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O para-cresol (4-metilfenol) e as guanidinas são compostos envolvidos em uma série de processos bioquímicos e fisiológicos. Em condições normais esses compostos são eliminados do organismo pelos rins. Entretanto, em pacientes com doença renal crônica (DRC), esses compostos acumulam nos fluidos biológicos e tecidos, e são de difícil remoção, gerando alta taxa de mortalidade em pacientes humanos hemodialisados. Cromatografia gasosa (GC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são as técnicas analíticas mais utilizadas para a separação e quantificação de p-cresol e guanidinas. A derivatização pré ou pós-coluna geralmente é empregada para aumentar a volatilidade, absorbância ou fluorescência desses compostos, permitindo a detecção e quantificação. A ninidrina é um dos reagentes mais utilizados para a derivatização das guandinas pois apresenta alta sensibilidade, solubilidade em água e o procedimento aplicado para a derivatização é simples, permitindo a automação do sistema de preparo de amostras quando necessário. Embora haja vários estudos sobre a concentração e os efeitos desses compostos no sangue de pacientes humanos com DRC, a concentração de p-cresol e das guanidinas no sangue de cães com DRC e os efeitos associados a tais compostos foram pouco estudados. Assim, são necessários estudos similares aos realizados em humanos, para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento veterinário para cães. Para isso, é importante o desenvolvimento de uma metodologia analítica para a quantificação desses compostos no sangue de cães. Nesse trabalho desenvolveu-se, validou-se e aplicou-se um método para análise de p-cresol e guanidinas em plasma de cães urêmicos com detecção por fluorescência. A reação de derivatização das guanidinas com a ninidrina foi revisada, caracterizada por espectrometria de massas (MS) e otimizada utilizando planejamento fatorial. Foi analisado um total de 63 amostras de plasma de cães incluindo grupo controle e urêmico. A concentração média de guanidina, metilguanidina e p-cresol livre determinada foi maior no grupo urêmico do que no grupo controle, a exemplo do que ocorre em humanos, sugerindo um comportamento metabólico similar desses compostos em cães. O método desenvolvido possibilitou as análises, sendo relativamente simples, evitando um preparo de amostras complexo. Por sua vez, a otimização por planejamento fatorial da reação de derivatizacão com ninidrina resultou em ganhos na área dos picos cromatográficos que chegaram a 1000%. / Para-cresol (4-methylphenol) and guanidino compounds are involved in a series of biochemical and physiological cycles. Under ordinary conditions, these compounds are excreted from the body by healthy kidneys. However, in uremic patients, the concentration of these compounds is highly increased in biological fluids and tissues and is of hard removal, increasing the mortality rate in dialysis patients. Gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC) are the most used techniques for separation and quantification of p-cresol and guanidino compounds. For the guanidines determination, derivatizing reactions are usually employed to enhance the absorbance, fluorescence or volatility of these compounds, allowing the quantification. Ninhydrin is one of the most used reagents for derivatization because it shows high sensitivity and presents water solubility. The procedure employed for the derivatization reaction is simple, allowing the automation of sample preparation system, when it is required. There are few studies quantifying the concentration of guanidino compounds and p-cresol in blood of uremic dogs, therefore, a better understanding of the role of these compounds in the metabolism of dogs are needed. For this reason, it is important to develop an analytical method for the quantification of these compounds in dog\'s blood. The development of a method for simultaneous determination of these compounds, which is not reported in the literature, can improve the analytical productivity, decreasing the time spent with sample preparation and analysis. Here, a method based in reversed-phase HPLC for simultaneous quantification of guanidino compounds and free p-cresol in plasma of uremic dogs with fluorescence detection was developed, validated and applied. For this purpose, the ninhydrin derivatization reaction was reviewed, characterized by mass spectrometry (MS) and optimized using central composite design (CCD). A total of 63 samples of dog plasma, including healthy and uremic groups, were analyzed. The mean concentration of guanidine, methylguanidine and free p-cresol determined by the validated method, for the uremic group, were higher than the healthy group, alike usual for humans, suggesting a similar metabolic behavior of these compounds in dogs. The obtained method is relatively simple avoiding complex sample preparation and the experimentally designed optimization of the ninhydrin reaction by CCD yielded a gain of area as high as 1000% for the chromatographic peaks.

Cette étude a été réalisée dans le but d’obtenir une meilleure connaissance du métabolisme cérébral qui se trouve perturbé dans de nombreuses maladies neurologiques ou bien par des médicaments présentant des effets toxiques au niveau du système nerveux central. Pour cela, nous avons utilisé notre approche de métabolomique cellulaire qui combine les techniques de dosages enzymatiques et de spectroscopie RMN du carbone 13 avec des modèles mathématiques des voies métaboliques. Dans la première partie de ce travail, nous avons caractérisé le métabolisme des tranches de cerveau de rat en utilisant les principaux substrats du cerveau. Nos tranches utilisent ces différents substrats et conservent une haute capacité d’oxydation pendant la durée d’incubation. La deuxième partie présente une validation de notre modèle d’étude en testant l’effet du valproate, un médicament antiépileptique très utilisé. Nous montrons, non seulement une augmentation de l’accumulation du GABA et une diminution de celle de l’aspartate dues au valproate, mais aussi une perturbation des flux à travers différentes enzymes du métabolisme du cerveau. Dans la troisième partie, nous avons recherché les effets des composés guanidiniques sur le métabolisme cérébral ; ces composés augmentent l’utilisation de glucose et l’accumulation de lactate par les tranches de cerveau de rat. Nos tranches représentent donc un bon modèle pour les études métaboliques in vitro et notre approche permet d’obtenir une vision d'ensemble du devenir métabolique d'un substrat donné et d'identifier les voies métaboliques impliquées en mesurant les flux enzymatiques en absence et en présence d'un agent pharmacologique ou toxicologique / This study was conducted to obtain a better knowledge of brain metabolism which is altered in many neurological diseases or by drugs with toxic effects on the central nervous system. For this purpose, we used our cellular metabolomic approach that combines enzymatic and carbon 13 NMR measurements with mathematical modeling of metabolic pathways. In the first part of this work, we characterized the metabolism of rat brain slices by using the main substrates of the brain. Our slices metabolized and oxidized these substrates at high rates during the incubation period. The second part presents a validation of our model of study by testing the effect of valproate, a widely used antiepileptic drug. We showed that valproate not only increases the accumulation of GABA and decreases that of aspartate, but also alters fluxes through several enzymes involved in brain metabolism. In the third part, we investigated the effects of guanidino compounds on cerebral metabolism; these compounds increase glucose consumption and lactate accumulation by rat brain slices. Thus, our slices are a good model for metabolic studies in vitro and our approach provides an overview of the metabolic fate of a given substrate and allows to identify the metabolic pathways involved by measuring enzymatic fluxes in the absence and the presence of a pharmacological or toxicological agents

O para-cresol (4-metilfenol) e as guanidinas são compostos envolvidos em uma série de processos bioquímicos e fisiológicos. Em condições normais esses compostos são eliminados do organismo pelos rins. Entretanto, em pacientes com doença renal crônica (DRC), esses compostos acumulam nos fluidos biológicos e tecidos, e são de difícil remoção, gerando alta taxa de mortalidade em pacientes humanos hemodialisados. Cromatografia gasosa (GC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são as técnicas analíticas mais utilizadas para a separação e quantificação de p-cresol e guanidinas. A derivatização pré ou pós-coluna geralmente é empregada para aumentar a volatilidade, absorbância ou fluorescência desses compostos, permitindo a detecção e quantificação. A ninidrina é um dos reagentes mais utilizados para a derivatização das guandinas pois apresenta alta sensibilidade, solubilidade em água e o procedimento aplicado para a derivatização é simples, permitindo a automação do sistema de preparo de amostras quando necessário. Embora haja vários estudos sobre a concentração e os efeitos desses compostos no sangue de pacientes humanos com DRC, a concentração de p-cresol e das guanidinas no sangue de cães com DRC e os efeitos associados a tais compostos foram pouco estudados. Assim, são necessários estudos similares aos realizados em humanos, para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento veterinário para cães. Para isso, é importante o desenvolvimento de uma metodologia analítica para a quantificação desses compostos no sangue de cães. Nesse trabalho desenvolveu-se, validou-se e aplicou-se um método para análise de p-cresol e guanidinas em plasma de cães urêmicos com detecção por fluorescência. A reação de derivatização das guanidinas com a ninidrina foi revisada, caracterizada por espectrometria de massas (MS) e otimizada utilizando planejamento fatorial. Foi analisado um total de 63 amostras de plasma de cães incluindo grupo controle e urêmico. A concentração média de guanidina, metilguanidina e p-cresol livre determinada foi maior no grupo urêmico do que no grupo controle, a exemplo do que ocorre em humanos, sugerindo um comportamento metabólico similar desses compostos em cães. O método desenvolvido possibilitou as análises, sendo relativamente simples, evitando um preparo de amostras complexo. Por sua vez, a otimização por planejamento fatorial da reação de derivatizacão com ninidrina resultou em ganhos na área dos picos cromatográficos que chegaram a 1000%. / Para-cresol (4-methylphenol) and guanidino compounds are involved in a series of biochemical and physiological cycles. Under ordinary conditions, these compounds are excreted from the body by healthy kidneys. However, in uremic patients, the concentration of these compounds is highly increased in biological fluids and tissues and is of hard removal, increasing the mortality rate in dialysis patients. Gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC) are the most used techniques for separation and quantification of p-cresol and guanidino compounds. For the guanidines determination, derivatizing reactions are usually employed to enhance the absorbance, fluorescence or volatility of these compounds, allowing the quantification. Ninhydrin is one of the most used reagents for derivatization because it shows high sensitivity and presents water solubility. The procedure employed for the derivatization reaction is simple, allowing the automation of sample preparation system, when it is required. There are few studies quantifying the concentration of guanidino compounds and p-cresol in blood of uremic dogs, therefore, a better understanding of the role of these compounds in the metabolism of dogs are needed. For this reason, it is important to develop an analytical method for the quantification of these compounds in dog\'s blood. The development of a method for simultaneous determination of these compounds, which is not reported in the literature, can improve the analytical productivity, decreasing the time spent with sample preparation and analysis. Here, a method based in reversed-phase HPLC for simultaneous quantification of guanidino compounds and free p-cresol in plasma of uremic dogs with fluorescence detection was developed, validated and applied. For this purpose, the ninhydrin derivatization reaction was reviewed, characterized by mass spectrometry (MS) and optimized using central composite design (CCD). A total of 63 samples of dog plasma, including healthy and uremic groups, were analyzed. The mean concentration of guanidine, methylguanidine and free p-cresol determined by the validated method, for the uremic group, were higher than the healthy group, alike usual for humans, suggesting a similar metabolic behavior of these compounds in dogs. The obtained method is relatively simple avoiding complex sample preparation and the experimentally designed optimization of the ninhydrin reaction by CCD yielded a gain of area as high as 1000% for the chromatographic peaks.