O para-cresol (4-metilfenol) e as guanidinas são compostos envolvidos em uma série de processos bioquímicos e fisiológicos. Em condições normais esses compostos são eliminados do organismo pelos rins. Entretanto, em pacientes com doença renal crônica (DRC), esses compostos acumulam nos fluidos biológicos e tecidos, e são de difícil remoção, gerando alta taxa de mortalidade em pacientes humanos hemodialisados. Cromatografia gasosa (GC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são as técnicas analíticas mais utilizadas para a separação e quantificação de p-cresol e guanidinas. A derivatização pré ou pós-coluna geralmente é empregada para aumentar a volatilidade, absorbância ou fluorescência desses compostos, permitindo a detecção e quantificação. A ninidrina é um dos reagentes mais utilizados para a derivatização das guandinas pois apresenta alta sensibilidade, solubilidade em água e o procedimento aplicado para a derivatização é simples, permitindo a automação do sistema de preparo de amostras quando necessário. Embora haja vários estudos sobre a concentração e os efeitos desses compostos no sangue de pacientes humanos com DRC, a concentração de p-cresol e das guanidinas no sangue de cães com DRC e os efeitos associados a tais compostos foram pouco estudados. Assim, são necessários estudos similares aos realizados em humanos, para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento veterinário para cães. Para isso, é importante o desenvolvimento de uma metodologia analítica para a quantificação desses compostos no sangue de cães. Nesse trabalho desenvolveu-se, validou-se e aplicou-se um método para análise de p-cresol e guanidinas em plasma de cães urêmicos com detecção por fluorescência. A reação de derivatização das guanidinas com a ninidrina foi revisada, caracterizada por espectrometria de massas (MS) e otimizada utilizando planejamento fatorial. Foi analisado um total de 63 amostras de plasma de cães incluindo grupo controle e urêmico. A concentração média de guanidina, metilguanidina e p-cresol livre determinada foi maior no grupo urêmico do que no grupo controle, a exemplo do que ocorre em humanos, sugerindo um comportamento metabólico similar desses compostos em cães. O método desenvolvido possibilitou as análises, sendo relativamente simples, evitando um preparo de amostras complexo. Por sua vez, a otimização por planejamento fatorial da reação de derivatizacão com ninidrina resultou em ganhos na área dos picos cromatográficos que chegaram a 1000%. / Para-cresol (4-methylphenol) and guanidino compounds are involved in a series of biochemical and physiological cycles. Under ordinary conditions, these compounds are excreted from the body by healthy kidneys. However, in uremic patients, the concentration of these compounds is highly increased in biological fluids and tissues and is of hard removal, increasing the mortality rate in dialysis patients. Gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC) are the most used techniques for separation and quantification of p-cresol and guanidino compounds. For the guanidines determination, derivatizing reactions are usually employed to enhance the absorbance, fluorescence or volatility of these compounds, allowing the quantification. Ninhydrin is one of the most used reagents for derivatization because it shows high sensitivity and presents water solubility. The procedure employed for the derivatization reaction is simple, allowing the automation of sample preparation system, when it is required. There are few studies quantifying the concentration of guanidino compounds and p-cresol in blood of uremic dogs, therefore, a better understanding of the role of these compounds in the metabolism of dogs are needed. For this reason, it is important to develop an analytical method for the quantification of these compounds in dog\'s blood. The development of a method for simultaneous determination of these compounds, which is not reported in the literature, can improve the analytical productivity, decreasing the time spent with sample preparation and analysis. Here, a method based in reversed-phase HPLC for simultaneous quantification of guanidino compounds and free p-cresol in plasma of uremic dogs with fluorescence detection was developed, validated and applied. For this purpose, the ninhydrin derivatization reaction was reviewed, characterized by mass spectrometry (MS) and optimized using central composite design (CCD). A total of 63 samples of dog plasma, including healthy and uremic groups, were analyzed. The mean concentration of guanidine, methylguanidine and free p-cresol determined by the validated method, for the uremic group, were higher than the healthy group, alike usual for humans, suggesting a similar metabolic behavior of these compounds in dogs. The obtained method is relatively simple avoiding complex sample preparation and the experimentally designed optimization of the ninhydrin reaction by CCD yielded a gain of area as high as 1000% for the chromatographic peaks.

O para-cresol (4-metilfenol) e as guanidinas são compostos envolvidos em uma série de processos bioquímicos e fisiológicos. Em condições normais esses compostos são eliminados do organismo pelos rins. Entretanto, em pacientes com doença renal crônica (DRC), esses compostos acumulam nos fluidos biológicos e tecidos, e são de difícil remoção, gerando alta taxa de mortalidade em pacientes humanos hemodialisados. Cromatografia gasosa (GC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são as técnicas analíticas mais utilizadas para a separação e quantificação de p-cresol e guanidinas. A derivatização pré ou pós-coluna geralmente é empregada para aumentar a volatilidade, absorbância ou fluorescência desses compostos, permitindo a detecção e quantificação. A ninidrina é um dos reagentes mais utilizados para a derivatização das guandinas pois apresenta alta sensibilidade, solubilidade em água e o procedimento aplicado para a derivatização é simples, permitindo a automação do sistema de preparo de amostras quando necessário. Embora haja vários estudos sobre a concentração e os efeitos desses compostos no sangue de pacientes humanos com DRC, a concentração de p-cresol e das guanidinas no sangue de cães com DRC e os efeitos associados a tais compostos foram pouco estudados. Assim, são necessários estudos similares aos realizados em humanos, para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento veterinário para cães. Para isso, é importante o desenvolvimento de uma metodologia analítica para a quantificação desses compostos no sangue de cães. Nesse trabalho desenvolveu-se, validou-se e aplicou-se um método para análise de p-cresol e guanidinas em plasma de cães urêmicos com detecção por fluorescência. A reação de derivatização das guanidinas com a ninidrina foi revisada, caracterizada por espectrometria de massas (MS) e otimizada utilizando planejamento fatorial. Foi analisado um total de 63 amostras de plasma de cães incluindo grupo controle e urêmico. A concentração média de guanidina, metilguanidina e p-cresol livre determinada foi maior no grupo urêmico do que no grupo controle, a exemplo do que ocorre em humanos, sugerindo um comportamento metabólico similar desses compostos em cães. O método desenvolvido possibilitou as análises, sendo relativamente simples, evitando um preparo de amostras complexo. Por sua vez, a otimização por planejamento fatorial da reação de derivatizacão com ninidrina resultou em ganhos na área dos picos cromatográficos que chegaram a 1000%. / Para-cresol (4-methylphenol) and guanidino compounds are involved in a series of biochemical and physiological cycles. Under ordinary conditions, these compounds are excreted from the body by healthy kidneys. However, in uremic patients, the concentration of these compounds is highly increased in biological fluids and tissues and is of hard removal, increasing the mortality rate in dialysis patients. Gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC) are the most used techniques for separation and quantification of p-cresol and guanidino compounds. For the guanidines determination, derivatizing reactions are usually employed to enhance the absorbance, fluorescence or volatility of these compounds, allowing the quantification. Ninhydrin is one of the most used reagents for derivatization because it shows high sensitivity and presents water solubility. The procedure employed for the derivatization reaction is simple, allowing the automation of sample preparation system, when it is required. There are few studies quantifying the concentration of guanidino compounds and p-cresol in blood of uremic dogs, therefore, a better understanding of the role of these compounds in the metabolism of dogs are needed. For this reason, it is important to develop an analytical method for the quantification of these compounds in dog\'s blood. The development of a method for simultaneous determination of these compounds, which is not reported in the literature, can improve the analytical productivity, decreasing the time spent with sample preparation and analysis. Here, a method based in reversed-phase HPLC for simultaneous quantification of guanidino compounds and free p-cresol in plasma of uremic dogs with fluorescence detection was developed, validated and applied. For this purpose, the ninhydrin derivatization reaction was reviewed, characterized by mass spectrometry (MS) and optimized using central composite design (CCD). A total of 63 samples of dog plasma, including healthy and uremic groups, were analyzed. The mean concentration of guanidine, methylguanidine and free p-cresol determined by the validated method, for the uremic group, were higher than the healthy group, alike usual for humans, suggesting a similar metabolic behavior of these compounds in dogs. The obtained method is relatively simple avoiding complex sample preparation and the experimentally designed optimization of the ninhydrin reaction by CCD yielded a gain of area as high as 1000% for the chromatographic peaks.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriana Rute Cordeiro.pdf: 1697344 bytes, checksum: c49bee8f561162a88549115390df463d (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed to develop methods for obtaining extracts for the isolation and chemical analysis of propolis using two samples from the region known as “Campos Gerais do Paraná”. One of the studied propolis samples was produced in the district of Ipiranga and another in the municipality of Ponta Grossa. The utilized general fractionation method allowed obtaining from the same sample the essential oils and then the aqueous extracts and various organic fractions containing chemical components of several polarities. The analyses of the essential oils showed that both samples of propolis contain several components found in Baccharis dracunculifolia, known as vassoura or alecrim do campo, indicating that these are similar to those of green propolis produced in southeastern Brazil. The analyses also demonstrated the presence of phenol compounds such as flavonoids and caffeoylquinic acids, pointing once again that the botanical origin of both propolis includes the alecrim do campo. The analyses of essential oils originating from Ipiranga propolis sample indicated spathulenol and (E)-nerolidol as the main components, while the one acquired in Ponta Grossa showed high proportions of two substances containing aromatic rings in their structures, 2,6-di-t-butyl-p-cresol and benzyl benzoate. The two sesquiterpene alcohols spathulenol and (E)-nerolidol are commonly found in essential oils from B. dracunculifolia and appear in propolis from Ponta Grossa in low percentages, while the two mentioned aromatic compounds are not commonly found in the genus Baccharis. The various analyses of extracts and isolates showed that two aromatic acids may be considered as marker substances for both samples of propolis. The para-hydroxycinnamic acid seemed to be characteristic of propolis from Ipiranga, while the benzoic acid could be considered typical of the sample from Ponta Grossa. Atomic absorption spectrometry analyses that were conducted with both studied propolis did not indicate neither high levels of essential minerals nor the presence of heavy metals, and this fact represents a guarantee that producers have been working in clean environments. / Este estudo buscou desenvolver métodos para a obtenção de extratos destinados ao isolamento e análises químicas de própolis utilizando duas amostras provenientes da Região dos Campos Gerais do Paraná. Uma das amostras de própolis estudadas foi produzida no município de Ipiranga e a outra no município de Ponta Grossa. O método geral de fracionamento utilizado permitiu obter, de uma mesma amostra, os óleos essenciais e em seguida o extrato aquoso e diversos extratos orgânicos contendo substâncias de várias polaridades. As análises dos óleos essenciais demonstraram que ambas as amostras de própolis contém vários componentes também presentes na espécie vegetal Baccharis dracunculifolia, conhecida como vassoura ou alecrim do campo, indicando tratar-se da chamada própolis verde, similares às produzidas na região sudeste do Brasil. As análises também demonstraram a presença de substâncias fenólicas, tanto flavonoides como ácidos cafeoilquínicos, reforçando que a origem botânica das própolis analisadas inclui o alecrim dos campos. As análises de óleos essenciais da amostra de Ipiranga indicaram como componentes principais o espatulenol e o (E)-nerolidol, enquanto que as de Ponta Grossa apresentaram altas proporções de duas substâncias contendo anéis aromáticos em suas estruturas, o 2,6-di-t-butil-p-cresol e o benzilbenzoato. Os dois álcoois sesquiterpênicos espatulenol e (E)-nerolidol são encontrados comumente em óleos essenciais de B. dracunculifolia e aparecem na própolis de Ponta Grossa em baixas porcentagens, enquanto que os dois mencionados compostos aromáticos não são tão comuns em espécies do gênero Baccharis. As diversas análises de extratos e isolamentos demonstraram que dois ácidos aromáticos podem ser considerados como substâncias marcadoras das duas amostras de própolis analisadas. O ácido para-hidroxicinâmico mostrou-se característico da própolis de Ipiranga, enquanto que o ácido benzóico pode ser considerado típico da amostra de Ponta Grossa. As análises por espectrometria de absorção atômica que foram conduzidas com ambas as própolis estudadas não indicaram níveis elevados de metais e nem a presença de metais pesados inconvenientes, sendo mais uma garantia de que os produtores estão trabalhando em ambientes limpos quanto a este aspecto.