved TGF-β / BMP signaling factors, which might have - according to the concept of ‘hormonal host-parasite cross-communication’ - a fundamental function in developmental processes of the parasite which are under influence of the host, and vice versa a regulatory role in immune response and host physiology. The present work addresses primarily the impact of TGF-β / BMP signaling on the fox tapeworm. For this purpose, the presence of all four TGF β / BMP receptors of E. multilocularis had been initially checked by immune localization in naturally infected liver tissue and the functional interaction of EmRSK3, EmRSK4 and human TGF-β1 was demonstrated in vitro. The role of TGF-β / BMP signaling concerning vitality, growth, differentiation and regeneration was examined in several stages of E. multilocularis development, using human cytokines (BMP2 and TGF β1) and specific inhibitors of TGF-β / BMP receptors (SB431542, Dorsomorphin and LY364947). The influences of human BMP2 and of the small molecule compound SB431542 on the gene expression profile of metacestodes were analyzed as well. A second subproject dealt with the possibility of intra-species communication via TGF-β / BMP signaling in E. multilocularis. Thus, it was demonstrated that TGF-β / BMP receptors of the fox tapeworm are activated by secreted factors of metacestode vesicles. Based on the data of a genome sequencing project, several so far unknown factors of TGF-β / BMP signaling in E. multilocularis were identified, structurally characterized and expression levels were tested in all larval stages. This included two TGF β / BMP homologues (EmBMP2 and EmAct), two Noggin-like factors (EmNlg1 and 2), one I-Smad homologue (EmSmadF) and a second BR Smad (EmSmadE). Additional functional studies were performed for EmSmadE. Questions about specificity, functionality and the possibility of constitutive activation, which leverage the knowledge of TGF-β / BMP signaling in general, were addressed in further molecular biological studies with EmSmadA, EmRSK3 and EmRSK3b. Taken together, all basic factors of TGF-β / BMP signaling in E. multilocularis could be identified in the present study and sensing of host TGF-β / BMP cytokines by metacestodes as well as the possibility of intra-species communication via TGF-β / BMP signaling could be shown for the first time. In addition, based on the possibly secreted TGF-β / BMP factors which have been identified in the present work, there is evidence that TGF-β / BMP cytokines of E. multilocularis might influence immune response and physiology of the host during an infection.

Die alveoläre Echinokokkose ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, die durch tumorartig in der Leber wachsende Larven (Metazestoden) des Fuchsbandwurms ausgelöst wird. Während Th1-dominierte Immunantworten zur Expulsion des Parasiten führen können, sind Th2-Antworten mit chronischer Infektion assoziiert. Über seine exkretorisch-sekretorischen Produkte (ESPs) nimmt Echinococcus multilocularis Einfluss auf die Polarisierung der Immunantwort. Allerdings ist bislang nur wenig über die zugrundeliegenden Mechanismen und aktiven Komponenten der ESPs bekannt. Die Immunmodulation durch Eier des Pärchenegels Schistosoma mansoni, der wie E. multilocularis zu den Plattwürmern gehört, ist dagegen schon besser charakterisiert. Hier hat omega-1, eine Ribonuklease der T2-Familie, Aufmerksamkeit als starker Induktor von Th2-Antworten und als Hepatotoxin erregt. Die Fragestellung dieser Arbeit war nun, ob die T2-RNase des Fuchsbandwurms (EmRNASET2) hinsichtlich ihrer Wirkungen auf Zellen des Immunsystems und der Leber Ähnlichkeiten mit omega-1 besitzt. Es konnte gezeigt werden, dass EmRNASET2 von allen Larvenstadien und auch vom adulten Wurm exprimiert wird. Der Einsatz polyklonaler Antikörper gegen rekombinant in Escherichia coli exprimierte recEmRNASET2 ermöglichte den Nachweis des Proteins in den ESPs von Primärzellen, die das frühe Stadium sich entwickelnder Metazestoden darstellen, und, wenngleich geringer ausgeprägt, in ESPs reifer Metazestoden. Zur Untersuchung einer möglichen immunmodulatorischen Wirkung wurden dendritische Zellen (DCs) aus murinem Knochenmark generiert und mit Überständen recEmRNASET2-produzierender HEK-Zellen exponiert. Diese zeigten im Vergleich zu Überständen von mit leerem Transfektionsvektor behandelten HEK-Zellen keine signifikante Inhibition der LPS-induzierten Reifung und Interleukin-12-Produktion von DCs, wie sie für omega-1 beschrieben ist. Auch ein Pilotexperiment mit der Leberzelllinie Hep3B lieferte keinen Anhalt für eine hepatotoxische Wirkung von EmRNASET2. Somit sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit gegen eine funktionelle Verwandtschaft von EmRNASET2 und omega-1. Unterstützt wird diese Beobachtung durch eine orientierende phylogenetische Untersuchung, in der sich EmRNASET2 näher verwandt zu einer zweiten T2-RNase von S. mansoni zeigte. Omega-1 könnte also das Resultat einer Genduplikation mit anschließender Akquirierung immunmodulatorischer Funktionen sein. / Alveolar Echinococcosis is a life-threatening disease caused by larvae (metacestodes) of the fox tapeworm, growing infiltratively in the liver. While Th1-dominated immune responses can lead to parasite expulsion, Th2-responses are associated with chronic infection. Through its excretory-secretory products (ESPs), Echinoccoccus multilocularis can influence polarisation of the immune response. However, little is known about the underlying mechanisms and active components of the ESPs. In contrast, immunomodulation by eggs of the blood fluke Schistosoma mansoni, a flat worm like E. multilocularis, has already been characterised more intensively and omega-1, a ribonuclease of the T2-family, has been identified as a major inductor of Th2-responses and as hepatotoxin. The aim of this study was to determine if the T2-RNase of E. multilocularis (EmRNASET2) has effects on cells of the immune system and the liver that are similar to those of omega-1. It could be shown that EmRNASET2 is expressed by all larval stages and by the adult worm. The use of polyclonal antibodies raised against the recombinantly expressed recEmRNASET2 allowed the detection of the protein in ESPs of primary cells, representing an early stage of developing metacestodes, and, however at a lower level, in ESPs of mature metacestodes. In order to address a potential immunomodulatory role, dendritic cells (DCs) were generated from murine bone marrow and exposed to supernatants of recEmRNASET2-producing HEK-cells. Compared to supernatants of HEK-cells transfected with the empty vector, conditioned medium did not show a significant inhibition of the LPS-induced maturation and interleukin-12 production of DCs, as described for omega-1. Moreover, a pilot experiment using the liver cell line Hep3B did not show evidence for a hepatotoxic effect of EmRNASET2. The results of this work therefore do not speak for a functional similarity of EmRNASET2 and omega-1. These observations are underlined by phylogenetic analyses, showing that EmRNASET2 clusters with a second T2-RNase from S. mansoni. Omega-1 could therefore be the result of a gene duplication event, with subsequent acquisition of its immunomodulatory functions.

Die Alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine tödliche Infektionserkrankung, die durch den parasitären Plattwurm Echinococcus multilocularis verursacht wird. Genomanalysen von E. multilocularis ergaben ein Gen, das laut Vorhersage für eine DyP-Typ Peroxidase codiere. Ziel dieser Arbeit ist die biologische Funktion des codierten Enzyms besser zu verstehen und Hinweise auf eine mögliche Rolle in der Abwehr von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu erlangen. Das Gen wurde heterolog in E. Coli exprimiert und molekulare Charakteristika des Gens mit bioinformatischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Quantitative RT-PCR Untersuchungen gaben Aufschluss über das Transkriptprofil von emipox in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von E. mulitlocularis. Mittels Whole-Mount In Situ-Hybridisierung (WMISH) wurden die Transkripte zudem lokalisiert und ihre Beziehung zum Stammzellsystem von E. multilocularis näher untersucht. Die Zugehörigkeit von EmIPOX zur Gruppe der DyP-Typ Peroxidasen wurde bestätigt. Homologe beim Menschen kommen nicht vor. Es konnte nachgewiesen werden, dass Transkripte von emipox auch, aber keinesfalls ausschließlich, in Stammzellen vorliegen. Überdurchschnittlich viele Transkripte liegen im aktivierten Protoscolex und im Metacestoden ex vivo aus einer infizierten Wirtsleber vor. Untersuchungen zur Enzymaktivität von EmIPOX zeigten neben einer Peroxidase- auch eine Katalaseaktivität. Die vorliegende Arbeit ist die erste Charakterisierung einer DyP-Typ Peroxidase bei Tieren. Sie legt nahe, dass EmIPOX eine Rolle in der Entgiftung von ROS in E. multilocularis spielt und stellt den Charakter von EmIPOX als potenzieller pharmakologischer Zielstruktur heraus. / Alveolar echinococcosis (AE) is a fatal infectious disease caused by the parasitic flatworm Echinococcus multilocularis. Genome analyses of E. multilocularis revealed a gene predicted to encode a DyP-type peroxidase. The aim of this work is to better understand the biological function of the encoded enzyme and to obtain information on a possible role in the defence against reactive oxygen species (ROS). The gene was heterologously expressed in E. Coli and molecular characteristics of the gene were investigated using bioinformatic and molecular biological methods. Quantitative RT-PCR analyses provided information on the transcript profile of emipox in different developmental stages of E. mulitlocularis. Whole-mount in situ hybridisation (WMISH) was also used to localise the transcripts and investigate their relationship to the stem cell system of E. multilocularis. The affiliation of EmIPOX to the group of DyP-type peroxidases was confirmed. There are no homologues in humans. It has been shown that transcripts of emipox are also, but by no means exclusively, present in stem cells. An above-average number of transcripts are present in the activated protoscolex and in the metacestode ex vivo from an infected host liver. Investigations into the enzyme activity of EmIPOX revealed both peroxidase and catalase activity. The present work is the first characterisation of a DyP-type peroxidase in animals. It suggests that EmIPOX plays a role in the detoxification of ROS in E. multilocularis and highlights the character of EmIPOX as a potential pharmacological target.