Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-17T20:42:43Z No. of bitstreams: 1 Gabriela Gomes Cardoso Rodrigues.pdf: 623885 bytes, checksum: 3da3d1230fd77beffc9c12f00be889bb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T20:42:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabriela Gomes Cardoso Rodrigues.pdf: 623885 bytes, checksum: 3da3d1230fd77beffc9c12f00be889bb (MD5) Previous issue date: 2015-02-04 / Chronic kidney disease (CKD) is characterized by progressive and irreversible loss of renal function and often progresses with a muscular weakness, whose set of signs and symptoms is generally referred to as uremic myopathy. Possible risk factors for the uremic myopathy are the uremic toxins. Among uremic toxins, indoxyl sulfate (IS) is a derivative of tryptophan metabolism by intestinal bacteria. Because skeletal muscle tissue undergo constant remodeling due differentiation of myoblasts in myotubes, it is possible that uremic toxins have a deleterious effect to influence this process, exacerbating the uremic myopathy. Low level laser therapy (LLLT) is regarded as a growth promoter feature widely used in the treatment of chronic diseases and has shown positive effects on the modulation of skeletal muscle repair process and also in the process of inflammation. However, in the context of CKD, the LLLT has not yet been explored. The aim of this study was to evaluate the effects of the IS on cell viability and on oxidative stress on cellular differentiation in cultured C2C12 myoblasts. In addition, to verify the action of the LLLT as a protective alternative to the cells. The C2C12 myoblasts were cultured in DMEM culture medium containing 10% fetal bovine serum and were induced to differentiation process by adding 2% horse serum. Three different IS concentrations were used to mimic the plasma concentrations of normal individual, CKD patients with moderate uremia and CKD patients with advanced uremia (0.6 mg/l and 53 mg/l and 236 mg/l, respectively), at different times of incubation (24 h, 48 h and 72 h). Subsequently, the cells were subjected to treatment with LLLT GaAlAs 780 nm (output power 10 mW, 20 seconds application time and energy density of 0.5 J / cm2). In terms of analysis, we used MTT method to assess the viability of the cells, flow cytometry to assess the viability/cell death and oxidative stress, nitrite dosing to evaluate nitric oxide production and real-time PCR to analyze IL-6, myogenin and MyoD expression (inflammation and cell differentiation markers). The results demonstrate that the IS at the maximum concentration was toxic to C2C12 cells, because it significantly decreased cell viability by MTT and by flow cytometry and by increasing the percentage of necrosis. This effect was present throughout the three incubation periods. With respect to oxidative stress, was not any conclusion, probably by the time the samples, but do not rule out the possibility of IS induce this type of stress. Although the IS has induced death to C2C12 cells, the remaining had no change in cell differentiation markers. Treatment with BPL the IS sensitized cells, reducing cell viability. We conclude that the IS acts directly on C2C12 myoblasts with toxic effect and may be the one factor responsible for uremic myopathy. Treatment with LLLT was not effective in protecting the cells. / A doença renal crônica (DRC) é caracterizada pela perda progressiva e irreversível da função renal e que frequentemente cursa com um quadro de fraqueza muscular, cujo conjunto de sinais e sintomas é globalmente designado como miopatia urêmica. Possíveis fatores predisponentes para a miopatia urêmica são as toxinas urêmicas. Dentre as toxinas urêmicas, o indoxil sulfato (IS) é uma derivada do metabolismo do triptofano presente em bactérias intestinais. Devido ao fato do tecido muscular esquelético sofrer constante remodelação graças à diferenciação de mioblastos em miotubos, é possível que toxinas urêmicas tenham um efeito deletério por influenciar este processo, agravando a miopatia urêmica. A terapia a laser de baixa potência (LBP) é considerada como um recurso bioestimulante amplamente utilizado no tratamento de doenças crônicas e tem demonstrado efeitos positivos sobre a modulação do processo de reparo muscular esquelético e também no processo da inflamação. Entretanto, no contexto de DRC, o LBP não foi ainda explorado. O objetivo do presente estudo foi avaliar dos efeitos do IS sobre a viabilidade celular, sobre o estresse oxidativo e sobre a diferenciação celular em cultura de mioblastos C2C12. Além disso, verificar a ação do LBP como forma de proteção às células. Os mioblastos C2C12 foram cultivados em meio de cultura de DMEM, contendo 10% de soro fetal bovino e foram induzidos ao processo de diferenciação por meio da adição de 2% soro de cavalo. Três diferentes concentrações de IS foram usadas para mimetizar as concentrações plasmáticas de indivíduo normal, paciente DRC com uremia moderada e paciente DRC com uremia avançada (0,6 mg/l; 53 mg/l e 236 mg/l, respectivamente), em diferentes períodos de incubação (24 h, 48 h e 72 h). Posteriormente, as células foram submetidas ao tratamento com laser de baixa potência AsGaAl 780 nm (potência de saída de 10 mW, tempo de aplicação de 20 segundos e densidade de energia de 0,5 J/cm2). Como análise, foi utilizado o método MTT para acessar a viabilidade das células, citometria de fluxo para avaliar a viabilidade/mortalidade das células, bem como o estresse oxidativo, dosagem de nitrito para avaliar a produção de óxido nítrico e PCR em tempo real para analisar a expressão de IL-6, miogenina e MyoD (marcadores de inflamação e diferenciação celular). Os resultados demonstram que o IS na concentração máxima foi tóxico para as células C2C12, pois diminuiu significativamente a viabilidade das células, tanto por MTT como por citometria de fluxo, aumentando a porcentagem de necrose. Este efeito foi presente nos três períodos de incubação. Com relação ao estresse oxidativo, não foi possível nenhuma conclusão, provavelmente pelo tempo das amostras , porém não descartamos a possibilidade do IS induzir este tipo de estresse. Embora o IS tenha induzido morte às células C2C12, as remanescentes não tiveram alteração dos marcadores de diferenciação celular. O tratamento com LBP sensibilizou as células ao IS, diminuindo a viabilidade das células. Concluímos que o IS age diretamente sobre mioblastos C2C12 com efeito tóxico, podendo ser um dos responsáveis pela miopatia urêmica. O tratamento com LBP não foi eficiente na indução de proteção às células.

O para-cresol (4-metilfenol) e as guanidinas são compostos envolvidos em uma série de processos bioquímicos e fisiológicos. Em condições normais esses compostos são eliminados do organismo pelos rins. Entretanto, em pacientes com doença renal crônica (DRC), esses compostos acumulam nos fluidos biológicos e tecidos, e são de difícil remoção, gerando alta taxa de mortalidade em pacientes humanos hemodialisados. Cromatografia gasosa (GC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são as técnicas analíticas mais utilizadas para a separação e quantificação de p-cresol e guanidinas. A derivatização pré ou pós-coluna geralmente é empregada para aumentar a volatilidade, absorbância ou fluorescência desses compostos, permitindo a detecção e quantificação. A ninidrina é um dos reagentes mais utilizados para a derivatização das guandinas pois apresenta alta sensibilidade, solubilidade em água e o procedimento aplicado para a derivatização é simples, permitindo a automação do sistema de preparo de amostras quando necessário. Embora haja vários estudos sobre a concentração e os efeitos desses compostos no sangue de pacientes humanos com DRC, a concentração de p-cresol e das guanidinas no sangue de cães com DRC e os efeitos associados a tais compostos foram pouco estudados. Assim, são necessários estudos similares aos realizados em humanos, para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento veterinário para cães. Para isso, é importante o desenvolvimento de uma metodologia analítica para a quantificação desses compostos no sangue de cães. Nesse trabalho desenvolveu-se, validou-se e aplicou-se um método para análise de p-cresol e guanidinas em plasma de cães urêmicos com detecção por fluorescência. A reação de derivatização das guanidinas com a ninidrina foi revisada, caracterizada por espectrometria de massas (MS) e otimizada utilizando planejamento fatorial. Foi analisado um total de 63 amostras de plasma de cães incluindo grupo controle e urêmico. A concentração média de guanidina, metilguanidina e p-cresol livre determinada foi maior no grupo urêmico do que no grupo controle, a exemplo do que ocorre em humanos, sugerindo um comportamento metabólico similar desses compostos em cães. O método desenvolvido possibilitou as análises, sendo relativamente simples, evitando um preparo de amostras complexo. Por sua vez, a otimização por planejamento fatorial da reação de derivatizacão com ninidrina resultou em ganhos na área dos picos cromatográficos que chegaram a 1000%. / Para-cresol (4-methylphenol) and guanidino compounds are involved in a series of biochemical and physiological cycles. Under ordinary conditions, these compounds are excreted from the body by healthy kidneys. However, in uremic patients, the concentration of these compounds is highly increased in biological fluids and tissues and is of hard removal, increasing the mortality rate in dialysis patients. Gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC) are the most used techniques for separation and quantification of p-cresol and guanidino compounds. For the guanidines determination, derivatizing reactions are usually employed to enhance the absorbance, fluorescence or volatility of these compounds, allowing the quantification. Ninhydrin is one of the most used reagents for derivatization because it shows high sensitivity and presents water solubility. The procedure employed for the derivatization reaction is simple, allowing the automation of sample preparation system, when it is required. There are few studies quantifying the concentration of guanidino compounds and p-cresol in blood of uremic dogs, therefore, a better understanding of the role of these compounds in the metabolism of dogs are needed. For this reason, it is important to develop an analytical method for the quantification of these compounds in dog\'s blood. The development of a method for simultaneous determination of these compounds, which is not reported in the literature, can improve the analytical productivity, decreasing the time spent with sample preparation and analysis. Here, a method based in reversed-phase HPLC for simultaneous quantification of guanidino compounds and free p-cresol in plasma of uremic dogs with fluorescence detection was developed, validated and applied. For this purpose, the ninhydrin derivatization reaction was reviewed, characterized by mass spectrometry (MS) and optimized using central composite design (CCD). A total of 63 samples of dog plasma, including healthy and uremic groups, were analyzed. The mean concentration of guanidine, methylguanidine and free p-cresol determined by the validated method, for the uremic group, were higher than the healthy group, alike usual for humans, suggesting a similar metabolic behavior of these compounds in dogs. The obtained method is relatively simple avoiding complex sample preparation and the experimentally designed optimization of the ninhydrin reaction by CCD yielded a gain of area as high as 1000% for the chromatographic peaks.

O para-cresol (4-metilfenol) e as guanidinas são compostos envolvidos em uma série de processos bioquímicos e fisiológicos. Em condições normais esses compostos são eliminados do organismo pelos rins. Entretanto, em pacientes com doença renal crônica (DRC), esses compostos acumulam nos fluidos biológicos e tecidos, e são de difícil remoção, gerando alta taxa de mortalidade em pacientes humanos hemodialisados. Cromatografia gasosa (GC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são as técnicas analíticas mais utilizadas para a separação e quantificação de p-cresol e guanidinas. A derivatização pré ou pós-coluna geralmente é empregada para aumentar a volatilidade, absorbância ou fluorescência desses compostos, permitindo a detecção e quantificação. A ninidrina é um dos reagentes mais utilizados para a derivatização das guandinas pois apresenta alta sensibilidade, solubilidade em água e o procedimento aplicado para a derivatização é simples, permitindo a automação do sistema de preparo de amostras quando necessário. Embora haja vários estudos sobre a concentração e os efeitos desses compostos no sangue de pacientes humanos com DRC, a concentração de p-cresol e das guanidinas no sangue de cães com DRC e os efeitos associados a tais compostos foram pouco estudados. Assim, são necessários estudos similares aos realizados em humanos, para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento veterinário para cães. Para isso, é importante o desenvolvimento de uma metodologia analítica para a quantificação desses compostos no sangue de cães. Nesse trabalho desenvolveu-se, validou-se e aplicou-se um método para análise de p-cresol e guanidinas em plasma de cães urêmicos com detecção por fluorescência. A reação de derivatização das guanidinas com a ninidrina foi revisada, caracterizada por espectrometria de massas (MS) e otimizada utilizando planejamento fatorial. Foi analisado um total de 63 amostras de plasma de cães incluindo grupo controle e urêmico. A concentração média de guanidina, metilguanidina e p-cresol livre determinada foi maior no grupo urêmico do que no grupo controle, a exemplo do que ocorre em humanos, sugerindo um comportamento metabólico similar desses compostos em cães. O método desenvolvido possibilitou as análises, sendo relativamente simples, evitando um preparo de amostras complexo. Por sua vez, a otimização por planejamento fatorial da reação de derivatizacão com ninidrina resultou em ganhos na área dos picos cromatográficos que chegaram a 1000%. / Para-cresol (4-methylphenol) and guanidino compounds are involved in a series of biochemical and physiological cycles. Under ordinary conditions, these compounds are excreted from the body by healthy kidneys. However, in uremic patients, the concentration of these compounds is highly increased in biological fluids and tissues and is of hard removal, increasing the mortality rate in dialysis patients. Gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC) are the most used techniques for separation and quantification of p-cresol and guanidino compounds. For the guanidines determination, derivatizing reactions are usually employed to enhance the absorbance, fluorescence or volatility of these compounds, allowing the quantification. Ninhydrin is one of the most used reagents for derivatization because it shows high sensitivity and presents water solubility. The procedure employed for the derivatization reaction is simple, allowing the automation of sample preparation system, when it is required. There are few studies quantifying the concentration of guanidino compounds and p-cresol in blood of uremic dogs, therefore, a better understanding of the role of these compounds in the metabolism of dogs are needed. For this reason, it is important to develop an analytical method for the quantification of these compounds in dog\'s blood. The development of a method for simultaneous determination of these compounds, which is not reported in the literature, can improve the analytical productivity, decreasing the time spent with sample preparation and analysis. Here, a method based in reversed-phase HPLC for simultaneous quantification of guanidino compounds and free p-cresol in plasma of uremic dogs with fluorescence detection was developed, validated and applied. For this purpose, the ninhydrin derivatization reaction was reviewed, characterized by mass spectrometry (MS) and optimized using central composite design (CCD). A total of 63 samples of dog plasma, including healthy and uremic groups, were analyzed. The mean concentration of guanidine, methylguanidine and free p-cresol determined by the validated method, for the uremic group, were higher than the healthy group, alike usual for humans, suggesting a similar metabolic behavior of these compounds in dogs. The obtained method is relatively simple avoiding complex sample preparation and the experimentally designed optimization of the ninhydrin reaction by CCD yielded a gain of area as high as 1000% for the chromatographic peaks.